專利名稱：甲狀旁腺激素類似物及其應(yīng)用的制作方法
甲狀旁腺激素類似物及其應(yīng)用
聯(lián)邦政府資助研究的聲明
在國家衛(wèi)生研究院授予的基金DK-11794下，在美國政府的支持下，做出本發(fā)明。 美國政府對本發(fā)明具有某些權(quán)利。技術(shù)領(lǐng)域
通常，本發(fā)明涉及甲狀旁腺激素(PTH)類似物，具體地是在PTH受體上具有長效激動劑活性的那些。這些類似物可用于治療其中期望長效活性的疾病，如甲狀旁腺功能減退。
背景技術(shù)：
PTH (1-34)是骨質(zhì)疏松癥和PTH缺乏病癥，即甲狀旁腺功能減退的治療中有效的治療劑。甲狀旁腺功能減退是由甲狀旁腺的甲狀旁腺激素(PTH)產(chǎn)生不足所表征的終身疾病(life-long disease)。因?yàn)镻TH是調(diào)節(jié)鈣和磷酸鹽水平的關(guān)鍵，PTH的損失減少血液和骨中的鈣水平和增加磷酸鹽水平(血鈣過少和血磷酸鹽過多)。血鈣過少導(dǎo)致癥狀如神經(jīng)肌肉興奮性，包含感覺異常、肌肉顫搐、喉部痙攣(其可導(dǎo)致不能說話和不能向醫(yī)療服務(wù)者 (health providers)提供潛在醫(yī)學(xué)病癥的警報，其導(dǎo)致延遲的或錯誤的治療)、以及可能手足抽搐和痙攣。它僅僅是內(nèi)分泌紊亂，其中缺少的激素(即PTH)還沒有用作治療。
已經(jīng)鑒別PTH( 1-34)為甲狀旁腺功能減退的骨化三醇治療(calcitriol therapy) 的安全的和有效的替代方式，且能夠在沒有高I丐尿癥(hypercalciuria)的情況下,維持正常的血清鈣水平(Winer 等人，J Clin Endocrinol Metab 88:4214-4220,2003)。但是， 多肽每天需要至少兩次的注射，因此，已經(jīng)認(rèn)為在這種疾病中需要長效PTH (1-34)類似物 (Winer等人,上文)。
因而，需要另外的PTH受體激動劑，特別是在PTH受體上具有長效活性的那些。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及PTH和PTHrP類似物的開發(fā)(發(fā)展,development)。此處描述的典型的多肽，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK在體外和體內(nèi)對PTH受體具有長效活性，且在中性水溶液中表現(xiàn)高的溶解性。因此，本發(fā)明的多肽適于其中期望長效活性的疾病的治療，包含甲狀旁腺功能減退(hypoparathyro i di sm)。
因此，本發(fā)明特征在于多肽(例如，分離的)，或其藥學(xué)可接受的鹽，包含式⑴的氨基酸序列
X01-Val_X03_Glu_I I e_Gln_Leu_X08_Hi S-X1Q-X1 ^X12-X13-X14-X15-Xl6-X17-Xl8-Ar g_Arg -Arg-X22-Phe-Leu-X25-X26-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1le (I)
其中X01 是 Ser、Ala、或 Aib ；X03 是 Ser、Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn、Ala、VaK Asp、lie、Glu、或 Gln ；Xn 是 Leu、Ala、VaK Met、Lys、Arg、Har、或 Trp ；X12 是 Gly、Ala、His、或 Arg ；X13 是 Lys、Ala、Leu、Gin、Arg、His、或 Trp ；X14 是 His、Leu、Arg、 Phe、Trp、或 Ser ；X15 是 lie 或 Leu ；X16 是 Gln 或 Asn ；X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala、Leu、Met、Glu、Ser、或 Phe ；X22 是 Ala、Phe、Glu、Ser、Leu、Asn、Trp、或 Lys ；X25 是 His、Arg、Leu、Trp、 或 Lys ;和 X26 是 Lys、His、Ala、Ser、Asn、或 Arg ;或包含式(I)的氨基酸 1-28、1-29、1-30、 1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35的它的片段，條件是至少一個X18不是Leu或Met，X22不是 Phe, X26 不是 His。
在某些實(shí)施例中，多肽包含式(II)
X01-Val_X03_Glu_I le_Gln_Leu_X08_His_X10_Xn_X12_Lys_X14_X15_X16_X17_X18_Arg_Ar g-Arg-X22-Phe-Leu-HiS-X26-Leu-1Ie-Ala-Glu-1Ie-His-Thr-Ala-Glu-1Ie(II)
其中X01 是 Ser、Ala、或 Aib ；X03 是 Ser、Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn、Gin、或 Asp ；Xn 是 Leu、Arg、Har、或 Lys ；X12 是 Gly 或 Ala ；X14 是 His、Trp、或 Ser ；X15 是 lie 或 Leu ；X16 是 Gln 或 Asn ；X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala 或 Leu ；X22 是 Ala 或 Phe ;和 X26 是 Lys 或 His ;或包含式(II)的氨基酸 1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的它的片段。
在其他實(shí)施例中，多肽包含式(III)
X01-Val_X03_Glu_I I e_Gln_Leu_X08_Hi S-X1Q-X1「X12_Ly s_X14_I I e_X16_X17_X18_Arg_A rg-Arg-X22-Phe-Leu_Hi S-X26-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1Ie(III)
其中X01 是 Ser、Ala、或 Aib ；X03 是 Ser、Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn 或 Gln ；Xn 是 Leu、Arg、或 Har ；X12 是 Gly 或 Ala ；X14 是 His 或 Trp ；X16 是 Gln 或 Asn ； X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala 或 Leu ；X22 是 Ala 或 Phe ;和 X26 是 Lys 或 His ;或包含式(III) 的氨基酸 1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的它的片段。
