專利名稱：處理實(shí)驗(yàn)室耗材表面上存在的殘留核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種處理耗材表面上存在的殘留核酸的方法，更具體地是實(shí)驗(yàn)室耗材，特別是用于擴(kuò)增DNA或RNA樣品的實(shí)驗(yàn)的管和濾器。更具體地，本發(fā)明的目的在于解決在實(shí)施使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)反應(yīng)的技術(shù)時，由所述耗材表面上存在的殘留核酸的特異性或非特異性擴(kuò)增所引起的問題。這些殘留核酸一般來自環(huán)境，可以游離形式存在，或者包含在活細(xì)胞如微生物、病毒或原生動物中。
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增反應(yīng)由一系列酶促反應(yīng)組成，包括使得能夠從最初存在于反應(yīng)介質(zhì)中的核酸序列合成新核酸分子的聚合酶的作用。這些酶促反應(yīng)的目的一般是產(chǎn)生最初少量存在于樣品中的相同核酸序列的拷貝。最常使用的擴(kuò)增是包括連續(xù)聚合或轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的那些擴(kuò)增，如PCR和TMA。這類技術(shù)被廣泛描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。使用特異性引物，它們使得能夠在單個DNA或RNA模板的基礎(chǔ)上將相同核酸序列復(fù)制非常高的次數(shù)。在這類反應(yīng)中，用來起始聚合反應(yīng)的引物的核苷酸序列決定擴(kuò)增哪個核酸序列。通過擴(kuò)增反應(yīng)獲得的核酸序列可用于分子生物學(xué)領(lǐng)域中的許多應(yīng)用，如基因克隆、遺傳性疾病的診斷或者病毒或微生物的檢測[Vosberg, H.P.，(1989)The polymerasechain reaction:an improved method ior the analysis of nucleic acids, HumGenet.83 (I): 1-15]。根據(jù)進(jìn)行酶促反應(yīng)的條件，特別是所用的嚴(yán)格性的程度(鹽的濃度和雜交溫度)，可能擴(kuò)增這樣的DNA或RNA序列，其序列與試圖擴(kuò)增的序列或多或少相同。為了獲得給定序列的非常特異性的擴(kuò)增，即僅靶向具有與引入反應(yīng)介質(zhì)的引物的序列相同的序列的核酸，應(yīng)當(dāng)采用高嚴(yán)格性的條件。相反地，當(dāng)試圖擴(kuò)增相對于所用的引物具有一定可變性的序列時，反應(yīng)條件應(yīng)當(dāng)具有較低的嚴(yán)格性。在用于微生物檢測、遺傳研究或感染性疾病的診斷的通用測試的情況下，考慮到個體或物種之間序列的差異，常常必須尋找相對于所探尋的序列類型具有一定可變性的核酸序列。為此，通常必需求助于較低的嚴(yán)格性，使得能夠考慮遺傳多祥性。然而，在低嚴(yán)格性條件下進(jìn)行的測試具有擴(kuò)增來自研究樣品外源性的殘留核酸的序列的風(fēng)險?！凹訇栃浴钡某霈F(xiàn)由此所致，其可以大大地扭曲測試結(jié)果。在微生物的通用檢測的情況下，與來自環(huán)境的殘留核酸的存在相關(guān)的假陽性的風(fēng)險非常高[Schmidt, T., Hummel, S., Hermann, B., 1995, Evidence of contamination in PCRlaboratory disposables;Naturwissenschaften82]。在法醫(yī)學(xué)中，當(dāng)試圖在 罪犯的遺傳指紋的基礎(chǔ)上確認(rèn)其身份時，也有非零的風(fēng)險，實(shí)驗(yàn)室中使用的管或設(shè)備可能被另ー個人的DNA污染，或者甚至被操作者的DNA污染。