白介素-22在治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病中的用途技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及生物和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及白介素-22在治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病中的用途。

背景技術(shù)：
白介素-22(Interleukin-22，IL-22)是一種T細(xì)胞分泌的糖蛋白，又名白介素10誘導(dǎo)的T細(xì)胞因子(IL-10-relatedTcell-derivedinduciblefactor，IL-TIF)。白介素22mRNA的表達(dá)最初證明在小鼠的IL-9刺激后的T細(xì)胞株和IL-9刺激的肥大細(xì)胞株(mastcells)，以及concanavalinA激活后的脾細(xì)胞。人白介素22mRNA的表達(dá)主要在外周自分離的T細(xì)胞并通過(guò)抗CD-3的抗體或ConA刺激。白介素22mRNA在激活后的NK細(xì)胞也有表達(dá)。活化的T細(xì)胞主要是CD4+，特別是由CD28通路的Th1細(xì)胞。白介素-22前體由179個(gè)氨基酸殘基組成(成熟肽為146個(gè)氨基酸殘基)，Dumoutier等最先報(bào)道了克隆小鼠和人的白介素-22基因(Dumoutier，etal，JI，164：1814-1819，2000)。此外，Dumoutier還取得了IL-22的專利(US專利號(hào)6,359,117和6,274,710)。Gurney也取得了IL-22在治療人胰腺病變方面的應(yīng)用專利(US專利號(hào)6,551,799)。白介素-22主要在胸腺、大腦、活化的T細(xì)胞和肥大細(xì)胞、lectin刺激后的脾細(xì)胞(DuroutierJI2002)、白介素-2/白介素-12刺激后的NK細(xì)胞(Wolk，KJI2002)，以及LPS刺激后的多個(gè)器官和組織中表達(dá)(DumoutierPNASpaper)，包括腸道，肝，胃，腎，肺，心臟，胸腺，脾都可測(cè)到IL-22的表達(dá)升高。IL-22通過(guò)結(jié)合IL-22RI受體和IL-10R2受體，發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-22R1是IL-22特異的受體，它表達(dá)在皮膚，腎，消化系統(tǒng)(胰腺，小腸，肝，大腸，結(jié)腸)以及呼吸系統(tǒng)(肺，支氣管)。已公開(kāi)的研究表明，白介素22是一個(gè)免疫調(diào)節(jié)劑。在專利申請(qǐng)白介素-22的醫(yī)藥用途中，已報(bào)道IL-22對(duì)降低血清甘油三酯，肥胖的醫(yī)療用途(見(jiàn)WO2006/073508，CN200510023103.0)。然而，目前并未發(fā)現(xiàn)白介素-22可以在治療神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病中可發(fā)揮積極的作用。神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerativedisease)是大腦和脊髓的神經(jīng)元細(xì)胞漸進(jìn)性變性、死亡的狀態(tài)，是一種慢性、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要包括阿爾茨海默氏病(Alzhemier’sdisease，AD)、帕金森氏病(Parkinson’sdisease，PD)、亨廷頓舞蹈病(Huntingtondisease)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis)，脊髓肌萎縮病(spinalmuscularatrophy)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(spinalcerebellarataxias)等，其共同特征是發(fā)生神經(jīng)元的退行性病變和凋亡，導(dǎo)致病人行為異常和功能障礙，引起過(guò)早死亡的神經(jīng)性疾病。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，至今還沒(méi)有有效的方法和藥物來(lái)防治，現(xiàn)有治療方法包括，通過(guò)服用或靜脈注射補(bǔ)充人大腦神經(jīng)遞質(zhì)治療PD，如左旋多巴，但是，左旋多巴并不能有效的控制PD的自然病變過(guò)程，不能影響多巴胺能神經(jīng)元的變性速度，長(zhǎng)期使用還具有多種不良反應(yīng)，如開(kāi)關(guān)現(xiàn)象和運(yùn)動(dòng)障礙，其治療作用也只能維持兩年左右，長(zhǎng)期使用還可損害神經(jīng)元，加速神經(jīng)元的凋亡；針對(duì)AD腦內(nèi)乙酰膽堿不足，用膽堿酯酶抑制劑提高其濃度，該方法只是對(duì)癥治療，不能控制疾病的發(fā)展。