在任一上述多肽的具體實(shí)施例中，Xtll和Xtl3是Ala ;X1(I是Gln 311是八找312是么1& ； 和X14是Trp。在其他實(shí)施例中，X01是Ala ；X03是Aib ；X10是Gln ；Xn是Har ；X12是Ala ;和 Xi4是Trp。在任一上述多妝中，X18可以是Ala ；X22可以是Ala ;和/或X26可以是Lys。
在某些實(shí)施例中，多肽基本上相同于上述描述的多肽(例如，至少90%或95%相同) (例如，其中X18和X22是Ala和其中X26是Lys)。在某些實(shí)施例中，如與SP-PTH比較，多肽在中性水溶液中(例如，pH為7. 4的磷酸鹽緩沖鹽(PBS))表現(xiàn)更高的溶解性(例如，如與在酸性溶液(例如，pH為1、2、3、4，如IOmM乙酸(pH為2. 9))中比較，至少40%、50%、60%、70%、 80%、90%、或95%溶于中性水溶液中)。在某些實(shí)施例中，多肽是生物學(xué)上活性的多肽(例如， PTH受體激動劑)。在某些實(shí)施例中，多肽以比hPTH (1-34)高的親和力結(jié)合到人類PTH-1 受體的R°狀態(tài)(R°state)上。在其他實(shí)施例中，多肽的長度小于200、150、100、75、50、40、 39、38、或37個氨基酸。可在它的C-末端酰胺化多肽。
在具體的實(shí)施例中，多肽包含或是以下氨基酸序列
Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-A Ia-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie，
或包含所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的它的片段。在另一個實(shí)施例中，多肽包含或是以下氨基酸序列Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-L eu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1Ie-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Ly s-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1Ie，
或包含所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的它的片段。在其他實(shí)施例中，多肽包含或是選自由下列序列組成的組的氨基酸序列
Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-N Ie-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1le ；A Ia-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Ar g-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1Ie-His-Thr-Ala-Glu-1Ie ;Ala-Val_Aib -Glu-1le-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1le ;和
Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-A Ia-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie，
或其包含所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的片段。
可在它們的C-末端酰胺化上述描述的任一多肽。
本發(fā)明特征也在于包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物(例如，上述或此處描述的任何多肽)和藥學(xué)上可接受的載體。
在某些實(shí)施例中，通過固相合成來合成或重組地生產(chǎn)本發(fā)明的多肽。
本發(fā)明特征還在于用于治療受試者的方法，其中所述受試者具有，例如，選自由甲狀旁腺功能減退、血磷酸鹽過多、骨質(zhì)疏松癥、骨折修復(fù)(fracture repair)、骨軟化、關(guān)節(jié)炎、和血小板減少癥組成的組的疾病。該方法包含給予受試者足夠治療疾病的量的本發(fā)明的多肽或包含本發(fā)明的多肽的藥物組合物。例如，可皮下地、靜脈內(nèi)地、鼻內(nèi)地、經(jīng)肺部地、 經(jīng)皮地、和口服地給予多肽或藥物組合物。
本發(fā)明特征還在于包含編碼本發(fā)明的多肽的序列的核酸?？刹僮鞯貙⒑怂徇B接到啟動子上。核酸可以是載體的部分。本發(fā)明特征還在于包含載體的細(xì)胞，以及通過在其中表達(dá)編碼的多肽的條件下培養(yǎng)細(xì)胞來生產(chǎn)多肽的方法。
就“受試者”來說，意味著人或非人動物(例如，哺乳動物)。
就“治療”來說，意味著，與未經(jīng)治療的等同對照比較，在患有病癥或疾病的受試者 (例如，診斷具有甲狀旁腺功能減退的受試者)中改善病癥或疾病的至少一個癥狀。如通過任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測量，癥狀的這種減輕(例如，血液鈣水平的減少或血清磷酸鹽水平的增加) 至少是 5%、10%、20%、40%、50%、60%、80%、90%、95%、或 100%。
就“純化的多肽”或“分離的多肽”來說，意味著已經(jīng)和其他成分分離開的多肽。一般，當(dāng)按重量計，它至少是30%不含其他成分時，多肽是基本上純的。在某些實(shí)施例中，按重量計，制品至少是50%、60%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%不含其他成分。例如，可通過從天然來源提??；通過編碼這樣的多肽的重組多聚核苷酸的表達(dá)；或通過化學(xué)方法合成多肽獲得純化的多肽?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒y量純度，例如，柱層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、或通過HPLC分析。
