專利名稱：癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱┑闹谱鞣椒?br> 技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱敿?xì)而言，涉及含有5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽的、不同時使用光動力療法(Photodynamic therapy:F1DT)的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?br> 背景技術(shù)：
據(jù)說癌(惡性腫瘤)成為日本最大的死因，日本國民每2人中有I人罹患癌。另夕卜，在其他發(fā)達(dá)國家中癌也排在死因的前列。因此，癌的有效治療法的開發(fā)是日本國民、以及世界人民的宏愿。但是，由于癌是患者自身的細(xì)胞，因此能夠不伴隨副作用地、有效果地治療癌的有效的治療劑及治療方法的開發(fā)并不容易，目前還未報道充分的治療劑及治療方法。目前，癌的治療中主要采用外科治療、化學(xué)療法、放射線治療，但是近年來發(fā)現(xiàn)也逐漸采用溫?zé)岑煼ā⒐鈩恿Ο煼ǖ?。上述溫?zé)岑煼ㄊ抢冒┘?xì)胞與正常細(xì)胞相比具有耐熱差的特性，特異性地抑制癌細(xì)胞的增殖的治療法。S卩，將包括癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的組織在42 43°C左右加熱時，對于正常細(xì)胞部分來說，機體恒常性(體內(nèi)平衡)發(fā)揮作用，將細(xì)胞周圍的血管擴張并增加血流、釋放熱等，將細(xì)胞的溫度保持在40°C左右，結(jié)果基本不受損傷，但是由癌細(xì)胞形成的部分由于通常血流不足等，因此體內(nèi)平衡不能充分發(fā)揮作用，結(jié)果，細(xì)胞的溫度上升至加熱溫度附近，在42.5°C左右細(xì)胞死滅。但是，在采用溫?zé)岑煼ㄟM行加熱的部位廣泛的情況下、在作為治療對象的癌位于距離身體表面一定程度深度的位置的情況下，還存在由于加熱導(dǎo)致的患者的負(fù)擔(dān)增加等問題。上述光動力療法是將對癌組織具有親和性的光敏劑或其前體對患者給與后，對癌組織照射激光使上述光敏劑 激發(fā)，由此產(chǎn)生活性氧，使癌細(xì)胞死滅的治療法。例如，在專利文獻I中，公開了含有脂質(zhì)體的光動力療法制劑，所述脂質(zhì)體中，在脂質(zhì)膜內(nèi)或其內(nèi)部水相中含有光敏性化合物，包埋至少一種以上的藥物，并且實質(zhì)上不含有機溶劑，公開了在優(yōu)選光敏性化合物之一中包括原卟啉IX(PpIX)，作為Ppix前體的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在腫瘤中選擇性地誘導(dǎo)PpIX產(chǎn)生。另外，在專利文獻I中記載了同時使用光動力療法和溫?zé)岑煼?。由此，一直以來已知由?-ALA是作為光敏劑的PpIX的前體，所以將5-ALA用于癌的治療時，至少利用光動力療法，根據(jù)情況進一步同時使用溫?zé)岑煼ǎ且恢币詠聿]有不利用光動力療法的將5-ALA應(yīng)用于癌治療的報道。[專利文獻I]日本特開2006-56807號公報

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱Ｈ绫尘凹夹g(shù)中記載的那樣，一直以來已知由于5-ALA為作為光敏劑的PpIX的前體，所以將5-ALA用于癌的治療時，至少利用光動力療法，根據(jù)情況進一步同時使用溫?zé)岑煼?。本發(fā)明人等在上述情況下進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然其作用機理完全不清楚，但是5-ALA即使在不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ㄖ?，也能夠增強抗癌作用，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及〔I〕一種不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?，其特征在于，含有通?I)表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽，R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I)[式中，R1及R2分別獨立地表示氫原子、烷基、酰基、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表不輕基、燒氧基、酸氧基、燒氧基擬基氧基、芳基氧基、芳燒基氧基或氣基。]，以及〔 2〕如上述〔I〕所述的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?，其特征在于?-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽不包埋在脂質(zhì)膜內(nèi)或其內(nèi)部水相中。另外，作為本發(fā)明的其他實施方式，可以舉出不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼?，其特征在于，將通?I)表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽向?qū)ο蠼o與；用于制備不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱┗蛑委熕幍耐ㄊ?I)表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽的應(yīng)用；不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ闹委焺?