因此難以肯定地建立該罪犯的DNA譜。因?yàn)檫@些原因，擴(kuò)增核酸專用的裝置完全去除可擴(kuò)增的殘留核酸是非常重要的。一般來說，用于分子生物學(xué)反應(yīng)的消耗性產(chǎn)品，包括DNA或RNA的擴(kuò)增反應(yīng)涉及的那些消耗性產(chǎn)品在進(jìn)行常規(guī)滅菌的最終步驟之前在潔凈室中制造以確保不存在微生物。然而，這些常規(guī)滅菌方法不足以消除來自耗材表面的所有可擴(kuò)增的核酸。不含人DNA、RNA、DNA酶、RNA酶和其他PCR抑制劑的耗材可以接受“PCR清潔”標(biāo)簽。然而這并不表示它們不含來自環(huán)境的細(xì)菌核酸?？梢允褂弥T如核酸內(nèi)切酶的酶或諸如補(bǔ)骨脂素的化學(xué)產(chǎn)物以使得殘留核酸分子不可擴(kuò)增。然而，這類產(chǎn)品或酶可以與擴(kuò)增反應(yīng)中使用的試劑和樣品不良地相互作用。去除殘留的可擴(kuò)增的核酸的其他方法使用電離輻射(紫外線(UV)、gammaU)、X-射線和beta(P))，但是為了更有效，暴露的持續(xù)時間必須為幾個小時，這使得該過程非常昂貴，并且最重要的是，這降解或削弱制備耗材的材料。此外，電離輻射的操作受到嚴(yán)格管理，這限制其實(shí)施的可能性。目前，為了滅菌其耗材，申請人使用名為Sterrad (Johnson&Johnson)的商業(yè)化過氧化氫處理方法。過氧化氫是ー種氧化性氣體，其使得能夠通過氧化來破壞微生物的細(xì)胞組分，特別是蛋白，并且在較少程度上破壞核酸。Sterrad 方法使用低溫下的氣體形式的90%過氧化氫。根據(jù)這種方法,將真空相施用于室,待處理的耗材位于該室中，從而氣相穿透并通過待處理的裝置的所有部件內(nèi)。在循環(huán)結(jié)束吋，再次施用真空階段，而通過施用電場和等離子體的形成來使過氧化氫分子電離。Sterrad方法的優(yōu)點(diǎn)之ー是可以將裝置滅菌，同時所述裝置預(yù)包裝在塑料小袋中。所述小袋包含過氧化氫可滲透的非織造合成的表
面(Tyvek )。然而，申請人發(fā)現(xiàn)這種方法并不完全破壞包含在裝置內(nèi)的殘留核酸。因此，Sten’acf方法僅部分地滿足申請人的需要。應(yīng)當(dāng)注意到申請人專業(yè)從事制造適用于微生物檢測測試的包含濾膜的膜過濾裝置。這些微生物檢測測試通常在通過已無菌的所述裝置過濾液體樣品之后通過PCR擴(kuò)增來進(jìn)行。這些裝置通常由復(fù)雜的裝置組成，包含導(dǎo)管、罐和濾膜，這使得它們的處理更困難。申請人:已應(yīng)用Sten’ad 方法幾次以試圖完全消除裝置中存在的殘留核酸。然而，擴(kuò)增仍顯示來自微生物的核酸未完全消除(圖3B)。

發(fā)明內(nèi)容
因此申請人進(jìn)行 研究以改進(jìn)前述方法，以開發(fā)處理那些裝置中存在的殘留核酸的方法，所述方法具有以下條件:(i)不損壞構(gòu)成裝置的材料，特別是膜和濾器(例如 聚丙烯、PES、PVDF)，以及(ii)沒有抑制那些裝置適用的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的效果。許多次測試后，申請人已確定待處理的表面的兩步去污處理允許滿足上文提到的條件。所開發(fā)的方法包括通過氣相環(huán)氧こ烷處理的第一歩，然后用液相或氣相過氧化氫處理的第二歩。申請人發(fā)現(xiàn)這兩步的組合使得能夠比現(xiàn)有技術(shù)更完全去污。具體地，通過比較測試，申請人發(fā)現(xiàn)處理裝置的兩步的效果是消除任何不期望的擴(kuò)增，甚至在殘留核酸最初包含在微生物中時也是如此，這在僅進(jìn)行處理步驟之ー時是不可以實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的不同模式和由此所致的優(yōu)點(diǎn)在下文中詳述。