就“生物學(xué)上活性”來說，意味著，化合物或組合物(例如，此處描述的多肽)在給予細(xì)胞或動物(例如，人或非人哺乳動物)之后具有至少一種生物學(xué)上顯著的效應(yīng)。PTH、 PTHrP、和其類似物(例如，此處描述的那些)的生物活性包含，但不限于，受體結(jié)合、cAMP或 IP3生產(chǎn)、蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C、磷脂酶D、和磷脂酶A2活化、細(xì)胞內(nèi)的改變(例如，增加或減少)、血漿、或尿鈣或磷酸鹽水平、和體內(nèi)或體外骨新陳代謝或分解代謝中的改變。與適當(dāng)?shù)膶φ?例如，野生型多肽或它的擬表型如PTH (1-34)或PTHrP (1_36))比較，例如，本發(fā)明的生物學(xué)上活性的多肽(例如，此處描述的任何多肽)，在任何生物活性中可表現(xiàn)增加(例如，至少 5%、10%、25%、50%、100%、500%、1000%、10，000%)或減少(例如，95%、90%、 75%、50%、25%、10%、5%、1%、0· 1%、0· 01%、或 O. 001%)。
就“基本上相同”來說意味著，例如，當(dāng)利用下面描述的方法最佳地比對時，核酸或氨基酸序列與第二個核酸或氨基酸序列，例如，PTH或PTHrP序列或它的片段共有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性?！盎就?丨生(substantial identity)”可用于涉及序列的各種類型和長度,如全長序列、抗原表位或免疫原性肽、功能結(jié)構(gòu)域、編碼和/或調(diào)控序列、外顯子、內(nèi)含子、啟動子、和基因組序列。以本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方式測定兩個多肽或核酸序列之間的百分比同一性，例如， 利用公開可用的計算機(jī)軟件如 Smith Waterman Alignment (Smith et al. , J Mol Biol 147:195-7，1981);如包括在 GeneMatcher PlusTM, Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof,M. 0. , Ed pp 353-358 中的“Best Fit”(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489，1981) ;BLAST 程序(Basic Local Alignment Search Tool;(Altschul et al. , J Mol Biol 215:403-10,1990)、 BLAST-2、BLAST-P, BLAST-N、BLAST-X、WU-BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、CLUSTAL、或 Megalign(DNASTAR)軟件。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定關(guān)于測量比對的適當(dāng)?shù)膮?shù)，包含在被比較的序列長度上，以達(dá)到最大比對所需要的任何算法。通常，關(guān)于蛋白質(zhì)、比較序列的長度將至少是6個或8個氨基酸，優(yōu)選地9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、40、50、60、70、80、90、100、125、150、 200、250、300、350、400、或500個氨基酸或更多達(dá)到蛋白質(zhì)的整個長度。關(guān)于核酸，通常，比較序列的長度將至少是 18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、69、72、 75、78、81、84、87、90、93、96、99、102、105、108、111、125、150、200、250、300、350、400、450、 500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200、或至少 1500 個核苷酸或更多達(dá)到核酸分子的整個長度。應(yīng)該理解，當(dāng)將DNA序列和RNA序列比較時，為了測定序列同一性的目的，胸腺嘧啶核苷相當(dāng)于尿嘧啶核苷。保守的取代一般包含在下列組內(nèi)的取代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天門冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸； 賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
就“中性pH”來說意味著約6-9的pH (例如，6. 5_8. 0)。具體的中性pH值包含 6. 5,6. 6,6. 8,7. 0,7. 2,7. 4,7. 6,7. 8、和 8. O。
從下列具體實(shí)施方式
、附圖、和權(quán)利要求將顯然可見本發(fā)明的特征和優(yōu)勢。


圖1A和IB是顯示PTH類似物對在R° (圖1A)和RG (圖1B)中的大鼠PTHRl構(gòu)型的結(jié)合親和力的圖表。如示出的，SP-PTH-AAK對受體的Rtl和RG形式都表現(xiàn)最強(qiáng)的結(jié)合。 PTH (1-34)對受體的R°形式表現(xiàn)最弱的結(jié)合。每一圖表下方示出曲線擬合參數(shù)。
圖 2 是顯示在 MC3T3-E1 細(xì)胞中，對 PTH (1-34)、SP-PTH、SP-PTH-AAK、Aib-SP_PTH、 和Aib-SP-PTH-AAK的cAMP響應(yīng)的圖表。每一圖表下方示出曲線擬合參數(shù)。
圖 3 是在利用 PTH (1-34)、SP-PTH、SP-PTH-AAK, Aib-SP-PTH、Aib-SP-PTH-AAK、或 PTH(3-34)處理之后，顯示在利用cAMP-響應(yīng)元件-熒光素酶基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的MC3T3-E1細(xì)胞中的發(fā)光的圖表。圖表下方示出曲線擬合參數(shù)。
圖4A和4B是顯示cAMP刺激和R0 (圖4A)或RG (圖4B )結(jié)合之間的相關(guān)性的圖表。
圖 5A 和 5B 是顯示 PTH (1-34)、SP-PTH、SP-PTH-AAK、Aib-SP-PTH、和 Aib-SP-PTH-AAK對人類PTH-1受體的R° (圖5A)和RG (圖5B)形式的結(jié)合親和力的圖表。 每一圖表下方示出曲線擬合參數(shù)。
圖 6 是顯示 PTH (1-34)、SP-PTH、SP-PTH-AAK、Aib-SP-PTH、和 Aib-SP-PTH-AAK 對在HKRK-B7細(xì)胞上表達(dá)的人類PTH-1受體的cAMP刺激的圖表。
圖7A和7B是顯示在沖掉配體之后，cAMP刺激的圖表。圖7A顯示pmol/孔的cAMP 產(chǎn)生，以及圖7B顯示關(guān)于每一配體針對最大cAMP刺激而標(biāo)準(zhǔn)化的這些結(jié)果。
