專利名稱：抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于口蹄疫防治技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病感染率高，感染后發(fā)病率最高可達100%，易感動物多達70余種，其中重要的經(jīng)濟畜種如豬、牛、羊等均易感。鑒于FMD不僅降低動物生產(chǎn)性能，造成巨大的直接經(jīng)濟損失，而且還影響動物及動物產(chǎn)品的國際貿(mào)易，因此所造成的間接損失更大，同時還會影響一個國家的國際形象，故素有“政治經(jīng)濟病”之稱。各國學(xué)者對FMDV進行了廣泛而又深入的研究。FMDV屬小RNA病毒科 (Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)成員。該病毒有7個血清型，分別為A型、 0型、C型、Asia I型、SAT I型、SAT II型和SAT III型，且血清型間無血清交叉反應(yīng)和交叉免疫現(xiàn)象。各血清型又根據(jù)抗原親緣關(guān)系分為不同的亞型，其亞型間抗原也有很大的差
已目前，F(xiàn)MD是嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展的重要傳染病，發(fā)達國家主要采取撲殺為主的防控措施，發(fā)展中國家主要采取疫苗接種和撲殺相結(jié)合的方法。但是疫苗接種后需要至少七天的時間才能產(chǎn)生保護作用，同時由于FMDV血清型多，各血清型之間幾乎沒有交叉保護性，所以現(xiàn)在應(yīng)用的單血清型疫苗難以達到對不同血清型和亞型的變異毒株產(chǎn)生保護作用。RNA干擾(RNA interference, RNAi)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為疾病防控開啟了希望之門。RNA 干擾(RNA interference, RNAi)是由功能性雙鏈 RNA(double-stranded RNA, dsRNA)引發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后同源靶基因沉默現(xiàn)象，是近幾年迅速發(fā)展起來的一項用于抑制病毒復(fù)制的新技術(shù)。科研人員將RNAi技術(shù)應(yīng)用于多種病毒性疾病的治療研究，如艾滋病病毒、 乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、禽流感病毒等；RNAi技術(shù)也為抗 FMDV感染方面的研究提供了新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑。本發(fā)明的另一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法。本發(fā)明的再一目的在于提供所述抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，活性成分為siRNA-VPl和siRNA-2B ；
SiRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC ；反義鏈為(5’-3’)GGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC ；siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)CCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGC ；反義鏈為(5’-3’)GCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGG ；以上序列的小寫部分為莖環(huán)結(jié)構(gòu)，粗體部分和斜體部分互補，以以上序列為模板， 轉(zhuǎn)錄得到的siRNA為具有l(wèi)oop結(jié)構(gòu)的dsRNA ；所述的siRNA-VPl和siRNA_2B是將其轉(zhuǎn)錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入載體制備得到；所述的載體優(yōu)選為人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X ；所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，更優(yōu)選為重組腺病毒rAden0-2B-VP 1 ；所述的重組腺病毒rAden0-2B-VPl通過如下方法制備得到是將siRNA_VPl的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X，得到能分別轉(zhuǎn)錄、串聯(lián)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒；接著通過包裝細(xì)胞包裝，得到該重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，優(yōu)選包含以下步驟(1)將如下所示的siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA_2B的轉(zhuǎn)錄模板分別克隆入PSIREN-shuttle穿梭載體，位于TO啟動子的下游，得到重組質(zhì)粒Paiuttle-2B和 pShuttIe-VPl ；siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；反義鏈為(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為(5，-3，)GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；反義鏈為(5，-3，)AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；正義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位點粘性末端，反義鏈寡核苷酸的 5’端突出部分是EcoRI酶切位點粘性末端，加粗部分為siRNA正義鏈，斜體部分為siRNA的反向互補鏈，小寫字體為loop環(huán)序列，下劃線部分為7個連續(xù)T終止信號及其互補序列；(2)分別通過 PHce I/I-Ceu I 雙酶切重組質(zhì)粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通過體外連接法分別將目的片段與人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體 pAdeno-X 連接，得到重組質(zhì)粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)將重組質(zhì)粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分別線性化后，通過包裝細(xì)胞包裝，得到重組腺病毒Adeno-2B和Adeno-VPl ；該重組腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即為抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，使用時將其接種到動物體身上即可；所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，更優(yōu)選包含以下步驟(1)以前述得到重組質(zhì)粒pShuttle_2B和pShuttle_VPl為模板，通過PCR分別得到U6啟動子+2B融合片段和U6啟動子+VPl融合片段，再將這兩個融合片段串聯(lián)，克隆入克隆載體上，得到串聯(lián)結(jié)構(gòu)、能分別獨立轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒P-2B-VP1 ；(2)通過體外連接法將PI-Sce I/I-Ceu I雙酶切重組質(zhì)粒P_2B_VP1得到的目的片段與人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)將重組質(zhì)粒pAden0-2B-VPl線性化后，通過包裝細(xì)胞包裝，得到重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；該重組腺病毒Aden0-2B-VPl即為抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，使用時將其接種到動物體身上即可；所述的克隆載體優(yōu)選為pMD19-T simple載體；所述的包裝細(xì)胞優(yōu)選為人胚腎細(xì)胞株HEK293 ；所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑在制備抗口蹄疫病毒制劑中的應(yīng)用。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果本發(fā)明提供的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑能有抑制口蹄疫病毒復(fù)制和抗口蹄疫病感染。通過實驗證實，重組腺病毒rAden0-2B-VPl的防治效果優(yōu)于重組腺病毒 r Adeno-2B和rAdeno-VPl分別單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用的效果。


圖1是篩選重組腺病毒質(zhì)粒pAden0-2B-VPl進行的菌落PCR鑒定電泳圖；其中，泳道1 9為被篩選的菌落；泳道10為陰性對照；泳道M為DNA Marker DL15000。圖2是重組腺病毒質(zhì)粒pAden0-2B-VPl的I^acI酶切鑒定電泳圖；其中，泳道 Ml為DNA Marker DL2000 ；泳道M2為DNA Marker DL15000 ；泳道1為重組腺病毒質(zhì)粒 pAdeno-2B-VPl PacI 酶切產(chǎn)物。圖3是不同時間點上清中FMDV滴度的測定圖。圖4是不同時間細(xì)胞上清液中FMDV滴度測定圖。圖5是各試驗組不同時間細(xì)胞上清液中FMDV拷貝數(shù)檢測圖。圖6是重組腺病毒感染量與豚鼠保護率的關(guān)系圖。圖7是不同重組腺病毒對豚鼠保護效果的比較圖。圖8是重組腺病毒的預(yù)防保護時機圖。圖9是重組腺病毒多次治療防控FMD的效果圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1
本發(fā)明是以不同年代和地區(qū)分離的0型FMDV為基礎(chǔ)，選擇FMDV 2B、VP1基因高度保守序列設(shè)計合成siRNA，克隆入PSIREN-shuttle穿梭載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pShuttle_2B、 pShuttle-VPl，具體過程如下
(1)將siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA_2B的轉(zhuǎn)錄模板分別用去離子水稀釋成相同的濃度(5pmol/ μ L)，分別把互補的兩段寡核苷酸(各5 μ L混合)混勻后放在PCR擴增儀上，95°C處理2min，然后自然降到常溫進行處理。將處理后形成的雙鏈siRNA寡核苷酸片段分別與經(jīng)BamHI和EcoRI雙酶切處理后的pSIREN-Shuttle (Clontech公司)連接(連接反應(yīng)按照T4 DNA連接酶說明書操作，陽性克隆篩選按照分子克隆實驗指南操作)，得到 pShuttle-2B(siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板位于TO啟動子下游)和pShuttle-VPl (siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板位于U6啟動子下游)。
siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示
正義鏈為(5，-3，)
GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAG AG ；
反義鏈為(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTC CG ；
siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示
正義鏈為(5，-3，)
GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGAG ；
反義鏈為(5，-3，)
AATTCTCTAGAAAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG ；
(2)分別設(shè)計 2 對引物 Pvp1_f/Pvp1_k 與 P2B-F/P2B_K，模板分別為 pShuttIe-VPl 和 pShuttle-2B,用PCR方法分別擴增U6啟動子與siRNA-VPl融合片段(理論擴增片段長為329bp)、U6啟動子與siRNA-2B融合片段(理論擴增片段長為32^p)，引物序列如下 (5， -3，)
PVP1_F CCGCTCGAGGGGCAGGAAGAGGGCCTA ；
PVP1_E :AAAACTGCAGTGCCATTTCATTACCTCTTTCTC ；
P2B_F :ATAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCG ；
P2B_E :AACTGCAGACTCTCGAGGCACCCGACATAGATGAATTC。
PCR反應(yīng)過程按TaKaRa公司Ex-Taq DNA聚合酶使用說明進行，擴增體系 (50 μ L)組成分別如下權(quán)利要求
