專利名稱：非糖基化重組人g-csf的長期貯藏的制作方法
非糖基化重組人G-CSF的長期貯藏本發(fā)明涉及用于非糖基化重組人G-CSF的長期貯藏的方法。G_CSF(粒細(xì)胞-集落刺激因子)是屬于細(xì)胞因子家族的天然存在的生長因子。G-CSF在造血過程中起關(guān)鍵作用，并增強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞和嗜中性子代細(xì)胞的成熟、增殖、分化和存活。G-CSF在臨床上主要用于控制腫瘤，尤其用于化療后嗜中性白細(xì)胞減少癥的治療，并且其還用于骨髓移植和傳染性疾病的治療。天然存在形式的人G-CSF為具有5個半胱氨酸殘基的約20kDa的糖蛋白。這些殘基中的四個形成對該蛋白活性至關(guān)重要的兩個分子間二硫鍵。由于從天然來源僅能獲得少量的G-CSF，在藥物中主要使用重組形式的G-CSF，尤其是通過在原核宿主中表達(dá)蛋白而產(chǎn)生的那些。在原核宿主例如大腸桿菌(E.Coli)中表達(dá)的蛋白與天然G-CSF的區(qū)別在于它們是非糖基化的。在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白具有在該宿主生物體中表達(dá)所必須的額外的N-末端蛋氨酸殘基。由于該蛋白的高疏水性，非糖基化重組G-CSF較不穩(wěn)定。該分子易于吸附于貯藏容器、小瓶或注射器等的內(nèi)表面，并形成二聚體和更高級的聚集體。常規(guī)的液體G-CSF制劑還對機(jī)械應(yīng)力、例如運(yùn)輸中振搖而導(dǎo)致的應(yīng)力敏感，并且對意外的凍融敏感，這也可能會導(dǎo)致更高水平聚集體以及生物活性的損失。而且，G-CSF還會經(jīng)受化學(xué)修飾例如脫酰胺化、氧化、二硫鍵斷裂或蛋白水解。比其它降解途徑更迅速發(fā)生的脫酰胺化是一個特殊問題，因?yàn)镚-CSF的谷氨酰胺含量高?？傊@可能導(dǎo)致生物學(xué)上可獲得的活性G-CSF單體的含量減少，尤其在長期貯藏所述蛋白的情況下。這不僅成本高而且從治療上是不期望，例如在較長時間內(nèi)以恒定劑量施用G-CSF的情況。而且，由多聚化或脫酰胺化形成的產(chǎn)物可導(dǎo)致不利的免疫應(yīng)答。G-CSF制劑的穩(wěn)定化是各種專利和非專利文獻(xiàn)的主題。DE-A-3723781描述了磷酸鹽緩沖的含水G-CSF制劑，其包含藥學(xué)上可接受的表面活性劑如聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯，用于與人血清白蛋白和甘露醇聯(lián)合以穩(wěn)定活性成分。這些制劑在4°C長期保持穩(wěn)定。然而，由于其抗原性，源自人類和動物的蛋白和肽可能引起不利的免疫反應(yīng)。EP-A-0373679公開了具有2. 75-4. O的pH值和低導(dǎo)電性的G-CSF制劑，其可以長期貯藏而不會形成聚集物。如果使用，則在這些制劑中使用少于2mM的少量緩沖劑以避免G-CSF的聚集。EP-A-1197221公開了 pH為5_7的長期穩(wěn)定的G-CSF制劑，其包含賴氨酸、組氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和天冬酰胺中的一種或多種氨基酸以及一種或多種疏水性氨基酸。加入蛋氨酸以防止G-CSF分子中蛋氨酸殘基的氧化。W0-A-2007/034509公開了包含重組人G-CSF和氨基酸的穩(wěn)定的水性制劑，所述氨
基酸是蛋白中蛋氨酸殘基的氧化抑制劑。W0-A-2005/042024公開了包含G-CSF和酸如乙酸或谷氨酸的藥物組合物，其不含表面活性劑。W0-A-2005/039620公開了在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定的琥珀酸鹽和酒石酸鹽緩沖的組合物。Herman，A. C.等(“Characterisation，F(xiàn)ormulation, and Stability
T
of NeupOgen (Filgrastim), a Recombinant Human Granulocyte-ColonyStimulating