，其特征在于，含有通?I)表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽。根據(jù)本發(fā)明，能夠顯著增強不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ㄖ械目拱┳饔?。另外，根?jù)本發(fā)明，由于即使稍微降低溫?zé)岑煼〞r加熱的程度也能夠得到充分的抗癌作用，所以在采用溫?zé)岑煼訜岬牟课粡V泛的情況下、在作為治療對象的癌位于距離身體表面一定程度的深度的位置的情況下等，也均能夠減輕由于加熱導(dǎo)致的患者的負(fù)擔(dān)。另外，作為利用了本發(fā)明的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱┑陌責(zé)岑煼ㄏ鄬τ诠鈩恿Ο煼ǖ膬?yōu)點，可以舉出即使針對難以照射光線的部分的癌也能夠獲得抗癌作用。進而，根據(jù)本發(fā)明，能夠?qū)φ＜?xì)胞的損壞抑制到最小限度，并且針對癌細(xì)胞能夠獲得優(yōu)異的抗癌作用。


[圖1]是表示針對人胎兒腎細(xì)胞株HEK293株進行細(xì)胞內(nèi)活性氧量測定分析的結(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示來自DCF-DA的熒光的峰值。[圖2]為表示基于使用了人纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080的流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖3]為表示基于使用了來自大腸癌的細(xì)胞株Caco-2的流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖4]為表示基于使用了以與癌細(xì)胞同樣地異常增殖的方式轉(zhuǎn)化了的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293的流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM),圖的縱軸表示死細(xì)胞率(％ )。[圖5]為表示基于使用了人成纖維細(xì)胞株W1-38的流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖6]為表示基于使用了小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3的流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖7]為表不基于使用了來自大腸癌的細(xì)胞株Caco-2的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率(細(xì)胞死亡率)
(% )o[圖8]為表示基于使用了來自人肝癌的細(xì)胞株H印G2的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖9]為表示基于使用了來自人胃癌的細(xì)胞株KatoIII的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖10]為表示基于使用了來自人子宮頸癌的細(xì)胞株HeLa的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖11]為表示基于使用了以與癌細(xì)胞同樣地異常增殖的方式轉(zhuǎn)化了的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM),圖的縱軸表示死細(xì)胞率(％ )。[圖12]為表示基于使用了人正常二倍體成纖維細(xì)胞株W1-38的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖13]為表示基于使用了小鼠成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞株NIH3T3的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖14]為表示基于使用了來自人胎兒肺的正常成纖維細(xì)胞MRC5的錐蟲藍(lán)試劑的溫?zé)岣惺苄栽囼灥慕Y(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示死細(xì)胞率)。[圖15]為表示針對HEK293株，利用HPLC測定細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度的結(jié)果的圖。圖的橫軸表示5-ALA濃度(mM)，圖的縱軸表示細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度。
具體實施方式