圖8A-8E 是顯示接受媒介物(vehicle)、或 5nmol/kg PTH(1-34)、SP-PTH、 SP-PTH-AAK、Aib-SP-PTH、或 Aib-SP-PTH-AAK 的 0-8 小時(圖 8A)或 0-30 小時(圖 8B)的皮下注射的小鼠中的血鈣水平的圖表。在圖8C (0-24小時)
和圖8D (0-54小時)中，顯示關(guān)于以lOnmol/kg皮下注射肽的相似結(jié)果。也顯示了在禁食條件下來自相似實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖 8E)。
圖9是顯示用于測量血鈣、血清磷酸鹽水平、和在TPTX大鼠的尿中鈣-對-肌氨酸酐比率的實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。
圖10A-10E 是顯示在給予媒介物、SP-PTH、SP_PTH_AAK、Aib_SP_PTH、或 Aib-SP-PTH-AAK的TPTX大鼠中血鈣(圖10A)和血清無機(jī)磷酸鹽(圖10B)響應(yīng)的圖表。將模擬操作的大鼠(sham operated rat)顯不為對照。也提供了1. 25和5nmol/kg的SP-PTH 與1.25、5和20鹽01/1^的？1'!1(1-34)比較的相似的實(shí)驗(yàn)(圖10C)。也顯示了利用IOnmol/ kg PTH (1-34)或SP-PTH靜脈注射的正常大鼠中的藥物動力學(xué)概況(圖10D)。也顯示了在利用 24. 3nmol/kg hPTH (1-34)、hPTH (1-84)、或 SP-PTH-AAK 靜脈地注射的 TPTX 大鼠中的藥物動力學(xué)概況(圖10E)。
圖1IA是顯示在接受SP-PTH或SP-PTH-AAK靜脈注射的食蟹猴(獼猴)中，用于測量血清和尿鈣和磷酸鹽水平的實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。
圖1lB是顯示在靜脈注射lnmol/kg之后，猴中的SP-PTH的血漿濃度的圖表。
圖12A-12C 是顯示在接受媒介物、SP-PTH、SP-PTH-AAK、或 PTH (1-34) (*Ρ〈0· 05， vs.媒介物；#P〈0.01 vs.媒介物)注射的食蟹猴中的血清鈣(圖12A和12C)和血清磷酸鹽(圖12B)的圖表。圖12A和12B顯示利用靜脈地注射的0. 25nmol/kg的SP-PTH或 SP-PTH-AAK、或媒介物對照的結(jié)果。圖12C顯示在40-倍增加的PTH (1_34)劑量(IOnmol/ kg)皮下注射之后的血清鈣濃度。
圖13A和13B是顯示在接受媒介物、SP-PTH、或SP_PTH_AAK (*P〈0. 05, vs.媒介物；**P〈0. Olvs.媒介物)靜脈注射的食蟹猴中的尿鈣(圖13A)和尿磷酸鹽(圖13B)肌氨酸酐比率的圖表。
圖14 是顯示在接受媒介物或 2. 5nmol/kg 或 10nmol/kg 的 SP-PTH 或 SP-PTH-AAK 的食蟹猴中，用于測量血清鈣和血清磷酸鹽水平的實(shí)驗(yàn)方案的示意圖。
圖15A-15H 是顯示在接受媒介物、2. 5nmol/kg 或 I Onmo I/kg 的 SP-PTH-AAK、 IOnmoI/kg的PTH (1_34)、或10nmol/kg的PTH (1_84)的食蟹猴中的血清和尿鈣和磷酸鹽水平和血清肌氛酸野水平的圖表。圖15A顯不血清I丐水平，圖15B和15C顯不血清無機(jī)憐酸鹽水平。圖MD顯示血清肌氨酸酐水平。圖15E和15G顯示尿鈣水平，圖15F和15H顯示尿磷酸鹽水平。
圖16A和16B是顯示多肽在pH為7. 4的PBS溶液中的溶解性的圖表。
圖16C顯示SP-PTH-AAK在5、25、和40°C下在磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中和IOmM 乙酸中的穩(wěn)定性。與開始樣品比較，通過rPHPLC測量樣品中剩余的完整SP-PTH-AAK肽的量。
圖17A和17B是顯示在表達(dá)野生型或磷酸化-缺陷型(I3D)PTH受體的小鼠中，PTH (1-34)(圖17A)和M-PTH (1-28)(圖17B)對血鈣水平的影響的圖表。
圖18A和18B是顯示在表達(dá)野生型或H) PTH受體的小鼠中，PTH (1-34)(圖18A) 和M-PTH (1-28)(圖18B)對血液cAMP水平的影響的圖表。
圖19是顯示在表達(dá)野生型或ro PTH受體的小鼠中，SP-PTH-AAK對血鈣水平的影響的圖表。
圖20A-20D是顯示在TPTX大鼠中，每天一次的SP-PTH對血清和尿Ca的影響的圖表。通過利用媒介物(模擬品(sham )和TPTX )、或SP-PTH (1、2、4、或8nmo I /kg )、或利用I,25 (OH) 2D (O. 075或O. 2 μ g/kg. orn) sc.注射，每天一次處理TPTX和模擬-對照大鼠， 處理10天。在第10天最后注射之后，將大鼠放置在新陳代謝籠中，在8 (圖20A)和24小時(圖20B)獲得頸靜脈血；以時間間隔0-8 (圖20C)和8-24小時(圖20D)收集尿；平均值土 s. e. m:n=5 ;‘ ，P vs 媒介物〈005。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明涉及在PTH受體上具有延長的活性的新的甲狀旁腺激素(PTH)類似物。 通過 SP-PTH-AAK ([Ala1’3’12’18’22, Gln10, Arg11，Trp14，Lys26] PTH (1-14)/PTHrP (15-36))和 Aib-SP-PTH-AAK (Ala1’12’18’22，Aib3，Gln1。，高 Arg11, Trp14, Lys26] PTH (1-14) /PTHrP (15-36)) 例示這些類似物。如下面描述的，在體外，這些多肽以比PTH (1-34)和其他參考多肽高的親和力結(jié)合到PTH-1受體(PTHRl)的非-G蛋白偶聯(lián)的(、結(jié)合的，coupled) Rtl構(gòu)型上。因此，這些多肽在培養(yǎng)的細(xì)胞中誘導(dǎo)延長的cAMP信號響應(yīng)。與PTH (1-34)或其他測試類似物比較，這些多肽在實(shí)驗(yàn)室測試動物(小鼠、大鼠、和猴)中的血液離子化的鈣水平中也表現(xiàn)延長的增加。由于它們在體內(nèi)證實(shí)的長效性能，這些類似物對于諸如甲狀旁腺功能減退的病癥的治療具有效用。