Factor. ”(一種重組人粒細(xì)胞集落刺激因子-Neupogen (Filgrastim)的表征、制劑和穩(wěn)定性)，見Formulation Characterisation andStability of Protein Drugs,第303-328 頁，R. Pearlman 和 Y. J. Wang,編著，Plenum Press, New York, 1996)中描述了非糖基化重組G-CSF的穩(wěn)定組合物，其包含IOmM乙酸鈉，pH4. O、5%甘露醇和O. 004%的聚山梨醇酯80。這類組合物在2-8°C保持穩(wěn)定24小時以上。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在非格司亭(filgrastim)制劑中用山梨糖醇代替甘露醇可以消除意外凍融期間蛋白對聚集的敏感性。然而，根據(jù)生
產(chǎn)商的說明，應(yīng)當(dāng)避免將其貯藏于冰箱中。W0-A-2007/099145公開了液體乙酸鹽緩沖G-CSF制劑，其包含聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80作為表面活性劑且pH值在4. I和4. 4之間。W0-A-2008/122415公開了液體水性谷氨酸鹽緩沖G-CSF制劑，具有的pH為
3.5-4. 8,其在例如凍融時碰到的機(jī)械應(yīng)力的條件下是穩(wěn)定的。Piedmonte 等(Pharmaceutical Research,第 24 卷,No. 1,2007 年 I 月，136-146頁)描述了山梨糖醇對冷凍蛋白制劑中蛋白聚集的影響。本發(fā)明的目的是提供用于生物學(xué)活性非糖基化重組人G-CSF的穩(wěn)定長期貯藏的方法，其中貯藏期間由于吸附于容器壁的現(xiàn)象而導(dǎo)致的G-CSF損失、降解、尤其是脫酰胺作用被減少。此目的是通過本發(fā)明用于非糖基化重組人G-CSF的穩(wěn)定長期貯藏的方法實(shí)現(xiàn)的，所述方法包括以下步驟(a)提供包含非糖基化重組人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖的G-CSF組合物；(b)將步驟(a)中提供的G-CSF組合物冷卻至-15°C或更低的溫度以獲得冷凍G-CSF組合物；(c)將步驟(b)中獲得的G-CSF組合物貯藏于冷凍狀態(tài)下；以及(d)將步驟(C)的冷凍G-CSF組合物的溫度經(jīng)歷一段時間升至2°C至8°C范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95%。本發(fā)明還涉及提供非糖基化重組人G-CSF的藥物組合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)用乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液和山梨糖醇配制非糖基化重組人G-CSF以獲得水性緩沖G-CSF組合物；(b)將步驟(a)的G-CSF組合物冷卻至_15°C或更低的溫度以獲得冷凍G-CSF組合物；(c)將步驟(b)中獲得的G-CSF組合物貯藏于冷凍狀態(tài)下；(d)將步驟(C)的冷凍G-CSF組合物的溫度經(jīng)歷一段時間升至2°C至8°C范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95% ;以及
(e)將步驟(d)中獲得的液體組合物灌裝至用于胃腸外用途的初級包裝(primarypackaging)中。
在本發(fā)明的過程中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)明的方法，可以顯著減少或者甚至可以避免脫酰胺作用和非糖基化重組人G-CSF的損失，即使以高濃度和大體積提供G-CSF并且不使用表面活性劑。這樣，即使貯藏較長時間也能保持活性。而且，由于G-CSF組合物可以貯藏于冷凍狀態(tài)下，它們對例如運(yùn)輸中可能經(jīng)歷的機(jī)械應(yīng)力不敏感。圖I示出用經(jīng)歷本發(fā)明方法的非格司亭樣品(泳道I和2)以及貯藏于25°C溫度的非格司亭樣品(泳道3和4)觀察到的脫酰胺產(chǎn)物的對比，由等電點(diǎn)聚焦(IEF)測定。本發(fā)明組合物中使用的非糖基化重組人G-CSF蛋白(在下文亦稱為G-CSF)可以是包含人G-CSF的非糖基化氨基酸序列并具有其生物活性的任何蛋白。非糖基化重組人G-CSF通常通過在原核宿主如大腸桿菌中表達(dá)人G-CSF基因來獲得。