[本發(fā)明的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱本發(fā)明的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?以下，也簡單表示為“本發(fā)明的增強劑”。)為不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱鳛樗霰景l(fā)明的增強劑，只要含有以下通式(I)R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I)[式中，R1及R2分別獨立地表示氫原子、烷基、?；⑼檠趸驶?、芳基或芳烷基；R3表不輕基、燒氧基、酸氧基、燒氧基擬基氧基、芳基氧基、芳燒基氧基或氣基。]表不的5_氣基乙酰丙酸類或它們的鹽(以下，也表示為“本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等”。)即可，沒有特別限定，所謂上述的“癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔谩北硎净诎責(zé)岑煼ǖ目拱┳饔谩Ｐ枰f明的是，對于人的正常細(xì)胞來說，由于優(yōu)先進行有氧代謝，所以給與后的5-氨基乙酰丙酸類代謝至血細(xì)胞或細(xì)胞色素，而由于癌細(xì)胞優(yōu)先進行無氧代謝，所以給與后的5-氨基乙酰丙酸類以血細(xì)胞或細(xì)胞色素的前體即原卟啉IX的形式蓄積在癌細(xì)胞中，這是本發(fā)明人等至此才發(fā)現(xiàn)的(參見日本特愿2009-161657號)。本發(fā)明的作用機制的詳細(xì)情況尚不清楚，認(rèn)為通過本發(fā)明的增強劑，在原卟啉IX較多地蓄積在癌細(xì)胞中的狀態(tài)下進行癌溫?zé)岑煼〞r，即使不照射激光，癌細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧量也顯著上升，癌溫?zé)岑煼ㄖ械目拱┳饔蔑@著增強(以下，也表示為“本發(fā)明的增強效果”。)。結(jié)果，根據(jù)本發(fā)明的增強齊U，能夠使癌溫?zé)岑煼ㄖ械目拱┳饔蔑@著增強，另外，由于即使稍微降低溫?zé)岑煼〞r加熱的程度也能夠得到充分的抗癌作用，所以在采用溫?zé)岑煼訜岬牟课粡V泛的情況下、在作為治療對象的癌位于距離身體表面一定程度的深度的位置的情況下等，也均能夠減輕由于加熱導(dǎo)致的患者的負(fù)擔(dān)。上述通式(I)中，R1及R2分別獨立地表示氫原子、烷基、?；?、烷氧基羰基、芳基或芳烷基。作為上述烷基，優(yōu)選碳原子數(shù)I 24的直鏈或支鏈的烷基，較優(yōu)選碳原子數(shù)I 18的烷基，特別優(yōu)選碳原子數(shù)I 6的烷基。作為所述碳原子數(shù)I 6的烷基，可以舉出甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基等。作為上述酰基，優(yōu)選碳原子數(shù)I 12的直鏈或支鏈的烷?；?、鏈烯基羰基或芳?；?，特別優(yōu)選碳原子數(shù)I 6的烷?；?。作為所述酰基，可以舉出甲?；?、乙?；?、丙酰基、丁?；?。作為上述烷氧基羰基，優(yōu)選總碳原子數(shù)2 13的烷氧基羰基，特別優(yōu)選碳原子數(shù)2 7的燒氧基擬基。作為所述燒氧基擬基，可以舉出甲氧基擬基、乙氧基擬基、正丙氧基擬基、異丙氧基擬基等° 作為上述芳基，優(yōu)選碳原子數(shù)6 16的芳基,可以舉出例如苯基、萘基等。作為上述芳烷基，優(yōu)選由碳原子數(shù)6 16的芳基和上述碳原子數(shù)I 6的烷基形成的基團，可以舉出例如芐基等。上述通式(I)中，R3表不輕基、燒氧基、酸氧基、燒氧基擬基氧基、芳基氧基、芳燒基氧基或氨基。作為上述烷氧基，優(yōu)選碳原子數(shù)I 24的直鏈或支鏈的烷氧基，較優(yōu)選碳原子數(shù)I 16的烷氧基，特別優(yōu)選碳原子數(shù)I 12的烷氧基。作為所述烷氧基，可以舉出甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、戍氧基、己氧基、羊氧基、癸氧基、十二燒基氧基等。作為上述酰氧基，優(yōu)選碳原子數(shù)I 12的直鏈或支鏈的烷酰氧基，特別優(yōu)選碳原子數(shù)I 6的烷酰氧基。作為所述酰氧基，可以舉出乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基等。作為上述燒氧基擬基氧基，優(yōu)選總碳原子數(shù)2 13的燒氧基擬基氧基，特別優(yōu)選總碳原子數(shù)2 7的燒氧基擬基氧基。作為所述燒氧基擬基氧基，可以舉出甲氧基擬基氧基、乙氧基擬基氧基、正丙氧基擬基氧基、異丙氧基擬基氧基等。作為上述芳基氧基,優(yōu)選碳原子數(shù)6 16的芳基氧基,可以舉出例如苯氧基、萘基氧基等。作為芳烷基氧基，優(yōu)選具有上述芳烷基的芳烷基氧基，可以舉出例如芐基氧基等。通式(I)中，作為R1及R2優(yōu)選氫原子。作為R3優(yōu)選羥基、烷氧基或芳烷基氧基，較優(yōu)選羥基或碳原子數(shù)I 12的烷氧基，特別優(yōu)選甲氧基或己氧基。通式⑴中，R1及R2為氫原子、R3為羥基的化合物為5-氨基乙酰丙酸，特別優(yōu)選舉出。作為除5-氨基乙酰丙酸以外的5-氨基乙酰丙酸類(即，5-氨基乙酰丙酸衍生物)的優(yōu)選例子，可以舉出5-氨基乙酰丙酸甲基酯、5-氨基乙酰丙酸乙基酯、5-氨基乙酰丙酸丙基酯、5-氨基乙酰丙酸丁基酯、5-氨基乙酰丙酸戊基酯、5-氨基乙酰丙酸己基酯等5-氨基乙酰丙酸酯，特別優(yōu)選舉出5-氨基乙酰丙酸甲基酯或5-氨基乙酰丙酸己基酯。需要說明的是，5-氨基乙酰丙酸的酯體顯示與5-氨基乙酰丙酸相同的生理效果，例如公開在日本特表平11-501914號公報中。作為5-氨基乙酰丙酸類的鹽，沒有特別限定，優(yōu)選藥學(xué)上允許的無機酸或有機酸的酸加成鹽。作為無機酸的加成鹽，可以舉出鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等，作為有機酸的加成鹽，可以舉出乙酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、抗壞血酸鹽等，特別優(yōu)選5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽或5-氨基乙酰丙酸磷酸鹽。