綜上，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)有效的治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物和方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的就是一種有效的治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物及其用途，即白介素-22(Interleukin-22)在治療和預(yù)防哺乳動(dòng)物神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病中的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種白介素-22或其二聚體或多聚體的用途，它用于制備治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的神經(jīng)損傷疾病選自：中風(fēng)、脊柱損傷和伴有血腦屏障損傷的神經(jīng)系統(tǒng)疾??；所述神經(jīng)退行性疾病選自：帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化病、脊髓肌萎縮病、原發(fā)性側(cè)索硬化病、或脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。在另一優(yōu)選例中，所述白介素-22包括：人白介素-22或哺乳動(dòng)物(如鼠、兔、牛、或羊)的白介素-22。在另一優(yōu)選例中，所述白介素-22包括：重組的白介素-22、或天然的白介素-22。在另一優(yōu)選例中，所述的白介素-22的二聚體是式I所示的白介素-22的二聚體：M1-L-M2式I式中，M1是白介素-22的第一單體；M2是白介素-22的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述的IL-22二聚體的血清半衰期是所述第一單體和/或第二單體的血清半衰期的3倍以上、5倍以上或10倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述的接頭元件L選自下組：(i)3-50個(gè)氨基酸的短肽；(ii)式II所示的多肽元件：-Z-Y-Z-式II式中，Y為載體蛋白；Z為無(wú)、或1-30個(gè)氨基酸的短肽；“-”為化學(xué)鍵或共價(jià)鍵。在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是相同的。在另一優(yōu)選例中，所述的第一單體和第二單體是不同的。在另一優(yōu)選例中，所述的生物活性是選自下組的一種或多種活性：(a)在體外激活神經(jīng)元細(xì)胞STAT3；(b)在體內(nèi)腦缺血性損傷后，能保護(hù)神經(jīng)元，減少腦梗死體積；(c)在體外激活多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞STAT3或海馬神經(jīng)元細(xì)胞STAT3；(d)在體內(nèi)能顯著抑制PD模型動(dòng)物黑質(zhì)體多巴胺能神經(jīng)元的丟失；(e)在體內(nèi)能顯著減少AD模型動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是白蛋白或人IgG的Fc片段。在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白是二個(gè)IgG的Fc片段之間通過(guò)二硫鍵連接而形成。在另一優(yōu)選例中，所述二硫鍵的數(shù)量為2-4個(gè)。在另一優(yōu)選例中，所述的“-”是肽鍵。在另一優(yōu)選例中，所述二聚體是由氨基酸序列如SEQIDNO：2-5所示的單體所構(gòu)成的二聚體。在本發(fā)明的第二方面，提供了式I所示的白介素-22的二聚體：M1-L-M2式I式中，M1是白介素-22的第一單體；M2是白介素-22的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種可用于治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病的藥物組合物，它含有藥學(xué)上可接受的載體以及式I所示的白介素-22的二聚體，M1-L-M2式I式中，M1是白介素-22的第一單體；M2是白介素-22的第二單體；L是位于所述的第一單體和第二單體之間的，將所述第一單體和第二單體連接在一起的接頭元件，其中，所述的白介素-22二聚體保持了白介素22的生物活性，并且其血清半衰期是所述第一單體或第二單體的血清半衰期的2倍以上。在另一優(yōu)選例中，所述二聚體是由氨基酸序列如SEQIDNO：3或5所示的單體所構(gòu)成的二聚體。在另一優(yōu)選例中，所述IL-22的二聚體采用以下步驟制備：(a)采用包含編碼IL-22-Fc復(fù)合物的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞。(b)培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和(c)分離純化所述IL-22二聚體。本發(fā)明使用IL-22二聚體分子，一方面在動(dòng)物體內(nèi)缺血性神經(jīng)損傷后，可以保護(hù)神經(jīng)元，從而使損傷的神經(jīng)功能得到恢復(fù)，能夠有效地治療神經(jīng)損傷疾??