在大腸桿菌中表達(dá)的非糖基化重組人G-CSF通常具有N-末端Met殘基。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，人G-CSF包含或具有人G-CSF的一級結(jié)構(gòu)加上N-末端蛋氨酸(r-met HU G-CSF)，如歐洲藥典6. 3專論(01/2009 :2206 ;“Filgrastim Concentrated Solution”,第 4142 頁)或 Herman, A. C 等(上述)中所示，即非格司亭的氨基酸序列，或是其基本具有非格司亭生物活性的變體，例如具有N-末端或C-末端延伸(例如融合蛋白)的變體、其中在N-末端的蛋氨酸殘基已經(jīng)被一些其它氨基酸如甘氨酸替代的變體，或者氨基酸序列中具有中性突變的變體。可用于本發(fā)明制劑的G-CSF變體公開于例如EP-A-0456200中。 本發(fā)明的G-CSF組合物中使用的緩沖體系為乙酸/醋酸鹽緩沖液或谷氨酸/谷氨酸鹽緩沖液。本發(fā)明中使用的組合物優(yōu)選不含其它緩沖劑。根據(jù)本發(fā)明所用的緩沖液可以例如如下制備以乙酸或谷氨酸和/或其鹽開始，并使用相應(yīng)的酸或堿或其它合適的無機(jī)酸或有機(jī)酸或無機(jī)堿如鹽酸或堿金屬氫氧化物或堿土金屬氫氧化物將pH調(diào)整為期望值。優(yōu)選生理學(xué)上可接受的乙酸鹽或谷氨酸鹽，例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽。優(yōu)選堿金屬鹽或銨鹽，尤其是單鈉鹽。優(yōu)選地，以乙酸或谷氨酸開始、利用合適的無機(jī)堿如氫氧化鈉調(diào)整pH值來制備所述緩沖液。本發(fā)明方法的步驟(a)提供的組合物的pH值通常在3. 5至5. O的范圍，優(yōu)選在
3.7至4. 8的范圍。更優(yōu)選地，pH在3. 7至4. 6的范圍，例如4. O至4. 6?？梢苑奖愕卣{(diào)整乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液的濃度，從而在期望的pH值獲得pH-穩(wěn)定效應(yīng)并且獲得足夠的緩沖容量。通常，乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液的濃度至少為O. 5mM，優(yōu)選為I至IOOmM,更優(yōu)選為2至80mM。在2至40mM的范圍、尤其是2至25mM、例如5至15mM和優(yōu)選約IOmM的緩沖劑濃度將提供充分的穩(wěn)定性，并且低到足以避免組合物注射時不利的組織反應(yīng)。本發(fā)明方法的步驟(a)中提供的組合物中的G-CSF濃度將取決于預(yù)期用途。濃度上限由G-CSF在緩沖液的溶解度決定。通常，G-CSF濃度在0. I至8mg/ml的范圍，優(yōu)選為0. 25至6. 5mg/ml。在分析樣品中或在無需進(jìn)一步稀釋的待施用藥物組合物中，G-CSF的含量通常在0. I至2. 0mg/ml的范圍,優(yōu)選不超過2. 5mg/ml。在可以進(jìn)一步處理以獲得適合施用于患者的藥物產(chǎn)品更濃的組合物、例如包含G-CSF作為方法中間體的組合物中，其G-CSF濃度通常在2. 5mg/ml至8. 0mg/ml的范圍，優(yōu)選為2. 5至6. 5mg/ml,更優(yōu)選不超過5. 5mg/ml ο
本發(fā)明方法的步驟(a)提供的組合物包含山梨糖醇作為張力調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，除緩沖體系以外，山梨糖醇是組合物中使用的唯一張力調(diào)節(jié)劑。山梨糖醇的含量通常不超過200mg/ml,優(yōu)選為 10 至 100mg/ml,更優(yōu)選為 25 至 75mg/ml,例如約 50mg/ml。本發(fā)明方法中使用的組合物可以含有或不含表面活性劑。如果表面活性劑存在，所述表面活性劑通常為非離子表面活性劑。優(yōu)選地，所述非離子表面活性劑選自乙氧化脂肪醇、燒基聚糖苷、聚氧化烯(polyoxyalkylenes)、聚山梨醇酯或上述兩種或多種的混合物。優(yōu)選聚氧化烯，如聚氧化稀嵌段共聚物，例如Poloxamer 188 (可按商品名PluronieF68獲得)，以及聚山梨醇酯，即脂肪族脂肪酸的聚氧乙烯脫水山梨醇酯。