典型的多肽，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK，包含基于人類PTH (1-14)序列的 N-末端部分和基于人類PTHrP序列(參考下面表I)的C-末端部分，具有含有親和力_增強(qiáng)的氨基酸替代(取代，substitution)的N-和C-末端部分。如下面實(shí)例中說明的,這些多肽在體外表現(xiàn)令人驚訝的高結(jié)合親和力和cAMP信號效力，以及體內(nèi)增強(qiáng)的功能效應(yīng)。最后，如下面描述的，與野生型PTH (1-34)多肽比較，這些多肽表現(xiàn)高的溶解性?；谶@些性能，這些多肽可用于其中期望延長的對PTH受體的活性的任何應(yīng)用，例如，用于甲狀旁腺功能減退的治療。
PTH激動劑的R° vs. RG結(jié)合
如PCT公開WO 2009/017809中描述的，識別了 PTH受體的新的“R°”狀態(tài)，其中受體不結(jié)合到它的G-蛋白上，但是能夠進(jìn)行激動劑結(jié)合。先前已經(jīng)認(rèn)為，可區(qū)分G-蛋白-偶聯(lián)的受體的兩種形式結(jié)合到G-蛋白上的形式(RG)和不結(jié)合到G-蛋白上的形式(R)15GPCR 信號(傳導(dǎo))需要通過受體直接地激活G-蛋白，例如，必須形成RG狀態(tài)，且可通過激動劑配體的結(jié)合誘導(dǎo)這種RG形成。激動劑配體的結(jié)合誘導(dǎo)或穩(wěn)定RG狀態(tài)，反過來，RG狀態(tài)穩(wěn)定激動劑的高親和力結(jié)合。在結(jié)合GTP，或非-可水解的GTP類似物，例如，GTP Y S之后， 將從受體分離受體-偶聯(lián)的G蛋白，引起受體恢復(fù)到低親和力狀態(tài)?，F(xiàn)在，已經(jīng)公認(rèn)某些 GPCR，象PTHR，可形成新的狀態(tài)(R°)，其可在有GTP y S的情況下，因此，甚至在受體預(yù)期不結(jié)合G蛋白時，也可以高親和力結(jié)合某些激動劑配體?；赗°狀態(tài)的這種發(fā)現(xiàn)，PCT公開WO 2009/017809描述了，除了以高親和力結(jié)合RG狀態(tài)之外，以高親和力結(jié)合到R°狀態(tài)上的配體，比以較低的親和力結(jié)合到R°上的配體具有更長的活性半衰期。這種延長的活性不依賴于配體在體內(nèi)的生物利用度或藥物代謝動力學(xué)。相應(yīng)地，具有短的作用持續(xù)時間的激動劑對于受體的R°形式具有較低的親和力。
如下面實(shí)例中描述的，與在體外的hPTH (1-34)比較，SP-PTH-AAK和 Aib-SP-PTH-AAK對PTH受體的R°形式表現(xiàn)顯著更高的結(jié)合，在體外和體內(nèi)表現(xiàn)長效活性。 因此，本發(fā)明的多肽適于用作長效PTH激動劑。
制備本發(fā)明的多肽
本發(fā)明的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)適于通過液-相或固-相肽合成和通過利用組合化學(xué)(combination chemistry)的原位合成來生產(chǎn)。具體地，固相肽合成技術(shù)已經(jīng)被成功地用于人類PTH的生產(chǎn)且可用于這些化合物的生產(chǎn)(關(guān)于指導(dǎo)，參考，上文的 Kimura等人和 Fairwell 等人，Biochem. 22:2691，1983)。已經(jīng)在Goud等人 J Bone Min Res6:781, 1991中報道了以相對大規(guī)模生產(chǎn)人類PTH的成功。合成肽的合成方法通常涉及自動化的合成儀和作為固相的適當(dāng)?shù)臉渲膽?yīng)用，其中將樹脂連接到期望的多肽的C-末端氨基酸上。然后通過順序地連接下一個期望的氨基酸的適當(dāng)保護(hù)形式完成N-末端方向的肽延伸，一般利用FMOC-或BOC-基化學(xué)方案，直到完成合成。然后從肽中清除保護(hù)基團(tuán)， 通 常同時從樹脂上分離肽，然后分離肽和利用傳統(tǒng)技術(shù)純化肽，如通過利用乙腈作為溶劑和利用三氟乙酸作為離子配對試劑進(jìn)行反相HPLC。通常在許多出版物中描述這樣的程序， 例如可參考Stewart and Young, iiSolid Phase Peptide Synthesis,，，2nd Edition, Pierce Chemical Company, Rockford, IL(1984)。
也可通過本領(lǐng)域已知的任何方法重組地制備本發(fā)明的多肽。原核(例如,細(xì)菌)和真核(例如，酵母和哺乳動物)表達(dá)系統(tǒng)也可用于生產(chǎn)本發(fā)明的多肽，特別是其中多肽只包含基因組編碼的氨基酸的情況(例如，不是Aib或Har)。
多肽修飾
此處描述的任何多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)可含有一個或更多修飾如N-末端或C-末端修飾。修飾包含乙?；饔?、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、黃素的共價連接、血紅素部分的共價連接、核苷或核苷衍生物的共價連接、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價連接、磷脂酰肌醇的共價連接、交聯(lián)、環(huán)化作用、二硫鍵形成、去甲基化作用、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化(formylation)、Y -羧化作用、糖基化、GPI錨形成、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蘧酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戍烯化(prenylation)、外消旋作用、硒化(selenylation)、硫酸鹽化作用、的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA介導(dǎo)的氨基酸添加到蛋白質(zhì)如精氨?；饔?、和泛素化作用。參考，例如， Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd Ed. , T. E. Creighton, ff. H. Freeman and Company, New York, 1993和Wold, F. ,Posttranslational Covalent Modification of Proteins 中第 1-12 頁，Posttranslational Protein Modifications:Perspectives and Prospects B.C. Johnson, Ed. , Academic Press, New York, 1983 ；Seifter et al. , Methods Enzymol 182:626 646(1990)和 Rattan et al. , Ann NY Acad Sci 663 A & 62(1992)。