；另一方面能夠顯著抑制PD模型動(dòng)物黑質(zhì)體多巴胺能神經(jīng)元的丟失，提高多巴胺能神經(jīng)元的功能。此外，IL-22二聚體分子能夠顯著改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，保護(hù)神經(jīng)元，減少海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，減輕癡呆的癥狀。本發(fā)明的二聚體IL-22的血清半衰期延長(zhǎng)，有效阻止神經(jīng)元的丟失，從而能夠更有效地治療神經(jīng)退行性疾病。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附圖說(shuō)明圖1顯示了本發(fā)明一種IL-22二聚體的示意圖。其中，“-”表示連接肽，IL-22橢圓形表示IL-22單體。該IL-22二聚體的一種序列如SEQIDNO：1所示，其中第1-146位為IL-22，第147-162位為連接肽，第163-308位為另一IL-22。圖2A和2B顯示了本發(fā)明IL-22二聚體的示意圖。其中，“-”表示氨基酸連接肽，IL-22橢圓形表示IL-22單體，標(biāo)記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，并且IL-22位于載體蛋白的N-末端。一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fc片段的IL-22單體的序列如SEQIDNO：2所示，其中第1-146位為IL-22，第147-162位為連接肽，第163-385位為人IgG2的Fc片段。二個(gè)帶有Fc片段的IL-22單體，通過(guò)Fc的配對(duì)作用構(gòu)成二聚體。一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fc片段的IL-22單體的序列如SEQIDNO：3所示，其中第1-146位為IL-22，第147-152位為連接肽，第153-375位為人IgG2的Fc片段。二個(gè)帶有Fc片段的IL-22單體，通過(guò)Fc的配對(duì)作用構(gòu)成二聚體。圖3A和3B顯示了本發(fā)明IL-22二聚體的示意圖。其中，“-”表示氨基酸連接肽，IL-22橢圓形表示IL-22單體，標(biāo)記為“C”的橢圓形表示載體蛋白，并且IL-22位于載體蛋白的C-末端。一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fc片段的IL-22單體的序列如SEQIDNO：4所示，其中第1-223位為人IgG2的Fc片段，第224-239位為連接肽，第240-385位為IL-22。二個(gè)帶有Fc片段的IL-22單體，通過(guò)Fc的配對(duì)作用構(gòu)成二聚體。一種用于構(gòu)成該IL-22二聚體的、帶有Fc片段的IL-22單體的序列如SEQIDNO：5所示，其中第1-223位為人IgG2的Fc片段，第224-229位為連接肽，第230-375位為IL-22。二個(gè)帶有Fc片段的IL-22單體，通過(guò)Fc的配對(duì)作用構(gòu)成二聚體。圖4顯示了IL-22和IL-22二聚體(IL-22-Fc)對(duì)激活神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的影響。結(jié)果顯示，IL-22和IL-22二聚體均具有激活神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的生物活性，而且，IL-22二聚體比IL-22具有更顯著的生物活性。圖5顯示了本發(fā)明的IL-22二聚體在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?Focalcerebralischemia)中的治療作用。重組人IL-22二聚體可以顯著地減少腦梗死體積。圖6顯示了本發(fā)明的IL-22二聚體在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?Focalcerebralischemia)中的治療作用。重組人IL-22二聚體可以顯著地改善造模動(dòng)物的神經(jīng)功能。圖7顯示了本發(fā)明的IL-22二聚體、IL-22單體的體外活性分析結(jié)果。具體實(shí)施方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次意外地發(fā)現(xiàn)：白介素-22或白介素-22二聚體在神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出明顯的治療效果。此外，與IL-22單體相比，本發(fā)明的二聚體IL-22能夠延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，改善藥物的動(dòng)力學(xué)，減少注射頻率，并且具有顯著增強(qiáng)的體內(nèi)生物活性。