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一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法

文檔序號(hào):847232閱讀:324來(lái)源:國(guó)知局
專(zhuān)利名稱(chēng):一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法,屬于組織修復(fù)材料的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)
關(guān)節(jié)軟骨缺損是一種常見(jiàn)的疾病,但臨床上一直都沒(méi)有非常有效的治療手段,并且軟骨組織細(xì)胞含量低、不能遷移,還缺乏血管、淋巴和神經(jīng)等,自我修復(fù)能力非常有限。應(yīng)用組織工程的手段構(gòu)建軟骨組織工程支架來(lái)對(duì)軟骨缺損進(jìn)行修復(fù),將是一種非常有潛力的臨床治療方式。膠原是動(dòng)物體細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分,具有良好的生物相容性、生物降解性和弱抗原性,已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的材料之一。透明質(zhì)酸作為天然軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的一種成分,可以特異地與CD44受體結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞與材料之間的相互作用并調(diào)節(jié)細(xì)胞行為,對(duì)軟骨細(xì)胞表型的保持、細(xì)胞增殖、以及細(xì)胞外基質(zhì)多糖的分泌等有著重要的作用, 但是透明質(zhì)酸作為一種多糖,是水溶性的,容易從支架材料中溶出。添加或利用生物活性物質(zhì)制備支架材料越來(lái)越多的應(yīng)用于組織修復(fù)中,以達(dá)到更好的組織修復(fù)效果。水凝膠作為一種可注射的支架,可用于填充任何形狀和尺寸的缺損,并且?guī)?lái)的創(chuàng)傷較小,含有大量的水分,可使溶于其中的物質(zhì)以及低相對(duì)分子質(zhì)量的物質(zhì)從其間滲透擴(kuò)散,以支持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的交換,此外,其特殊的結(jié)構(gòu)特征使得種子細(xì)胞能夠均勻地分布在三維支架材料內(nèi)部,為種子細(xì)胞提供仿生的生長(zhǎng)環(huán)境,它是一種很有優(yōu)勢(shì)的組織修復(fù)材料。目前已有一些軟骨組織工程材料的專(zhuān)利,中國(guó)專(zhuān)利03137617. 7公開(kāi)了一種新型軟骨組織工程用可注射性水凝膠支架。是將引發(fā)劑、助引發(fā)劑、去離子水、生物相容性聚合物的單體按比例相混合配制成均勻溶液,在恒溫水浴中反應(yīng),得到可用于軟骨組織工程的可注射性水凝膠。但該專(zhuān)利公開(kāi)的水凝膠支架中選用了引發(fā)劑、助引發(fā)劑等化學(xué)試劑。 中國(guó)專(zhuān)利02113378. 6公開(kāi)了能移植到體內(nèi)的骨骼材料,其用分子量為8_20萬(wàn)的L-乳酸聚合物和平均長(zhǎng)度5-15mm的聚磷酸鈣纖維,采用熔鑄顆粒浙取法復(fù)合而成。中國(guó)專(zhuān)利 200810150135. 0公開(kāi)了一種含有10% 15%的羥丙基甲基纖維素和濃度為5X IO6軟骨種子細(xì)胞的注射用軟骨組織工程支架材料。若選用自體軟骨細(xì)胞作為軟骨組織工程支架的種子細(xì)胞,由于不能立即得到軟骨細(xì)胞且一次性提取量不大,需傳代培養(yǎng)幾次才能得到足量的種子細(xì)胞,所以這種種子細(xì)胞在臨床中應(yīng)用很不方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料及其制備方法,其特點(diǎn)是該修復(fù)材料選用生物相容性良好的原材料,組分中不包含有化學(xué)凝膠中所添加的引發(fā)劑等,生物相容性和生物降解性良好,具有生物活性,水凝膠前驅(qū)物的流體性能好,易于注射,可以自我塑形,選用的種子細(xì)胞易于提取,便于臨床應(yīng)用。
本發(fā)明的目的有以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn),其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外,均為重量份數(shù)??勺⑸涞年P(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的起始原料由以下組分組成I型膠原100份,透明質(zhì)酸10 50份,優(yōu)選為12 45份,再優(yōu)選為20 40份,再優(yōu)選為30 40 份;其中,透明質(zhì)酸的氧化度為20% 60% ;所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層,復(fù)合材料的厚度為1 5mm??勺⑸涞年P(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的制備方法包括以下步驟(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在步驟( 的透明質(zhì)酸溶液中加入步驟C3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)5 10h,反應(yīng)液用去離子水透析60 96h,冷凍干燥,得到氧化度為20% 60% 的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為3. 15 15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)節(jié)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置6 20h ;(8)用密度梯度離心法分離提取生物體骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞,制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置10 25min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠,具有良好的自我塑形能力。可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料用于關(guān)節(jié)軟骨組織的缺損,組織工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。性能測(cè)試