圖1:比較應(yīng)用于最初包含在微生物(表皮葡萄球菌(S.epidermis))中的殘留DNA的不同去污處理的圖。接受各種處理之前將耗材(1.5ml管)的表面用相同數(shù)量的表皮葡萄球菌細(xì)胞污染。NS(淺灰色):未處理。EO(中灰色):通過氣相環(huán)氧こ烷處理。ECHH2O2 (I)(黒色):根據(jù)本發(fā)明通過氣相環(huán)氧こ烷然后通過液體溶液中的過氧化氫(30%)處理。Neg.(深灰色):未被表皮葡萄球菌污染的陰性對照。為了檢測可能的來自表皮葡萄球菌的殘留DNA，然后將這樣處理的表面漂洗，并且對漂洗產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)(40個循環(huán))。曲線代表通過熒光檢測的擴(kuò)增的DNA的量。圖2:比較應(yīng)用于最初包含在微生物(銅綠假單胞菌(P.aeruginosa))中的殘留RNA的不同去污處理的圖。在接受各種處理之一之前將耗材(1.5ml管)的表面用相同數(shù)量的銅綠假單胞菌細(xì)胞污染。2A:E0(中灰色):通過氣相環(huán)氧こ烷處理。Y (深灰色):用Y輻射處理。NS(淺灰色):未處理。2B:E0+H202 (I)(黒色):用氣相環(huán)氧こ烷然后用溶液中的過氧化氫(30%)處理。Y+H2O2(I)(深灰色):通過Y輻射然后用溶液中的過氧化氫(30%)處理。NS+H202 (I)(淺灰色):僅用溶液中的過氧化氫(30%)處理。NS (淺灰色):未處理。為了檢測可能的來自銅綠假單胞菌的殘留RNA，然后將這樣處理的表面漂洗，并且對漂洗產(chǎn)物進(jìn)行TMA反應(yīng)(76個循環(huán) )。曲線代表通過熒光檢測的擴(kuò)增的RNA的量。圖3:比較應(yīng)用于最初包含在微生物(痤瘡丙酸桿菌(P.acnes))中的殘留RNA的不同去污處理的圖。在接受各種處理之一之前將耗材的表面用相同數(shù)量的痤瘡丙酸桿菌細(xì)胞污染。3A:E0+H202(I)(黒色):通過氣相環(huán)氧こ烷然后通過氣相過氧化氫(Sterracf)處理。NS(淺灰色):未處理。3B:H202(g)+H2O2(g)(黒色):包括通過氣相過氧化氫(Sterrad")
處理的兩個循環(huán)的處理。NS(淺灰色):未處理。為了檢測可能的來自痤瘡丙酸桿菌的殘留RNA,然后將這樣處理的表面漂洗，并且對漂洗產(chǎn)物進(jìn)行TMA反應(yīng)(76個循環(huán))。曲線代表通過熒光檢測的擴(kuò)增的RNA的量。圖4:比較應(yīng)用于最初包含在微生物(G.stearothermophiIus)中的殘留DNA的不同去污處理的圖。在接受各種處理之一之前將耗材(包含幾個濾器的過濾單元)用相同數(shù)量的G.stearothermophilus孢子污染。NS(淺灰色):未處理。E0+H202 (g)(黑色):根據(jù)本發(fā)明用氣相環(huán)氧こ烷然后通過氣相過氧化氫(90%)處理。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種處理物體如分子生物學(xué)中的消耗性產(chǎn)品的表面上存在的可擴(kuò)增的殘留核酸的方法，其聯(lián)合使用氣態(tài)環(huán)氧こ烷處理的階段以及使用液相或氣相過氧化氫處理的第二階段。