對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的激活作用實(shí)驗(yàn)表明，相對(duì)于IL-22單體，IL-22二聚體在IL-22摩爾終濃度相當(dāng)于IL-22單體的終濃度的1/10時(shí)，可以使神經(jīng)元p-STAT3的信號(hào)水平上升更明顯，因此二聚體有更明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，能夠更有效地治療神經(jīng)損傷疾病；還可有效地阻止神經(jīng)元的丟失，從而能夠更有效地治療神經(jīng)退行性疾病。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列基本相同”是指序列相同或由一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變(缺失、增加、取代)引起的不同，但這種改變基本上不降低其生物學(xué)活性，即可以通過(guò)結(jié)合IL-22靶細(xì)胞受體而發(fā)生生物學(xué)功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-22均包括在本發(fā)明內(nèi)，無(wú)論它是糖基化的(即來(lái)源于天然的或來(lái)源于真核生物表達(dá)系統(tǒng)的)或是非糖基化的(即來(lái)源于原核生物表達(dá)系統(tǒng)或化學(xué)合成的)。術(shù)語(yǔ)“治療”是指基于治愈、緩解、改善、減輕、影響治療對(duì)象疾病、癥狀、疾病體質(zhì)(predisposition)的目的而給予需要治療的對(duì)象本發(fā)明的白介素-22。術(shù)語(yǔ)“治療對(duì)象”是指鼠、人及其他哺乳動(dòng)物。術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指能夠在治療對(duì)象體內(nèi)達(dá)到治療目的的白介素-22的量。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，所述“治療有效量”可隨白介素-22的給藥途徑、所用藥物輔料以及與其他藥物聯(lián)合用藥情況的不同而有所不同。白介素22及其制備如本發(fā)明所用，“白介素-22”或“IL-22”是指一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)(a)具有與Dumoutier等人在USPatentNo.359,117中描述的人/鼠白介素-22基本相同的氨基酸序列和(b)具有與天然白介素-22相同的生物學(xué)活性。本發(fā)明的白介素-22包括，但不限于：人白介素-22、重組人白介素、鼠白介素-22和/或重組鼠白介素-22。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“IL-22”可包括單體、二聚體或多聚體形式的IL-22。“白介素-22”還包括PEG化的IL-22以及共價(jià)修飾的IL-22蛋白質(zhì)。例如，可用各種活化的分子量為5,000～100,000的聚乙二醇(PEG)修飾以使IL-22高分子化，延長(zhǎng)其半衰期。具體操作可參見(jiàn)Greenwaldetal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.1994，4，2465；Calicetietal.，ILFarmaco，1993，48，919；ZalipskyandLee，《聚乙二醇化學(xué)：生物技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用》，J.M.Harris編，PlenumPress，N.Y.，1992。優(yōu)選使用多臂樹(shù)杈型活性PEG(CNZL02101672.0，WO9932139，PCT/US95/0755，PCT/US94/13013，USPat：4,640,835，4,496,689，4,301,144，4,670,417，4,791,192，4,179,337)。本發(fā)明的白介素-22可用基因重組技術(shù)克隆表達(dá)的。表達(dá)的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或者高等真核生物細(xì)胞。適用的原核宿主細(xì)胞包括，但不限于：G+或G-菌，如大腸桿菌E.coli.，能夠通過(guò)公共途徑得到的E.coli.菌株包括：K12MM294(ATCC31,446)、X1776(ATCC31,537)、W3110(ATCC27,325)和K5772(ATCC53,635)等。其他可用的原核細(xì)胞包括但不限于：歐式桿菌(Erwinia)、克雷伯桿菌(Klebsiella)、變形桿菌(Proteus)等。E.coliW3110因其常被用作重組DNA產(chǎn)品的發(fā)酵宿主而被推薦為優(yōu)選。除了原核細(xì)胞，真核細(xì)胞如絲狀真菌(filamentousfungi)或酵母菌(yeast)等同樣適用于表達(dá)或者克隆本發(fā)明的白介素-22。釀酒酵母菌(Saccharomyces)就是一種常用的低等真核宿主微生物，其他宿主如非洲粟酒裂殖酵母菌；克魯維酵母菌；巴氏畢赤酵母菌等。