1.用稱(chēng)重法測(cè)試修復(fù)材料的含水量、降解性能;2.用化學(xué)方法測(cè)試復(fù)合材料中透明質(zhì)酸的有效含量及膠原與透明質(zhì)酸之間的交聯(lián)度;3.種子細(xì)胞包埋在材料中的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),用激光共聚焦顯微鏡觀察種子細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);4.用熒光分光光度法和紫外分光光度法檢測(cè)種子細(xì)胞的增殖情況和基質(zhì)分泌;5.用組織學(xué)染色和免疫組化染色法檢測(cè)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌及特征性軟骨陷窩的形成。結(jié)果表明修復(fù)材料具有很高的含水量,仿似生物體內(nèi)軟骨組織,良好的降解性能,透明質(zhì)酸被有效的固定于修復(fù)材料中;對(duì)種子細(xì)胞的相關(guān)測(cè)試和觀察表明,該復(fù)合材料中的原料組分對(duì)種子細(xì)胞有很好的成軟骨誘導(dǎo)作用,有特征性的軟骨陷窩形成、軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1、生物活性仿生材料膠原和透明質(zhì)酸能夠在關(guān)節(jié)軟骨處原位誘導(dǎo)單核細(xì)胞層中的干細(xì)胞成軟骨分化,分泌軟骨細(xì)胞外基質(zhì),從而構(gòu)建軟骨組織以達(dá)到修復(fù)目的;2、具有可注射性,能在缺損原位注射形成凝膠,對(duì)生物體造成的創(chuàng)傷小,避免造成二次創(chuàng)傷;3、成凝膠性能良好,不需有機(jī)溶劑;4、具有良好的生物安全性和生物相容性,無(wú)細(xì)胞毒性;5、組織學(xué)染色和免疫組化染色顯示,該水凝膠和種子細(xì)胞在體外復(fù)合培養(yǎng)可形成軟骨樣組織,有軟骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)分泌;6、便于臨床操作,制備方法操作簡(jiǎn)單,對(duì)環(huán)境友好。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述,有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明,不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制,該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為10份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為20%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入5ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)5h,反應(yīng)液用去離子水透析60h,冷凍干燥,得到氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸;
(5)將步驟(4)得到的氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為3. 15mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置18h ;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、⑶均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例2采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為20份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為20%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入5ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)5h,反應(yīng)液用去離子水透析60h,冷凍干燥,得到氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為20%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為6. 3mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置IOh ;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例3采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為20份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為40%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入IOml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)8h,反應(yīng)液用去離子水透析72h,冷凍干燥,得到氧化度為40 %的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為40%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為6. 3mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置12h ;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟(8)得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例4采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為50份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為40%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入IOml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)8h,反應(yīng)液用去離子水透析72h,冷凍干燥,得到氧化度為40 %的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為40%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置12h ;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、⑶均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例5采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為10份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為60%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入15ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)10h,反應(yīng)液用去離子水透析96h,冷凍干燥,得到氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為3. 15mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM,緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟(4)的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置他;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。實(shí)施例6采用I型膠原為100份,氧化透明質(zhì)酸為50份;氧化透明質(zhì)酸的氧化度為60%,復(fù)合材料的厚度為3mm。(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0. 003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在20ml步驟⑵的透明質(zhì)酸溶液中加入15ml步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌,反應(yīng)10h,反應(yīng)液用去離子水透析96h,冷凍干燥,得到氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為60%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,IOml步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入2ml步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置他;(8)用密度梯度離心法分離提取日本大耳白兔骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞, 制成密度為IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟⑶得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置15min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到日本大耳白兔關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠。
權(quán)利要求
1.一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料,其特征在于該修復(fù)材料的起始原料由以下組分組成,按重量計(jì)為I型膠原100份,透明質(zhì)酸10 50份;其中,透明質(zhì)酸的氧化度為20% 60% ;所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層,復(fù)合材料的厚度為1 5mm。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的制備方法,其特征在于該方法包括以下步驟(1)在冰水浴中,將膠原溶于濃度為0.003M的鹽酸溶液中,緩慢攪拌,配制成濃度為 9mg/ml的膠原溶液,置于溫度4°C冰箱中靜置;(2)將透明質(zhì)酸粉末溶于超純水中,攪拌使之充分溶解,配制成濃度為10mg/ml的透明質(zhì)酸溶液;(3)將高碘酸鈉粉末避光溶于超純水中,攪拌配制成濃度為20mM的高碘酸鈉溶液;(4)在步驟O)的透明質(zhì)酸溶液中加入步驟(3)的高碘酸鈉溶液,在室溫下避光攪拌, 反應(yīng)5 10h,反應(yīng)液用去離子水透析60 96h,冷凍干燥,得到氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸;(5)將步驟(4)得到的氧化度為20% 60%的氧化透明質(zhì)酸,用超純水溶解,攪拌配成濃度為3. 15 15. 75mg/ml的氧化透明質(zhì)酸溶液,該溶液用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;(6)在冰水浴下,步驟(1)的膠原溶液中加入5XPBS溶液和緩沖液,緩慢攪拌均勻,得到的膠原混合溶液調(diào)PH至中性,其中,5XPBS溶液濃度為0. 05M,緩沖液的成分為 NaOH-NaHCO3-Hepes, NaOH 的濃度為 50mM,NaHCO3 的濃度為 ^OmM,Hepes 的濃度為 200mM, 緩沖液和5XPBS溶液均用0. 22um過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后備用;膠原溶液、5XPBS溶液與緩沖液混合的體積比為7:2:1;(7)在冰水浴下,步驟(6)的中性的膠原混合溶液中加入步驟的氧化透明質(zhì)酸溶液,攪拌均勻,放入溫度4°C冰箱中靜置6 20h ;(8)用密度梯度離心法分離提取生物體骨髓液中整個(gè)單核細(xì)胞層的細(xì)胞,制成密度為 IX IO8個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,從溫度4°C冰箱中取出步驟(7)得到的膠原與氧化透明質(zhì)酸的混合液與所述細(xì)胞懸液混合均勻;(9)上述步驟(5)、(6)、(7)、(8)均在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌操作;(10)將步驟(8)得到的混合液放入溫度37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜置10 25min,得到復(fù)合材料。(11)將步驟(8)得到的混合液注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨組織缺損處,利用生物體組織的生理溫度使之原位形成水凝膠,具有良好的自我塑形能力。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料的用途,其特征在于該關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料用于關(guān)節(jié)軟骨組織的缺損,組織工程及臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種可注射的關(guān)節(jié)軟骨組織修復(fù)材料,其特點(diǎn)是該復(fù)合材料的起始原料由以下組分組成I型膠原100重量份,透明質(zhì)酸10~50重量份,其中,透明質(zhì)酸的氧化度為20%~60%;所述修復(fù)材料內(nèi)包埋有生物體內(nèi)骨髓液中的單核細(xì)胞層,復(fù)合材料的厚度為1~5mm。用高碘酸鈉將透明質(zhì)酸氧化為氧化透明質(zhì)酸;將膠原溶液、5×PBS和緩沖液按7∶2∶1的體積比混合調(diào)節(jié)pH至中性;將氧化透明質(zhì)酸用超純水溶解后加入已調(diào)至中性的膠原溶液中,攪拌均勻,4℃冰箱中靜置;將用密度梯度離心法分離提取的生物體骨髓液中的單核細(xì)胞層與前述膠原-氧化透明質(zhì)酸溶液混合均勻;將混合液放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置或注射到生物體關(guān)節(jié)軟骨缺損處,形成復(fù)合材料。
文檔編號(hào)A61L27/38GK102488925SQ20111045168
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者巖曉麗, 張興棟, 樊渝江, 蔣波, 郭立坤 申請(qǐng)人:成都普川生物醫(yī)用材料股份有限公司
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