上述鹽還可以通過化學(xué)合成、使用微生物或酶的方法中的任一種方法制造。例如，可以舉出日本特開平4-9360號公報、日本特表平11-501914號公報、日本特開2006-182753號公報、日本特開2005-314361號公報、日本特開2005-314360號公報中記載的方法。作為本發(fā)明的增強劑中含有的、本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等的量，只要能夠獲得本發(fā)明的增強效果即可，沒有特別限定，例如，可以優(yōu)選示例相對于本發(fā)明的增強劑的總量例如為0.0001 99.9999質(zhì)量％、優(yōu)選0.001 80質(zhì)量％、較優(yōu)選0.001 50質(zhì)量％、更優(yōu)選0.005 20質(zhì)量％。本發(fā)明的增強劑只要能夠獲得本發(fā)明的增強效果即可，除了本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等之外，還可以含有增強癌溫?zé)岑煼ǖ目拱┳饔玫钠渌镔|(zhì)等的任意成分。本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等可以利用常用方法制成適宜的制劑。作為制劑的劑型，可以為散劑、顆粒劑等固體制劑，從可以簡便地使用的觀點考慮，優(yōu)選制成溶液劑、乳劑、懸浮劑等液體制劑。作為上述液體制劑的制造方法，可以優(yōu)選示例例如將本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等與溶劑混合的方法、進而混合混懸劑或乳化劑的方法。如上所述，將本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等制成制劑時，根據(jù)制劑上的需要，可以配合適宜的載體，例如，賦形劑、粘合劑、溶劑、助溶劑、混懸劑、乳化劑、等滲劑、緩沖劑、穩(wěn)定劑、鎮(zhèn)痛劑、防腐劑、抗氧化劑、著色劑、潤滑劑、崩解劑、濕潤劑、吸附劑、甜味劑、稀釋劑等任意成分。需要說明的是，作為本發(fā)明的增強劑，可以優(yōu)選示出本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等不包埋在脂質(zhì)膜內(nèi)或其內(nèi)部水相中的產(chǎn)物。本發(fā)明的增強劑在體外的體系、體內(nèi)的體系中均能夠增強不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ目拱┳饔?，可以?yōu)選示例在體內(nèi)的體系中使用的方法。作為上述在體外的體系中使用的方法，可以示例包括下述步驟的方法:(a)使本發(fā)明的增強劑與對象細(xì)胞接觸的步驟；及(b)將對象細(xì)胞加熱至41 44°C (優(yōu)選42 43°C )的范圍內(nèi)的步驟，作為上述步驟(a)，可以較優(yōu)選 地示例(al)在使對象細(xì)胞與本發(fā)明的增強劑接觸的狀態(tài)下，培養(yǎng)一定時間(優(yōu)選5分鐘 25小時、較優(yōu)選10分鐘至15小時、更優(yōu)選3小時 7小時、進一步優(yōu)選5小時)的步驟；作為上述步驟(b)，可以較優(yōu)選地示例(b I)將對象細(xì)胞加熱至41 44°C (優(yōu)選42 43°C )的范圍內(nèi)，將該對象細(xì)胞在該范圍內(nèi)的溫度下維持10分鐘 5小時(優(yōu)選15分鐘 3小時、較優(yōu)選20分鐘 2小時、更優(yōu)選30分鐘 60分鐘)的步驟。作為在所述體外的體系中的本發(fā)明的增強劑的使用量，只要能夠獲得本發(fā)明的增強效果即可，沒有特別限定，可以優(yōu)選示例使與對象細(xì)胞接觸的培養(yǎng)基中的濃度以5-氨基乙酰丙酸類等換算計例如為0.1 μ M IOOOmM,優(yōu)選為10 μ M 50mM。作為將本發(fā)明的增強劑在體內(nèi)的體系中使用的方法，可以示例包括下述步驟的方法:㈧將本發(fā)明的增強劑給與至對象的步驟；及⑶將對象的癌部位加熱至41 440C (優(yōu)選42 43°C)的范圍內(nèi)的步驟，作為上述步驟(A)，可以較優(yōu)選示例(Al)將本發(fā)明的增強劑向?qū)ο蠼o與后，使其經(jīng)過一定時間(優(yōu)選5分鐘 25小時、較優(yōu)選10分鐘至15小時、更優(yōu)選3小時 7小時、進一步優(yōu)選4小時 6小時)的步驟，作為上述步驟⑶，可以較優(yōu)選示例(B I)將對象的癌部位加熱至41 44°C (優(yōu)選42 43°C)的范圍內(nèi)，將該部位在該范圍內(nèi)的溫度下維持10分鐘 5小時(優(yōu)選15分鐘 3小時、較優(yōu)選20分鐘 2小時、更優(yōu)選25分鐘 90分鐘、進一步優(yōu)選30分鐘 75分鐘、特別優(yōu)選40分鐘 60分鐘)的步驟。在上述步驟(Al)中，使其經(jīng)過一定時間，是由于使本發(fā)明的增強劑中含有的5-氨基乙酰丙酸類等的代謝產(chǎn)物即原卟啉IX在癌細(xì)胞中更多地蓄積，獲得更優(yōu)異的本發(fā)明的增強效果。作為將上述本發(fā)明的增強劑向?qū)ο蠼o與的方法，可以示例向靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)等的注射給與；經(jīng)口給與；經(jīng)皮給與；經(jīng)粘膜給與；經(jīng)直腸給與；經(jīng)腔道給與；向腦等的局部給與，其中，可以優(yōu)選示例向靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、動脈內(nèi)等的注射給與；經(jīng)口給與；經(jīng)皮給與。