最優(yōu)選聚山梨醇酯，例如聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯(可按商品名Tween 20獲得)、聚氧乙烯脫水山梨醇單棕櫚酸酯(可按商品名Tween 40獲得)、聚氧乙烯脫水山梨醇單硬脂酸酯(可按商品名Tween 60獲得)、聚氧乙烯脫水山梨醇三硬脂酸酯(可按商品名Tween 65獲得)、聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯(Tween 80)和聚氧乙烯脫水山梨醇三油酸酯(Tween 85)。最優(yōu)選聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯和聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯?！?br> 如果使用表面活性劑,所述表面活性劑優(yōu)選以5mg/ml或更低的量存在,優(yōu)選Img/ml或更低。優(yōu)選表面活性劑、尤其是聚山梨醇酯的使用量為O. 001至I. Omg/ml，更優(yōu)選為O. 01 至 O. 5mg/ml。盡管本發(fā)明方法的步驟(a)中提供的組合物可能包含其它試劑如氨基酸、還原齊U、抗氧化劑和血清蛋白，但是組合物通常由G-CSF、水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液、山梨糖醇和任選的表面活性劑組成，因此不含其它試劑。本發(fā)明方法的步驟(a)中提供的組合物可以以其本身已知的方式制備。例如，將緩沖物質(zhì)即乙酸或谷氨酸或其鹽、山梨糖醇和任選的其它添加劑如表面活性劑溶解在適量的水性溶劑、通常為水中。如果需要，利用上述的合適的酸或堿調(diào)節(jié)PH值。在滅菌、例如過濾通過無菌濾器后，以所需的濃度加入G-CSF?？蛇x并優(yōu)選地，步驟(a)中使用的G-CSF組合物作為來自進(jìn)行或不進(jìn)行再次緩沖(re-buffering)的生產(chǎn)工藝的一個批次而獲得。本發(fā)明方法的步驟(a)中提供的水性G-CSF組合物可以以任何期望體積提供，但優(yōu)選體積為0. Iml至81的范圍，優(yōu)選為5ml至41，更優(yōu)選為IOml至2. 01，最優(yōu)選為IOOml至I. 51。在合適的容器如聚乙烯(PE)袋、玻璃瓶、或由不含或含有乙二醇(PETG)的聚對苯二甲酸乙二酯(PET)制成的瓶中提供該組合物。通常在無菌條件下將組合物灌裝至容器中，并且優(yōu)選使用惰性氣體如氮?dú)?。通常，容器僅用組合物部分灌裝，并且優(yōu)選不超過90%體積，優(yōu)選用惰性氣體充入容器中的頂部空間。將以期望體積提供的本發(fā)明的液體水性G-CSF組合物冷卻至_15°C或更低的溫度直至冷凍。通常，將組合物冷卻至-15至-25°C的溫度，例如約_20°C，或?qū)⑺鼈兝鋮s至_60°C至_80°C的溫度。例如可以在冰箱或冷藏室中或通過將含G-CSF組合物的容器浸入液氮中來實(shí)現(xiàn)冷卻。將步驟(b)中獲得的冷凍G-CSF組合物在期望的_15°C或更低溫度貯藏于冷凍狀態(tài)。通常，將組合物貯藏于該組合物已經(jīng)冷卻到的溫度，即如上所述，優(yōu)選在-15至-25°C或-60至-80°C的溫度，該溫度為所定義的標(biāo)準(zhǔn)冷藏室或低溫冰箱的溫度。通常，將冷凍G-CSF組合物貯藏至少兩天的時間，優(yōu)選至少一個月，例如至少三個月或至少六個月。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在G-CSF組合物貯藏于冷凍狀態(tài)下的時間內(nèi)脫酰胺作用顯著減少(參見實(shí)施例4和圖I)。在步驟(c)中冷凍G-CSF組合物的貯藏之后，將冷凍組合物的溫度經(jīng)歷一段時間升至2°C至8°C范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95%。術(shù)語“升高溫度至2°C至8°C范圍的溫度”意指組合物未暴露于8°C以上的溫度。具體而言，根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，可通過逐漸或線性地升高溫度經(jīng)較長時間將冷凍組合物升溫至2°C至8°C的溫度。