1.一種抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，其特征在于包括siRNA-VPl和 siRNA-2B ；所述的siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示；所述的siRNA_2B 的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID而.3所示；所述的^1 嫩-28的轉(zhuǎn)錄模板的反義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，其特征在于所述的 siRNA-VPl和siRNA-2B是將其轉(zhuǎn)錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入載體制備得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，其特征在于所述的載體為人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑，其特征在于所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑為重組腺病毒Aden0-2B-VPl ；所述的重組腺病毒Aden0-2B-VPl通過如下方法制備得到是將siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體 pAdeno-X，得到能分別轉(zhuǎn)錄、串聯(lián)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒；接著通過包裝細(xì)胞包裝，得到該重組腺病毒 Adeno^B-VPl。
5.權(quán)利要求1所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)將如下所示的siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板分別克隆入 PSIREN-shuttle 穿梭載體，得到重組質(zhì)粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl ；siRNA-VPl的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為5' -GATCCGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTttcaagagaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCCTTTTTTTCTAGA G-3，；反義鏈為5' -AATTCTCTAGAAAAAAAGGAGTCTGCGGACCCCGTGACTtctcttgaaAGTCACGGGGTCCGCAGACTCC G-3，；siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板的核苷酸序列如下所示正義鏈為5' -GATCCGCCAGATGCAGGAAGACATGttcaagagaCATGTCTTCCTGCATCTGGCTTTTTTTCTAGA G-3，；反義鏈為5， -AATTCTCTAGMAAAAAGCCAGATGCAGGAAGACATGtctcttgaaCATGTCTTCCTGCATCTGGCG-3 ；正義鏈寡核苷酸的5’端突出部分是BamHI酶切位點粘性末端，反義鏈寡核苷酸的5’ 端突出部分是EcoRI酶切位點粘性末端，加粗部分為siRNA正義鏈，斜體部分為siRNA的反向互補鏈，小寫字體為loop環(huán)序列，下劃線部分為7個連續(xù)T終止信號及其互補序列；(2)分別通過PHce I/I-Ceu I 雙酶切重組質(zhì)粒 pShuttle_2B 和 pShuttle-VPl， 得到目的片段；再通過體外連接法分別將目的片段與人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體 pAdeno-X 連接，得到重組質(zhì)粒 pAdeno_2B 和 pAdeno-VPl ；(3)將重組質(zhì)粒pAden0-2B和pAdeno-VPl分別線性化后，通過包裝細(xì)胞包裝，得到重組腺病毒r Adeno-2B和rAdeno-VPl ；該重組腺病毒Adeno_2B和Adeno-VPl即為抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于包含以下步驟(1)以所述的重組質(zhì)粒pamttle-2B和所述的pShuttle-VPl為模板，通過PCR分別得到U6啟動子+2B融合片段和U6啟動子+VPl融合片段，再將這兩個融合片段串聯(lián)，克隆入克隆載體上，得到串聯(lián)結(jié)構(gòu)、能分別獨立轉(zhuǎn)錄的重組質(zhì)粒P-2B-VP1 ；(2)通過體外連接法將PI-SceI/I-Ceu I雙酶切重組質(zhì)粒P-2B-VP1得到的目的片段與人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒 pAdeno-2B-VPl ；(3)將重組質(zhì)粒pAden0-2B-VPl線性化后，通過包裝細(xì)胞包裝，得到重組腺病毒 Adeno-2B-VPl ；該重組腺病毒Aden0-2B-VPl即為抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于所述的克隆載體優(yōu)選為PMD19-T simple載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑的制備方法，其特征在于所述的包裝細(xì)胞為人胚腎細(xì)胞株HEK293。
9.權(quán)利要求1 4任一項所述的抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑在制備抗口蹄疫病毒制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抗口蹄疫病毒復(fù)制與感染的生物制劑及其制備方法與應(yīng)用。該生物制劑的活性部分為siRNA-VP1和siRNA-2B；siRNA-VP1的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板的正義鏈的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明通過將siRNA-VP1的轉(zhuǎn)錄模板和siRNA-2B的轉(zhuǎn)錄模板分別與U6啟動子連接，克隆入人復(fù)制缺陷型5型腺病毒質(zhì)粒載體pAdeno-X，得到能分別轉(zhuǎn)錄、串聯(lián)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒；接著通過包裝細(xì)胞包裝，得到該重組腺病毒Adeno-2B-VP1。通過實驗證實，重組腺病毒Adeno-2B-VP1的防治效果優(yōu)于重組腺病毒Adeno-2B和Adeno-VP1分別單獨應(yīng)用或聯(lián)合應(yīng)用的效果。該生物制劑能有抑制口蹄疫病毒復(fù)制和抗口蹄疫病感染。
文檔編號A61K48/00GK102512694SQ20121000429
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者代曼曼, 劉文俊, 徐艷芳, 李銀光, 趙明秋, 陳金頂 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)