作為在所述體內(nèi)的體系中的本發(fā)明的增強劑的給與量，只要能夠獲得本發(fā)明的增強效果即可，沒有特別限定，可以優(yōu)選示例以本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等換算計成人I人每1日優(yōu)選1mg 1OOOOmg、較優(yōu)選3mg 3000mg、更優(yōu)選IOmg IOOOmg。本發(fā)明的增強劑的給與時間段沒有特別限定，可以為早晨也可以為傍晚，給與量較多時，分多次給與較好。作為上述體外的體系或體內(nèi)的體系中的加熱方法，只要能夠加熱至規(guī)定的溫度即可，沒有特別限定，例如可以示例下述方法:將微波、近紅外線、遠(yuǎn)紅外線、可見光、或電磁波等照射至目標(biāo)部位近旁進行加熱的方法；在目標(biāo)部位附近進行溫灸而加熱的方法；用熱水加熱目標(biāo)部位附近的方法(例如沐浴)； 用蒸汽加熱目標(biāo)部位附近的方法(例如桑拿浴)；在食道及直腸等管腔內(nèi)放入能夠發(fā)熱的器具進行加熱的方法；在癌組織中放入多根電極針進行加熱的方法。其中，由于容易以一定程度地針對癌部位進行加熱，并且，較容易加熱，因此可以優(yōu)選示例將微波、近紅外線、遠(yuǎn)紅外線、可見光、或電磁波等照射至目標(biāo)部位近旁進行加熱的方法，其中，由于電磁波容易到達(dá)至身體的深部，所以可以較優(yōu)選示例將電磁波照射至目標(biāo)部位附近進行加 熱的方法。需要說明的是，本發(fā)明的增強劑為不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱梢耘c光動力療法以外的方法(例如，外科治療、化學(xué)療法、免疫療法)同時使用。作為上述對象細(xì)胞的由來、對象的生物種類，可以優(yōu)選示例哺乳動物，可以優(yōu)選示例人、猴子、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、牛、豬、馬、兔子、綿羊、山羊、貓、狗等，其中可以較優(yōu)選示例人。在本發(fā)明中，所謂“癌”可以舉出惡性黑色素瘤(黑素瘤)、皮膚癌、肺癌、氣管及支氣管癌、口腔上皮癌、食道癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、大腸癌、肝臟及肝內(nèi)膽管癌、腎癌、胰腺癌、前列腺癌、乳癌、子宮癌、卵巢癌、腦腫瘤等上皮細(xì)胞等惡化后的癌.腫瘤、肌肉腫瘤、骨肉瘤、尤文肉瘤等構(gòu)成支持組織的細(xì)胞即肌肉或骨惡化后的癌 腫瘤、白血病、惡性淋巴瘤、骨髓瘤、伯基特淋巴瘤等來自造血細(xì)胞的癌 腫瘤等，其中，作為易于適用癌溫?zé)岑煼?、特別是能夠較多地享受本發(fā)明的增強劑的增強效果的癌，可以優(yōu)選示例纖維肉瘤、黑素瘤、大腸癌、進而轉(zhuǎn)移至腹腔內(nèi)的癌。需要說明的是，作為與本發(fā)明實質(zhì)上相同的方案，還可以示例下述方案:本發(fā)明的增強劑的制造中的、本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等的應(yīng)用；將本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等用于本發(fā)明的增強劑的方法；基于不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ陌┑念A(yù)防及/或治療中的、本發(fā)明的增強劑的應(yīng)用；特征在于將本發(fā)明的增強劑向?qū)ο蠼o與的、不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ目拱┳饔玫脑鰪姺椒?。上述?yīng)用及方法中的文字的內(nèi)容及其優(yōu)選方案如上所述。以下通過實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限定于所述實施例。[實施例1][細(xì)胞內(nèi)活性氧量測定分析]為了研究本發(fā)明的5-氨基乙酰丙酸類等對溫?zé)岑煼〞r細(xì)胞內(nèi)的活性氧種量(細(xì)胞內(nèi)活性氧量)帶來怎樣的影響，使用來自人胎兒腎臟的HEK293細(xì)胞及DCF-DA熒光試劑(2' , 7' -Dichlorodihydrofluorescein Diacetate ;H2DCFDA),進行細(xì)胞內(nèi)活性氧量測定分析。需要說明的是，所述測定分析利用下述性質(zhì):細(xì)胞透過性的H2DCFDA直至在活細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中被氧化為止為非熒光物質(zhì)，但是如果進入活細(xì)胞內(nèi)，則其二乙酸基被細(xì)胞內(nèi)酯酶切斷，進而如果被活性氧種氧化，則產(chǎn)生熒光。測定的熒光量越多，表示細(xì)胞內(nèi)活性氧量越多。所述測定分析采用以下方法進行。首先，將準(zhǔn)備的HEK293細(xì)胞在含有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco’s ModifiedEagle(DME)培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)24小時，將其分為8個組。接下來，將培養(yǎng)基交換為不含F(xiàn)BS的DME培養(yǎng)基，添加5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)使最終濃度分別成為0.5mM、1.0mM、或