融化冷凍組合物并獲得G-CSF含量為起始提供的組合物的G-CSF含量的至少95%的液體組合物必需的延長的時間通常為至少6小時。例如，在_20°C的溫度將組合物保持在冷凍狀態(tài)的情況下，可通過逐漸或線性每小時升溫4°C經(jīng)6小時將組合物從_20°C升溫至+4°C。例如，可以使用Integrated BiosystemsCryoPilot 系統(tǒng)運(yùn)行線性溫度梯度。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，冷凍組合物將立即被轉(zhuǎn)移至期望的2°C至8°C的溫度，然后將在該溫度保持較長的時間以使冷凍組合物融化并獲得具有所需要的G-CSF含量的液體組合物。通常，將冷凍組合物轉(zhuǎn)移至調(diào)整為該溫度范圍的冷藏室或水浴。在這種情況下，組合物在該溫度保持的時間取決于例如冷凍G-CSF組合物的體積和組合物中G-CSF的濃度。通常，具有大體積、例如IOOml或更多和高G-CSF濃度的組合物所需的時間比具有小體積、例如低于IOOml和低G-CSF濃度的組合物更長。同樣的，在冷藏室中所需時間比在水浴中更長。通常，為獲得期望的高G-CSF含量所需的時間為至少12小時，且通常時間在12-72小時范圍內(nèi)。例如，具有低于IOOml的小體積的組合物所需的時間通常在12-24小時范圍，盡管具有IOOml或更多的大體積、例如IOOml至81、例如O. 81和/或高濃度G-CSF、例如2. 5至8mg/ml的組合物所需的時間通常為18小時或更多，例如在水浴中為24至48小時，以及在冷藏室中36小時或更多，例如36至72小時。更大體積可能需要成比例的更長時間。在獲得的液體組合物中，G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95%，優(yōu)選至少97%，最優(yōu)選至少99%。術(shù)語“G-CSF-含量”意在包括G-CSF單體及其多聚體以及由其衍生的相關(guān)蛋白如脫酰胺和氧化的變體。例如，可以通過如歐洲藥典 6. 3 專論(01/2009 :2206 ;“Filgrastim Concentrated Solution”,第 4143-4144 頁，尤其是第 4143 頁uImpurities with molecular masses higherthan that of filgrastim. Size-exclusion chromatography (2. 2. 30)，， 和 “Relatedproteins. Liquidchromatography (2. 2. 29) ”)中所描述的尺寸排阻色譜(SEC)或反相-HPLC(RP-HPLC)來測定G-CSF-含量。盡管兩種方法給出相同的結(jié)果，但通常使用RP-HPLC。使用本發(fā)明的方法，步驟(d)中獲得的重組G-CSF的生物效價基本被保持。具體而言，相對于步驟(a)中提供的G-CSF的生物效價，該生物效價為至少90%，優(yōu)選至少95%，更優(yōu)選至少 97%、98%或 99%。如歐洲藥典 6. 3 專論(01/2009 :2206 ,FilgrastimConcentrated Solution” ；第 4142-4144 頁,尤其是第 4144 頁ASSAY 一“potency”)中對非格司亭所述來測定生物活性。簡言之，通過與步驟(a)中提供的組合物(以國際單位標(biāo)定作為參比)相比，通過測量其刺激NFS-60細(xì)胞增殖的能力來測定步驟(d)中獲得組合物的生物效價。為測定活細(xì)胞數(shù)目，可以使用熒光素酶化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)來定量細(xì)胞內(nèi)ATP。測量的發(fā)光信號與ATP的量成比例，ATP的量與存在的細(xì)胞數(shù)目成正例。相對效價可以使用合適的統(tǒng)計學(xué)方法、例如根據(jù)歐洲藥典5. 3專論的平行線測定來計算，并以步驟(d)中獲得組合物與步驟(a)組合物相比的百分比來表達(dá)。在步驟(d)之后，尤其是在提供非糖基化重組人G-CSF的藥物組合物的方法中，可將所獲得的液體組合物灌裝至用于胃腸外用途的初級包裝如小瓶或注射器中。有利地，在灌裝前，可將液體組合物分成適合施用、例如通過注射或輸注于患者的等分試樣。G-CSF的濃溶液可在灌裝前稀釋，并且任選地，稀釋緩沖液也可能包含表面活性劑和其它添加劑。