這種方法優(yōu)選包括以下步驟:i)用氣相環(huán)氧こ烷處理所述耗材的表面；然后ii)用液相或氣相過氧化氫處理所述表面。術(shù)語“耗材”在本文中用來表示用于核酸的操作的任何物體，從環(huán)境到實(shí)驗(yàn)室中它們的集合。耗材可以由不同材料制成。本發(fā)明涉及的耗材更具體地是包含濾膜的塑料過濾裝置，所述濾膜優(yōu)選聚丙烯、PES或PVDF的，例如申請人商業(yè)化的那些過濾裝置。所述耗材更具·體地在為了進(jìn)行核酸擴(kuò)增的操作的情況下使用，特別是通過這樣的技術(shù)，如優(yōu)選在DNA樣品的基礎(chǔ)上進(jìn)行的PCR，或者優(yōu)選對RNA樣品進(jìn)行的TMA。所述方法的第一歩i) 一般在密閉室(例如Steri_Vac5XL，3M)中，利用優(yōu)選大于75%、更優(yōu)選60%-99%、并且仍然更優(yōu)選70%-90%(v/v)的氣態(tài)環(huán)氧こ烷的濃度常規(guī)地進(jìn)行[Pittet et al.1997, Swiss Noso, 4(I)]。除非另有說明，濃度為體積比體積百分比(%v/v)。因?yàn)榄h(huán)氧こ烷為小分子，其穿透能力高，這又使得能夠處理預(yù)包裝于透氣性包裝中的耗材。這種穿透能力解釋了其在滅菌難以接觸的復(fù)雜物體中的高效率。環(huán)氧こ烷還到達(dá)活材料的主要組分(DNA、蛋白質(zhì)、維生素、酶)，這賦予其高滅菌能力。因此用環(huán)氧こ烷處理對所有活細(xì)胞具有活性，并且因此具有滅菌效果。處理的有效性受幾個參數(shù)影響:氣體的相対濕度，其優(yōu)選大于或等于30%;以及溫度，其優(yōu)選為40° C-60° C，并且更優(yōu)選50。C-60。Co取決于假定的孢子和微生物的濃度以及構(gòu)成耗材的材料，氣態(tài)環(huán)氧こ烷與耗材表面之間接觸的持續(xù)時間在I小時至6小時之間變化。當(dāng)事先在待處理的耗材內(nèi)或周圍向處理室施用真空時,這種氣相中的處理更有效。根據(jù)本發(fā)明，用過氧化氫處理的步驟ii)在液相中使用水溶液進(jìn)行，或者在氣相中進(jìn)行。當(dāng)步驟ii)的過氧化氫為液相時，其濃度優(yōu)選為25%_60%。根據(jù)本發(fā)明人進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)大于或等于30%的濃度是最佳的(表3)。在液相中處理具有溶解殘留核酸的優(yōu)點(diǎn)。此外，在這種情況下，液流通過濾器使得其可能更有效地到達(dá)位于構(gòu)成那些濾器的多孔材料中的殘留核酸。當(dāng)加熱至50° C_70° C的溫度，優(yōu)選大于60° C時，液相過氧化氫更有效。這個溫度具有不損壞構(gòu)成耗材的材料的優(yōu)點(diǎn)。一般使液相過氧化氫與待去污的表面接觸優(yōu)選至少40分鐘的時間，優(yōu)選40分鐘-1小吋。這個時間大于在下文所述的氣相中處理的時間，并且一般需要干燥階段以從耗材表面消除過氧化氫。步驟ii)的用氣相過氧化氫處理是通過過氧化氫的蒸發(fā)來進(jìn)行，優(yōu)選使其濃度為大于總氣體的30%，優(yōu)選大于50%，并且更優(yōu)選大于80%。過氧化氫可以通過施用電場而被轉(zhuǎn)換為等離子體狀態(tài)，優(yōu)選在低于70° C的溫度下，更優(yōu)選低于60° C，這使得其降解并因此在處理結(jié)束時失活。上文所示的溫度低于常規(guī)滅菌方法的溫度，更好地保護(hù)可以構(gòu)成耗材的材料的質(zhì)量，特別是可以組成它們的膜或?yàn)V器。
這樣的方法可以在專用于利用氣相過氧化氫的處理的裝置中進(jìn)行，如Sterracf.方法(ASP - Johnson&Johnson),按照那些裝置的制造商的推薦進(jìn)行。Sterrad 方法構(gòu)成步驟ii)的可能但非限制性的實(shí)施方案。氣相過氧化氫的實(shí)施具有能夠用于預(yù)包裝于透氣包裝中的耗材的優(yōu)點(diǎn)。因此，當(dāng)本發(fā)明的方法的兩個步驟在氣相中進(jìn)行時，在進(jìn)行這兩個步驟之前可以將耗材包裝或預(yù)包裝。相似地，當(dāng)用過氧化氫處理在氣相中進(jìn)行時，步驟i)和ii)可以在相同處理室中互相接替地進(jìn)行，這限制耗材與環(huán)境的殘留核酸的接觸。本發(fā)明人獲得的結(jié)果在下文本申請的實(shí)施例中說明。