2.0mM，于37°C下，培養(yǎng)2小時后，添加10% FBS，將所述HEK293細(xì)胞于37°C或42°C下培養(yǎng)24小時。另外，對于未添加5-ALA的HEK293細(xì)胞也同樣地于37°C或42°C下培養(yǎng)24小時。以上，整個培養(yǎng)過程在遮光下進行，完全不照射紫外線、可見光、紅外線、放射線等。進而，在各組的HEK293細(xì)胞中，添加DCF-DA熒光試劑(SIGMA公司制)使其最終濃度成為20 μ M，培養(yǎng)30分鐘后，采用流式細(xì)胞術(shù)(Becton -Dickinson公司制、FACSCalibur)測定各組中來自DCF-DA的熒光(FLl ;綠色熒光)。需要說明的是，從流式細(xì)胞術(shù)本體照射至細(xì)胞上的激發(fā)光僅用于測定，對細(xì)胞死亡無影響。將各組中的其熒光的峰值示于圖1的圖中。由圖1的結(jié)果可知，表明添加5-ALA時，雖然在培養(yǎng)溫度37°C的情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧量也有若干上升，但是在培養(yǎng)溫度42°C的情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧量顯著上升。更詳細(xì)而言，在培養(yǎng)溫度42 °C的情況下，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，細(xì)胞內(nèi)活性氧量上升至1.23倍(300/244)，通過1.0mM的5-ALA添加，細(xì)胞內(nèi)活性氧量上升至1.34倍(326/244)，通過2.0mM的5-ALA添加，細(xì)胞內(nèi)活性氧量上升至1.42倍(346/244)。[實施例2][基于流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼瀅為了研究通過添加5-ALA使得癌細(xì)胞對溫?zé)岬母惺苄允艿皆鯓拥挠绊?，進行了利用流式細(xì)胞術(shù)法的、以下的溫?zé)岣惺苄栽囼?。首先，作為癌?xì)胞株，準(zhǔn)備人纖維肉瘤細(xì)胞株HT-1080、來自大腸癌的細(xì)胞株Caco-2，準(zhǔn)備作為正常細(xì)胞株的人成纖維細(xì)胞株W1-38、小鼠成纖維細(xì)胞株NIH3T3，準(zhǔn)備以與癌細(xì)胞同樣地異常增殖的方式轉(zhuǎn)化了的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293。將所述細(xì)胞在含有10% FBS的DME培養(yǎng)基中于37°C下培養(yǎng)24小時，將其分為8個組。接下來，將培養(yǎng)基交換為不含F(xiàn)BS的DME培養(yǎng)基，添加5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)使得最終濃度分別成為0.5mM、
1.0mM、或2.0mM,于37°C下培養(yǎng)2小時后，添加10% FBS，將所述細(xì)胞組于37°C或42°C下培養(yǎng)24小時。另外，對于未添加5-ALA細(xì)胞組也同樣地于37°C或42°C下培養(yǎng)24小時。以上，整個培養(yǎng)過程在遮光下進行 ，完全未照射紫外線、可見光、紅外線、放射線等。
接下來，利用MBL公司制MEBCYTO-apoptosis試劑盒及流式細(xì)胞術(shù)測定各組的死細(xì)胞率(％)。需要說明的是，從流式細(xì)胞術(shù)本體照射至細(xì)胞上的激發(fā)光僅用于測定，對細(xì)胞死亡無影響。對于死細(xì)胞率來說，對引起了凋亡及壞死的細(xì)胞的總和進行計數(shù)，算出針對總細(xì)胞數(shù)的比例。將HT-1080的結(jié)果示于圖2，將Caco-2的結(jié)果示于圖3，將HEK293的結(jié)果示于圖4，將W1-38的結(jié)果示于圖5，將NIH3T3的結(jié)果示于圖6。由圖2 4可知，在作為癌細(xì)胞株的HT1080、Caco-2、及被轉(zhuǎn)化、如癌細(xì)胞那樣異常增殖的HEK293中，顯示添加5-ALA時，雖然即使在培養(yǎng)溫度37°C的情況下，死細(xì)胞率(％)也若干上升，但是在培養(yǎng)溫度42°C的情況下，死細(xì)胞率(％)顯著上升。另一方面，由圖5及6可知，在作為正常細(xì)胞的W1-38、NIH3T3中，未見在42°C培養(yǎng)條件下的依賴5-ALA濃度的細(xì)胞死亡的增強。由此，對于在42°C培養(yǎng)條件下的5-ALA的細(xì)胞死亡增強作用來說，在正常細(xì)胞中幾乎無法獲得，而在癌細(xì)胞中、或者在癌細(xì)胞樣的異常增殖的細(xì)胞中能夠顯著獲得。即，在癌溫?zé)岑煼ㄖ?，同時使用5-ALA時，癌溫?zé)岑煼ㄖ械目拱┳饔?細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用)顯著增強，并且，所述細(xì)胞死亡誘導(dǎo)作用在正常細(xì)胞中幾乎未增強。由此表明在癌溫?zé)岑煼ㄖ型瑫r使用5-ALA時，能夠?qū)φ＜?xì)胞的損壞抑制到最小限度，并且獲得對癌細(xì)胞的優(yōu)異的抗癌作用。需要說明的是，更詳細(xì)地說明圖2的HT-1080的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度為42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過添加0.5mM的5-ALA，死細(xì)胞率(％ )上升至約1.7倍，通過添加1.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約1.5倍，通過添加2.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率(％)上升至約2.3倍。