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母菌(Methylotropicyeasts)同樣可用于表達(dá)本發(fā)明的白介素-22，包括但不限于各種能夠在甲醇中生長(zhǎng)的酵母菌如漢遜酵母菌(Hansenula)，念珠菌(Candida)，克勒克酵母菌(kloeckera)，畢赤酵母菌(Pichia)，釀酒酵母菌(Saccharomyces)等。用于表達(dá)糖基化的本發(fā)明的白介素-22的宿主細(xì)胞可來(lái)源于多細(xì)胞有機(jī)體。無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞的例子包括昆蟲(chóng)細(xì)胞如DrosophilaS2和SpodopteraSf9，植物細(xì)胞。適用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)，COS細(xì)胞。特別是，經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1細(xì)胞株(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚胎腎細(xì)胞株293等。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何選擇合適的宿主細(xì)胞。上述宿主細(xì)胞經(jīng)白介素-22表達(dá)載體或克隆載體轉(zhuǎn)染或者轉(zhuǎn)化后可在傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)基(nutrientmedia)中培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)基經(jīng)修飾后適于誘導(dǎo)啟動(dòng)子(promoter)、選擇性轉(zhuǎn)化體(selectingtransformant)或者擴(kuò)增白介素-22編碼基因序列。培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、溫度、pH等的選擇對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)則是應(yīng)知的。如何使細(xì)胞培養(yǎng)繁殖力最大化的一般原則、方案以及操作技術(shù)可參見(jiàn)MammalianCellBiotechnology：aPracticalApproach，M.Butler，ed.(IRLPress，1991)andSambrooketal.，supra。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)熟知真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，例如CaCl2法、磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體媒介法或電穿孔法。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞的不同，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可選擇相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化技術(shù)，例如CaCl2法(Sambrooketal.，supra.)或電穿孔法通常用于原核細(xì)胞；對(duì)于沒(méi)有細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，則可以使用磷酸鈣沉淀法。編碼本發(fā)明的白介素-22的核苷酸序列(即cDNA或基因組DNA)可被插入一可復(fù)制載體(replicablevector)進(jìn)行基因克隆(DNA擴(kuò)增)或者表達(dá)。各種載體如質(zhì)粒、粘粒(cosmid，裝配型質(zhì)粒)、病毒顆?；蚴删w等均可通過(guò)公共途徑獲得。運(yùn)用本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可將本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列按常規(guī)步驟插入可復(fù)制載體上適宜的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。本發(fā)明的白介素-22不但可以通過(guò)基因重組直接表達(dá)，也可以通過(guò)與異種多肽形成融和多肽的方式生產(chǎn)，后者可以是一段位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的信號(hào)序列，也可以是位于成熟蛋白質(zhì)或多肽N端的具有特異性切割位點(diǎn)的其他多肽片段。通常情況下，這段信號(hào)序列是上述可復(fù)制載體的一部分，或者它也可以是插入可復(fù)制載體的本發(fā)明的白介素-22編碼核苷酸序列的一部分。表達(dá)載體和克隆載體均含有一段核苷酸序列，該序列使載體能夠在一個(gè)或多個(gè)相應(yīng)的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。