圖1-4示出本發(fā)明的方法使得可能獲得殘留核酸的更有效處理，無論它們的來源(細(xì)胞或游離的)、它們的性質(zhì)(RNA或DNA)或者設(shè)想的擴(kuò)增模式(PCR或TMA)。這樣的有效性水平由本發(fā)明的步驟i)和ii)的組合以及它們進(jìn)行的順序所致。本發(fā)明的方法導(dǎo)致不含可擴(kuò)增的核酸的處理的耗材，這在以前是不可能獲得的，特別是關(guān)于包括一個或多個濾器或膜的耗材，所述濾器或膜優(yōu)選是聚丙烯、PES或PVDF的。具體地，因此本發(fā)明使得能夠在分子生物學(xué)中獲得不含細(xì)菌來源的核酸(保證不含DNA)的耗材，無論其是簡單或復(fù)雜的。實(shí)施例方案I將由1.5ml聚丙烯管組成的幾個耗材用已知量的DNA、RNA或微生物平行污染。然后將這些耗材Y-滅菌(劑量 為0-60kGy)或者用氣相環(huán)氧こ烷處理。滅菌之后，通過PCR(用于DNA)和TMA(用于RNA)確定殘留核酸的存在，并且與未滅菌的對照耗材比較。獲得的結(jié)果在下文表I中總結(jié)。表1:通過環(huán)氧こ烷(EO)和通過Y輻射進(jìn)行的殘留核酸處理的有效性
權(quán)利要求
1.種處理耗材的表面上存在的可擴(kuò)增的殘留核酸的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: i)用氣相環(huán)氧こ烷處理所述耗材的表面；然后 ii)用液相或氣相過氧化氫處理所述表面。
2.利要求1的方法，其中步驟i)中的環(huán)氧こ烷以70%-90%(v/v)的濃度使用。
3.利要求1或2的方法，其中步驟ii)中的過氧化氫為液相，其濃度為25%-60%，并且優(yōu)選大于30%(v/v)。
4.利要求3的 方法，其中將所述液相過氧化氫加熱至50°C-70° C的溫度，優(yōu)選大于 60° C。
5.利要求2或3的方法，其中在步驟ii)中使所述液相過氧化氫與待去污的表面接觸至少40分鐘的時間。
6.利要求1的方法，其中用過氧化氫處理是在氣相中進(jìn)行。
7.利要求6的方法,其中將所述過氧化氫蒸發(fā),使其濃度為大于30%,優(yōu)選大于50%,并且更優(yōu)選大于80%。
8.利要求7的方法，其中所述過氧化氫通過在低于60°C的溫度下施用電場而被轉(zhuǎn)換為等離子體狀態(tài)。
9.利要求1-8中任ー項(xiàng)的方法，其進(jìn)ー步包括在步驟i)和ii)之間的蒸發(fā)步驟。
10.利要求1-9中任ー項(xiàng)的方法，其中將分子生物學(xué)中的耗材事先包裝于部分非織造包裝中。
11.利要求1-10中任ー項(xiàng)的方法，其中在步驟i)和ii)之一之前施用真空。
12.利要求1-11中任ー項(xiàng)的方法，其中在步驟i)和ii)之間消除殘留的環(huán)氧こ烷。
13.利要求1-12中任ー項(xiàng)的方法，其中在步驟ii)之后從所述耗材的表面消除殘留的過氧化氫。
14.據(jù)權(quán)利要求1-13中任ー項(xiàng)的方法處理的耗材，其特征在于所述耗材不含可擴(kuò)增的殘留核酸。
15.利要求14的耗材，其特征在于所述耗材包括濾器或膜，所述濾器或膜優(yōu)選是聚丙烯、PES或PVDF的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種處理實(shí)驗(yàn)室耗材表面上存在的殘留核酸的新方法。這種方法組合兩個處理階段i)用氣相環(huán)氧乙烷處理；然后ii)用液相或氣相過氧化氫處理所述表面。這種處理的效果是避免所述殘留核酸的擴(kuò)增，特別是在PCR或TMA反應(yīng)期間。
文檔編號A61L2/20GK103096937SQ201180044130
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者M·普雷塞爾, D·梅茨 申請人:Emd密理博公司