另外，更詳細(xì)地說明圖3的Caco-2的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過添加0.5mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約2.1倍，通過添加1.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約2.0倍，通過添加2.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約1.9倍。進而，更詳細(xì)地說明圖4的HEK293的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過添加0.5mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約3.2倍，通過添加1.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約4.8倍，通過添加2.0mM的5-ALA，死細(xì)胞率)上升至約6.0倍。[實施例3][基于錐蟲藍(lán)試劑的 溫?zé)岣惺苄栽囼瀅作為癌細(xì)胞株，使用來自大腸癌的細(xì)胞株Caco-2、來自人肝癌的細(xì)胞株HepG2、來自人胃癌的細(xì)胞株KatoII1、來自人子宮頸癌的細(xì)胞株HeLa，作為以與癌細(xì)胞同樣地異常增殖的方式轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞，使用人胎兒腎細(xì)胞株HEK293，作為正常細(xì)胞，使用人正常二倍體成纖維細(xì)胞株W1-38、小鼠成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞株NIH3T3、來自人胎兒肺的正常成纖維細(xì)胞MRC5。對于所述各細(xì)胞，在添加了 10% 85和、0、0.5、1、2禮各濃度的541^的01^培養(yǎng)基中于37 °C或42 °C下培養(yǎng)24小時，通過胰蛋白酶處理回收細(xì)胞。之后，將回收的細(xì)胞溶液和錐蟲藍(lán)試劑等量混合，使用血球計數(shù)板對細(xì)胞進行計數(shù)，算出死細(xì)胞(被錐蟲藍(lán)染色了的細(xì)胞)的比例)(細(xì)胞死亡率)。結(jié)果表明，在作為癌細(xì)胞的Caco-2 (參照圖7)、H印G2(參照圖8)、KatoIII (參照圖9)、HeLa(參照圖10)的各癌細(xì)胞、和與癌細(xì)胞同樣地異常增殖的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293(參照圖11)中，在37 °C的培養(yǎng)下，在添加有各濃度的5-ALA的情況下未見死細(xì)胞率的上升，但是通過于42°C下進行培養(yǎng)，死細(xì)胞率與5-ALA濃度依賴性地顯著上升。特別是在轉(zhuǎn)化了的人胎兒腎細(xì)胞株HEK293中，顯著地觀察到5-ALA濃度依賴性。另一方面，在W1-38(參照圖12)、NIH3T3(參照圖13)、MRC5(參照圖14)各正常細(xì)胞中，即使通過于42°C下進行培養(yǎng)也未見5-ALA濃度依賴性的、死細(xì)胞率的上升。由上述結(jié)果可知，與上述實施例2中的基于流式細(xì)胞術(shù)的溫?zé)岣惺苄栽囼炌瑯拥乇砻?，在癌溫?zé)岑煼ㄖ?-ALA的同時使用能夠?qū)φ＜?xì)胞的損傷抑制到最小限度，并且，增強對癌細(xì)胞的抗癌作用。需要說明的是，更詳細(xì)地說明圖7的Caco-2的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況而言，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，死細(xì)胞率)上升至約
1.2倍，通過1.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率)上升至約1.7倍，通過2.0mM的5-ALA添力口，死細(xì)胞率(％)上升至約1.6倍。另外，更詳細(xì)地說明圖8的H印G2的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，死細(xì)胞率(% )上升至約1.1倍，通過1.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率(％ )上升至約1.35倍，通過
2.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率)上升至約1.5倍。更詳細(xì)地說明圖9的KatoIII的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，死細(xì)胞率(％ )上升至約1.8倍，通過1.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率(％ )上升至約1.8倍，通過2.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率)上升至約1.8倍。更詳細(xì)地說明圖10的HeLa的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，死細(xì)胞率)上升至約1.4倍，通過1.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率)上升至約1.5倍，通過2.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率)上升至約1.6倍。進而，更詳細(xì)地說明圖11的HEK293的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況來說，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，死細(xì)胞率)上升至約1.6倍，通過1.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率(％ )上升至約2.0倍，通過2.0mM的5-ALA添加，死細(xì)胞率(％ )上升至約