本發(fā)明的任何多肽可進(jìn)一步包含異源序列(融合伴侶)，因此形成融合蛋白。融合蛋白可包含融合伴侶如純化和檢測標(biāo)簽，例如，可直接地或間接地檢測的蛋白質(zhì)如綠色熒光蛋白、紅血球凝集素、或堿性磷酸酯酶，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，GAL4或LexA)， 基因活化結(jié)構(gòu)域(例如，GAL4或VP16)，純化標(biāo)簽、或分泌信號肽(例如，前原胰蛋白酶 (preprotyrypsin)信號序列)。在其他實(shí)施例中，融合伴侶可以是標(biāo)簽，如c_myc、多聚組氨酸、或FLAG。每一個融合伴侶可含有一個或更多結(jié)構(gòu)域，例如，促胰島素信號序列和FLAG標(biāo)簽。在其他情形中，融合伴侶是Fe蛋白質(zhì)(例如，小鼠Fe或人Fe)。
治療疾病的方法
可利用此處描述的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)治療PTH機(jī)能不良或鈣或磷酸鹽不平衡關(guān)聯(lián)的任何疾病。多肽可用于治療甲狀旁腺功能減退、血磷酸鹽過多、骨質(zhì)疏松癥、骨折修復(fù)、骨軟化、關(guān)節(jié)炎、或血小板減少癥，或可用于增加受試者的干細(xì)胞活化(mobilization)。給予的任何模式(例如，口服、靜脈內(nèi)的、肌肉的、眼部的、局部的 (topical)、皮膚的、皮下的、和直腸的)可用于本發(fā)明的治療方法。醫(yī)師將決定用于被治療的病人的適當(dāng)?shù)膭┝?，其將部分地依賴于病人的年齡和尺寸、疾病或病癥的嚴(yán)重性、和被治療的具體的疾病或病癥。
藥物組合物的配制(formulation)
可通過任何適當(dāng)?shù)姆绞綄?shí)現(xiàn)此處描述的任何多肽(例如，SP-PTH-AAK和 Aib-SP-PTH-AAK)的給予，其中所述方式實(shí)現(xiàn)治療受試者和疾病病癥的化合物濃度?？稍谌魏芜m當(dāng)?shù)妮d體物質(zhì)中含有任何適當(dāng)量的多肽，通常按重量計以組合物總重量的1-95% 的量存在?？稍谶m于口服、腸胃外(例如，靜脈內(nèi)地或肌肉地)、直腸的、皮膚的、鼻的、陰道的、吸入的、皮膚(貼片)、眼部、或頭顱內(nèi)給予途徑的劑型提供組合物。因而，組合物可以是，例如，片劑、安瓿、膠囊、藥丸、散劑、粒劑、懸浮液、乳劑、溶液、包含水凝膠的凝膠體、軟膏、油膏、膏狀物、膏藥、灌藥(大劑量藥液，drenche)、滲透遞送設(shè)備(osmotic delivery device)、栓劑、灌腸劑、注射劑、移植物、噴霧、或氣霧劑的形式?？梢勒諅鹘y(tǒng)的藥物學(xué)實(shí)踐配制藥物組合物(參考，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition,2000,ed.A.R. Gennaro, Lippincott Williams &ffilkins,Philadelphia, 和 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York)。
可配制藥物組合物從在給予之后立即或在給予之后的任何預(yù)定時間或時間段釋放活性化合物。后面類型的組合物通常被稱為受控釋放制劑，其包含(i)在延長的時段， 在身體內(nèi)形成本發(fā)明試劑基本恒定濃度的制劑；(ii)在延長的時段，在預(yù)定間隔時間(lag time)之后,在身體內(nèi)形成本發(fā)明試劑的基本恒定濃度的制劑；(iii)在預(yù)先確定的時段， 通過維持身體中的試劑相對不變的、有效的水平維持試劑的作用同時伴隨在試劑的血漿水平中的波動關(guān)聯(lián)的不期望的最小副作用的制劑(鋸齒動力學(xué)模式);(iv)局部化試劑作用的制劑，例如，受控釋放組合物鄰近或在患病組織或器官中的空間放置；(V)達(dá)到定量給予的便利的制劑，例如，每周一次或每隔兩周一次給予組合物jP(vi)通過利用載體或化學(xué)衍生物遞送化合物，將試劑的作用靶向具體的靶細(xì)胞類型的制劑。以受控釋放制劑的形式給予化合物對于在胃腸道中具有窄吸收窗口或相對短的生物半衰期的化合物是特別優(yōu)選的。
為了獲得受控釋放，可進(jìn)行多種策略中的任一種，其中釋放的速率超過所討論化合物的新陳代謝的速率。在一個實(shí)例中，通過各種配方參數(shù)和成分的適當(dāng)?shù)倪x擇獲得受控釋放，包含，例如，各種類型的受控釋放組合物和涂層。因而，利用適當(dāng)?shù)馁x形劑將化合物配制到藥物組合物中，其在給予之后，以受控方式釋放化合物。實(shí)例包含單或多單位(unit) 片劑或膠囊組合物、油溶液、懸浮液、乳劑、微膠囊、分子復(fù)合物、微球體、納米顆粒、貼劑 (patch)、和脂質(zhì)體。
腸胃外組合物
可腸胃外地通過注射、灌輸、或移植(皮下的、靜脈內(nèi)的、肌肉的、腹膜內(nèi)的，等等)， 以劑型、制劑、或通過適當(dāng)?shù)倪f送設(shè)備或含有傳統(tǒng)的、無毒的藥學(xué)上可接受的載體和佐劑的植入物給予含有此處描述的多肽(例如，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK)的組合物。這樣的組合物的制劑和配制是藥物制劑領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。
可以單位劑型(例如，單劑量安瓿)，或在含有幾種劑量以及可在其中添加適當(dāng)?shù)姆栏瘎┑男∑恐?參加下文)提供適于腸胃外應(yīng)用的組合物。組合物可以是溶液、懸浮液、乳劑、輸注設(shè)備、或適于移植的遞送設(shè)備的形式，或它可呈現(xiàn)為在使用之前要利用水或另外的適當(dāng)媒介物復(fù)配(復(fù)溶，reconstitute)的干粉。除了活性劑之外,組合物可包含適當(dāng)?shù)哪c胃外可接受的載體和/或賦形劑?；钚詣┛砂谶m于受控釋放的微球體、微膠囊、納米顆粒、脂質(zhì)體等中。此外，組合物可包含懸浮劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、PH-調(diào)節(jié)劑、張性調(diào)節(jié)劑、和/ 或分散劑。
如上述指出的，依照本發(fā)明，藥物組合物可以為適于無菌注射的形式。為了制備這樣的組合物，將適當(dāng)?shù)幕钚詣┤芙庠诨驊腋≡谀c胃外可接受的液體媒介物中。在可接受的媒介物和溶劑中可采用的是水，通過添加適當(dāng)量的鹽酸、氫氧化鈉或適當(dāng)?shù)木彌_液、1，3-丁二醇、林格氏溶液、葡萄糖溶液、和等張的氯化鈉溶液，將水的PH調(diào)整到適當(dāng)?shù)膒H。水性制劑也可含有一種或多種防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、或?qū)αu基苯甲酸正丙酯)。在其中一種化合物僅難溶或微溶于水的情形中，可添加溶解增強(qiáng)劑或增溶劑，或溶劑可包含10-60%w/w的丙二醇等。