在本發(fā)明方法的步驟(C)和(d)中貯藏和融化后獲得的G-CSF制劑不顯示或僅顯示少量的由蛋白吸附、脫酰胺作用或聚集而引起的G-CSF蛋白損失。如上所述，根據(jù)本發(fā)明方法最終獲得的G-CSF組合物的總G-CSF含量為G-CSF起始含量的至少95%。這些組合物， 任選稀釋后，可以用作各種應(yīng)用形式的藥物，例如用于注射或輸注的制劑，尤其是用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下施用的制劑。所獲得的藥物可以用于任何可以使用G-CSF的適應(yīng)癥，例如用于嗜中性白細(xì)胞減少癥、用于骨髓移植的治療，以及用于傳染病和腫瘤疾病的治療中。下文將參考實(shí)施例和圖I對本發(fā)明作更詳細(xì)的說明，但其并不意圖限制本發(fā)明。
實(shí)施例方法I.尺寸排阻色譜(SEC)根據(jù)歐洲藥典6. 3 專論(01/2009 :2206 ;“Filgrastim ConcentratedSoIution^第 4143 頁uImpurities with molecular masses higher than that offilgrastim.Size-exclusion chromatography (2. 2. 30)，，)中描述的方法,通過SEC進(jìn)行聚集分析,不同的是使用熒光檢測。簡言之，在30°C溫度使用親水硅膠作為固定相。使用磷酸鹽緩沖的碳酸氫銨溶液作為流動相、以0. 5ml/min的流速進(jìn)行洗脫。在345nm檢測熒光并在280nm激發(fā)。對色譜圖進(jìn)行定量，區(qū)分G-CSF單體和作為雜質(zhì)的更高級的聚集體。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用峰面積百分比(％)表示。2.反相(RP)HPLC根據(jù)歐洲藥典6. 3 專論(01/2009 :2206 ;“Filgrastim ConcentratedSoIution第 4143 頁-.uRelated proteins. Liquid chromatography (2. 2. 29) ”)中描述的方法，使用RP-HPLC測定長期貯藏后樣品中的G-CSF含量和雜質(zhì)(脫酰胺和氧化的變體)，不同的是使用熒光檢測進(jìn)行純度測定，如上所述。相對于G-CSF參比標(biāo)準(zhǔn)，通過UV檢測在215nm測定蛋白含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用峰面積百分比)表示。3.等電點(diǎn)聚焦(IEF)根據(jù)歐洲藥典6. 3 專論(01/2009 :2206 ;“Filgrastim ConcentratedSoIution第 4143 頁“ Impurities with charges differing from that off i lgrastim.Isoelectric focusing(2. 2. 54) ”)中描述的方法,通過IEF進(jìn)行對凍融后樣品的與非格司亭電荷不同的雜質(zhì)的分析，不同的是使用較低濃度的參比溶液以及銀染法以得到更高的靈敏度。實(shí)施例I
制備作為非糖基化重組人G-CSF的非格司亭的以下水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖的組合物，如下表I所示，并用于以下實(shí)驗(yàn)表I
權(quán)利要求
1.用于非糖基化重組人G-CSF的穩(wěn)定長期貯藏的方法，所述方法包括以下步驟 (a)提供包含非糖基化重組人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖的G-CSF組合物； (b)將步驟(a)中提供的G-CSF-制劑冷卻至-15°C或更低的溫度以獲得冷凍G-CSF制劑； (c)將步驟(b)中獲得的所述G-CSF-制劑貯藏于所述冷凍狀態(tài)下； (d)將步驟(c)的所述冷凍G-CSF組合物的溫度經(jīng)歷一段時間升至2°C_8°C范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使所述組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95%。