3.5 倍。[實施例4][細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度 的基于HPLC的測定]使用在上述實施例3中顯著地觀察到5-ALA與溫?zé)岑煼ǖ耐瑫r使用效果的、轉(zhuǎn)化了的人胎兒腎細(xì)胞株J1EK293進一步進行研究。另外，作為對照，使用未見5-ALA與溫?zé)岑煼ǖ耐瑫r使用效果的、正常細(xì)胞株W1-38株。對于上述2種細(xì)胞，在含有10% FBSJP 0、0.5、
1、2mM各濃度的5-ALA的DME培養(yǎng)基中，于37°C或42°C下培養(yǎng)24小時，通過胰蛋白酶處理回收細(xì)胞后使用血球計數(shù)板，進行調(diào)整使得測定樣品中含有的細(xì)胞數(shù)成為1X104。接下來，用NaOH使細(xì)胞溶解，將用DMF溶液(將N，N-二甲基甲酰胺:2-丙醇=100: I混合得到的產(chǎn)物)處理后的細(xì)胞溶解液在13，000rpm、4°C下離心分離10分鐘之后僅回收上清液，將在室溫下反應(yīng)24小時的上清液作為測定樣品，用于利用HPLC的PpIX濃度測定。將對于上述HEK293株，通過HPLC測定細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度得到的結(jié)果示于圖15。確認(rèn)到在42°C培養(yǎng)條件下HEK293細(xì)胞株內(nèi)的PpIX濃度以依賴于5-ALA濃度的方式上升。所述結(jié)果表明，上述實施例3中所示的5-ALA的溫?zé)岑煼ǖ脑鰪娮饔靡砸蕾囉?-ALA的方式被引起。需要說明的是，更詳細(xì)地說明圖15的HEK293的結(jié)果時，對于培養(yǎng)溫度42°C的情況，與未添加5-ALA的情況相比，通過0.5mM的5-ALA的添加，細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度上升至約
2.75倍，通過1.0mM的5-ALA添加，細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度上升至約6.3倍，通過2.0mM的5-ALA添加，細(xì)胞內(nèi)PpIX濃度上升至約5.9倍。另一方面，雖然圖中未示出，在正常細(xì)胞W1-38株中，無論添加的5-ALA濃度如何，在用于本實驗的任意測定樣品中，細(xì)胞中PpIX濃度均為檢測限以下。所述結(jié)果證明，如上述實施例3所示，5-ALA與溫?zé)岑煼ǖ耐瑫r使用不會對正常細(xì)胞帶來傷害。產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明可以優(yōu)選用于癌治療領(lǐng)域，更詳細(xì)而言，可以優(yōu)選用于不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔?增強劑的領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.種不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?，其特征在于，含有通?1)表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽，R2RiNch2COCh2Ch2COR3 (I) 式中，R1及R2分別獨立地表示氫原子、烷基、?；?、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表示羥基、烷氧基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或氨基。
2.按權(quán)利要求1所述的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱涮卣髟谟冢?-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽不包埋在脂質(zhì)膜內(nèi)或其內(nèi)部水相中。
全文摘要
本發(fā)明提供不同時使用光動力療法的癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱Ｍㄟ^作為癌溫?zé)岑煼ǖ淖饔迷鰪妱?，利用通?1)R2R1NCH2COCH2CH2COR3 (1)[式中，R1及R2分別獨立地表示氫原子、烷基、?；?、烷氧基羰基、芳基或芳烷基；R3表示羥基、烷氧基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳基氧基、芳烷基氧基或氨基。]表示的5-氨基乙酰丙酸類或它們的鹽，由此能夠不同時使用光動力療法地治療癌。
文檔編號A61P43/00GK103096884SQ20118004299
公開日2013年5月8日 申請日期2011年9月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月14日
發(fā)明者千葉櫻拓, 田中徹, 高橋究, 中島元夫, 安部史紀(jì) 申請人:學(xué)校法人東京農(nóng)業(yè)大學(xué), 思佰益藥業(yè)股份有限公司