下列實(shí)例傾向于解釋而不是限制本發(fā)明。
實(shí)例I
多肽合成
通過Massachusetts General Hospital Biopolymer Core 機(jī)構(gòu)合成典型的妝 [Ala1,12, Aib3, Gln10, Har11, Trp14] PTH (1-14) /PTHrP (15-36)(高效 Aib-PTH: Aib-SP-PTH) 和[Ala1’12’18’22, Aib3，Gln10，Har11，Trp14，Lys26]PTH(1-14)/PTHrP (15-36)(高效 Aib-AAK PTH:Aib-SP-PTH-AAK)ο Aib和Har分別代表α -氨基異丁酸和高精氨酸。
通過Sigma Aldrich (北海道，日本)和 American Peptide Company, Inc.(加利福尼亞，USA)合成典型的肽[Alal^a2jGln10, Arg11, Trp14] PTH (1-14)/PTHrP (15-36)(高 PTH: SP-PTH)和[Ala1’3’12’18’22, Gln10, Arg11，Trp14，Lys26]PTH(1-14)/PTHrP (15-36) (SP-PTH-AAK)。將所有的多肽溶解在IOmM乙酸中，且存儲在_80°C。利用PACE方法(Pace et al. , Protein Science 4:2411-23，1995)或通過氨基酸分析測定多肽濃度。
在下面表I中示出這些多肽中的每一個。
表1.多肽
權(quán)利要求
1.一種多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括式(I)X01_Val_Xo3_Glu_I Ie-G ln_Leu_Xo8_His_X1o_X11_X12_Xi3_Xi4_-^i5_-^i6_-^i7_-^i8_^r S-Arg-Arg_X22_Phe_Leu_X25_X26_Leu_I Ie-Al a_Glu_I I e_Hi s_Thr_A I a_Glu_I Ie (I)X01 是 Ser λ Ala、或 Aib ；X03 是 Ser λ Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn、Ala、Val、Asp、Glu、或 Gln ； X11 是 Leu、Ala、Val、Met、Lys、lie、Arg、Har、或 Trp ；X12 是 Gly、Ala、His、或 Arg ；X13 是 Lys、Ala、Leu、Gin、Arg、His、或 Trp ；X14 是 His、Leu、Arg、Phe、Trp、或 Ser ；X15 是 He 或 Leu ；X16 是 Gln 或 Asn ；X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala、Leu、Met、Glu、Ser、或 Phe ；X22 是 Ala、Pheλ Glu、Ser、Leu、Asn、Trp、或 Lys ； X25 是 His、Arg、Leu、Trp、或 Lys ；以及 X26 是 Lys、His、Ala、Ser、Asn、或 Arg ； 或其包括式(I)的氨基酸 1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的片段，條件是至少一個X18不是Leu或Met，X22不是Phe，以及X26不是His。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，所述多肽包括式(II) X01_Val_Xo3_Glu_I Ie-G In-Leu-X0S-Hi S-X1Q-X1 X-X^-Ly s_X14_Xi5_Xi6_Xi7_-^-18_^r S-Arg-Arg-X22-Phe-Leu-His-X26-Leu_I le-Ala-Glu-1 le-His-Thr-Ala-Glu-1 Ie (II)X01 是 Ser、Ala、或 Aib ；X03 是 Ser、Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn、Gin、或 Asp ；X11 是 Leu、Arg、Har、或 Lys ；X12 是 Gly 或 Ala ；X14 是 His、Trp、或 Ser ；X15 是 He 或 Leu ；X16 是 Gln 或 Asn ；X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala 或 Leu ； X22是Ala或Phe ；以及 X26 是 Lys 或 His ； 或其包括式(II)的氨基酸 1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括式(III)X01 _Va I _X03_G Iu-1le-Gl n_Leu_X08_Hi s_X10_Xn_X12_Lys_X14_I le_X16_X17_X18_Arg_Arg_Arg-X22-Phe-Leu_Hi S-X26-Leu-1le-Ala-Glu-1le-His-Thr-Ala-Glu-1Ie (III)X01 是 Ser、Ala、或 Aib ；X03 是 Ser、Ala、或 Aib ；X08 是 Met、Leu、或 Nle ；X10 是 Asn 或 Gln ；X11 是 Leu、Arg、或 Har ；Xi2 是 Gly 或 Ala ；X14 是 His 或 Trp ；X16 是 Gln 或 Asn ；X17 是 Asp 或 Ser ；X18 是 Ala 或 Leu ； X22是Ala或Phe ；以及 X26 是 Lys 或 His ； 或其包括式(In)的氨基酸 1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或 1-35 的片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的多肽，其中Xtll和Xtl3是Ala;X1(I是Gln ^是八找；X12 是 Ala ；以及 X14 是 Trp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3的任一項(xiàng)所述的多肽，其中Xtll是Ala;Xc 是Aib ;X1(I是Gln ；Xn是 Har ；X12 是 Ala ；以及 X14 是 Trp。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)所述的多肽，其中X18是Ala5X22是Ala;或X26是Lys。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其中X18是Ala；X22是Ala ；以及X26是Lys。