2.權(quán)利要求I的方法，其中步驟(a)的緩沖的G-CSF-制劑中G-CSF的量在O.lmg/ml至8. Omg/ml的范圍，優(yōu)選O. 25mg/ml至6. 5mg/ml的范圍。
3.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2的方法，其中所述緩沖的G-CSF組合物的pH為3.5至5，優(yōu)選3. 7至4. 8。
4.權(quán)利要求I至3任一項(xiàng)的方法，其中所述緩沖的G-CSF組合物的乙酸鹽或谷氨酸鹽濃度在O. 5mM至IOOmM的范圍，優(yōu)選2mM至80mM的范圍。
5.權(quán)利要求I至4任一項(xiàng)的方法，其中所述G-CSF組合物中山梨糖醇的量在10至100mg/ml的范圍，優(yōu)選25至75mg/ml的范圍。
6.權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)中提供的水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖的G-CSF組合物的體積為O. Iml至8L，優(yōu)選為5ml至4L，更優(yōu)選為IOOml至I. 5L。
7.權(quán)利要求I至6任一項(xiàng)的方法，其中將步驟(b)中的G-CSF組合物冷卻至-15°C至-25°C的溫度或_60°C至_80°C的溫度。
8.權(quán)利要求I至7任一項(xiàng)的方法，其中將步驟(c)中的冷凍的G-CSF組合物貯藏至少兩天的時間，優(yōu)選至少一個月的時間，更優(yōu)選至少三個月的時間。
9.權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法，其中所述冷凍G-CSF組合物的溫度升至步驟⑷中2°C至8°C范圍的溫度是通過經(jīng)過至少6小時時間逐漸或線性地升高溫度實(shí)現(xiàn)的。
10.權(quán)利要求I至8任一項(xiàng)的方法，其中所述冷凍G-CSF組合物的溫度升至步驟(d)中的溫度是通過將冷凍組合物轉(zhuǎn)移至2°C _8°C范圍的溫度并將組合物在所述溫度保持至少12小時、優(yōu)選至少24小時、更優(yōu)選至少36小時的時間實(shí)現(xiàn)的。
11.權(quán)利要求I至10任一項(xiàng)的方法，其中所述G-CSF組合物不含表面活性劑。
12.權(quán)利要求I至10任一項(xiàng)的方法，其中所述G-CSF組合物包含表面活性劑。
13.提供非糖基化重組人G-CSF的藥物組合物的方法，所述方法包括以下步驟 (a)用乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液和山梨糖醇配制非糖基化重組人G-CSF以獲得水性緩沖G-CSF組合物； (b)將步驟(a)的所述G-CSF組合物冷卻至-15°C或更低的溫度以獲得冷凍G-CSF組合物； (c)將步驟(b)中獲得的所述G-CSF組合物貯藏于所述冷凍狀態(tài)下； (d)將步驟(c)的所述冷凍G-CSF組合物的溫度經(jīng)歷一段時間升至2°C至8°C范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使所述組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為步驟(a)中提供的組合物的G-CSF含量的至少95% ;以及(e)將步驟(d)中獲得的液體組合物灌裝至用于胃腸外用途的初級包裝中 。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于非糖基化重組人G-CSF的穩(wěn)定長期貯藏的方法，其中將包含非糖基化重組人G-CSF和山梨糖醇的水性乙酸鹽或谷氨酸鹽緩沖的G-CSF組合物冷卻至-15℃或更低的溫度以獲得冷凍G-CSF組合物，然后將該冷凍組合物貯藏于冷凍狀態(tài)下，然后經(jīng)歷一段時間升溫至在2℃至8℃范圍的溫度，所述時間被調(diào)整以使組合物融化并獲得液體組合物，所述液體組合物的G-CSF含量為起始組合物G-CSF含量的至少95％。
文檔編號A61K47/26GK102946863SQ201180031047
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者K·格勞曼, H·勒奇, T·勞博爾 申請人:桑多斯股份公司