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7的任一項(xiàng)所述的多肽，其中與SP-PTH比較，所述多肽在中性水溶液中表現(xiàn)更大的溶解性。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽是PTH受體激動劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽以比hPTH(1-34)更高的親和力結(jié)合到人類PTH-1受體的R°狀態(tài)上。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)所述的多肽，其中所述多肽的長度小于50個氨基酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括氨基酸序列 Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu—Ile—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie， 或其包括所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35的片段。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括氨基酸序列 Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu—Ile—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie ο
14.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括氨基酸序列 Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu—Ile—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie， 或其包括所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35的片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括氨基酸序列 Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-Leu-Met-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu—Ile—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie ο
16.根據(jù)權(quán)利要求1-11的任一項(xiàng)所述的多肽、或其藥學(xué)可接受的鹽，包括選自由以下組成的組的氨基酸序列Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu—Ile—Ala—Glu—Ile—His-Thr-Ala-Glu-1Ie ；Ala-Val-Ala-Glu-1le-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Arg-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1Ie-His-Thr-Ala-Glu-1Ie ；Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-Leu-Nle-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1Ie-His-Thr-Ala-Glu-1Ie ;和Ala-Val-Aib-Glu-1le-Gln-Leu-Leu-His-Gln-Har-Ala-Lys-Trp-1le-Gln-Asp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Phe-Leu-His-Lys-Leu-1le-Ala-Glu-1Ie-His-Thr-Ala-Glu-1Ie, 或其包含所述序列的氨基酸1-28、1-29、1-30、1-31、1-32、1-33、1-34、或1-35的片段。
17.一種藥物組合物，包括權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)所述的多肽和藥學(xué)上可接受的載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)所述的多肽，其中通過固相合成來合成所述多肽。
19.一種用于治療受試者的方法，所述受試者具有選自由甲狀旁腺功能減退、血磷酸鹽 過多、骨質(zhì)疏松癥、骨折修復(fù)、骨軟化、關(guān)節(jié)炎、和血小板減少癥所組成的組中的疾病，所述方法包括給予所述受試者足夠治療所述疾病的量的權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求17所述的藥物組合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中給予的途徑選自由皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺部、經(jīng)皮膚、以及口服所組成的組。
21.—種包括編碼權(quán)利要求1-16的任一項(xiàng)所述的多肽的序列的核酸。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸，可操作地連接到啟動子上。
23.—種載體，包括權(quán)利要求22所述的核酸。
24.一種細(xì)胞，包括權(quán)利要求23所述的載體。
25.一種制造多肽的方法，包括在表達(dá)所述多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，進(jìn)一步包括純化所述多肽。
全文摘要
披露了兩種PTH類似物配體，SP-PTH-AAK和Aib-SP-PTH-AAK，如在體外和體內(nèi)證明的，其對PTH受體具有長效活性。因此，這些多肽特別適用于治療其中期望長效活性的疾病，如甲狀旁腺功能減退。還披露了制備這些類似物多肽的方法。
文檔編號A61K38/29GK103002906SQ201180023887
公開日2013年3月27日 申請日期2011年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者托馬斯·J·加德拉, 約翰·T·波茨, 哈拉爾德·朱佩內(nèi)爾, 岡崎誠 申請人:總醫(yī)院有限公司, 中外制藥株式會社