與各種細(xì)菌、酵母或病毒宿主細(xì)胞對(duì)應(yīng)的核苷酸序列為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。例如，質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)G-細(xì)菌，2.mu.質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)適用于酵母細(xì)胞，而各種病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40，多形瘤病毒，腺病毒，VSV或BPV)則適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的克隆載體。表達(dá)載體和克隆載體通常含有一段選擇基因，又名“選擇標(biāo)記”。典型的選擇基因編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(a)對(duì)某些抗生素或毒素如氨芐青霉素，新霉素，氨甲蝶呤，四環(huán)素等具有抗性；(b)能彌補(bǔ)營(yíng)養(yǎng)缺陷型缺乏(auxotrophicdeficiencies)(c)補(bǔ)充復(fù)合型培養(yǎng)基不能提供的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如桿菌宿主細(xì)胞需要的D-丙氨酸消旋酶的編碼基因。適用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的選擇基因應(yīng)該可以將有能力吸納本發(fā)明的白介素-22編碼基因的宿主細(xì)胞區(qū)分出來(lái)，如DHFR或胸(腺嘧啶核)苷激酶。適用的以野生型DHFR為選擇基因的宿主細(xì)胞是無(wú)DHFR活性的CHO細(xì)胞株，該細(xì)胞株的制備及繁殖方法可參見(jiàn)Urlaubetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)。適用于酵母細(xì)胞的選擇基因是在酵母質(zhì)粒Yrp7中表達(dá)的trpl基因(Stinchcombetal.，Nature，282：39(1979)；Kingsmanetal.，Gene，7：141(1979)；Tschemperetal.，Gene，10：157(1980))。trpl基因可用于篩選不能在色氨酸中生長(zhǎng)的酵母菌突變株如ATCCNo.44047或PEP4-1(Jones，Genetics，85：12(1977))。表達(dá)載體和克隆載體通常含有一個(gè)可人工操縱地連接到本發(fā)明的白介素-22編碼核苷酸序列上的啟動(dòng)子，以指導(dǎo)mRNA的合成。與各種宿主細(xì)胞對(duì)應(yīng)的啟動(dòng)子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知。適用于原核宿主細(xì)胞的啟動(dòng)子包括β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)等。細(xì)菌宿主細(xì)胞啟動(dòng)子同樣包含一段可人工操縱地連接到本發(fā)明的白介素-22編碼基因序列的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。通過(guò)在可復(fù)制載體中插入增強(qiáng)子可增強(qiáng)本發(fā)明的白介素-22的編碼核苷酸序列在高等真核生物表達(dá)體系中的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是一種DNA分子的順式作用元件，通常為10到300個(gè)bp，通過(guò)作用于啟動(dòng)子而增強(qiáng)DNA分子的轉(zhuǎn)錄。真核宿主細(xì)胞(酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、人類(lèi)細(xì)胞，或者來(lái)源于其他多細(xì)胞有機(jī)體的有核細(xì)胞)中的表達(dá)載體同樣含有中止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所需的核苷酸序列。此類(lèi)序列通常取自真核或者病毒DNA或cDNA非翻譯區(qū)的5’端，有時(shí)也可取自3’端。所述“非翻譯區(qū)”包含的核苷酸片段可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生位于本發(fā)明的白介素-22mRNA非翻譯區(qū)的聚腺苷?；?。其他可在重組脊椎動(dòng)物培養(yǎng)體系中用于合成本發(fā)明的白介素-22的方法、載體和宿主細(xì)胞可參見(jiàn)Gethingetal.，Nature，293：620-625(1981)；Manteietal.，Nature，281：40-46(1979)；EP117,060；以及EP117,058。IL-22二聚體本發(fā)明的IL-22二聚體的結(jié)構(gòu)如式I所示。代表性的結(jié)構(gòu)如圖1-3中所示。其中，載體蛋白包括(但并不限于)是指人IgG(1，2，3，4)的Fc片段、或人白蛋白(albumin)。IL-22位于可用載體蛋白的C-末端，也可用位于載體蛋白的N-末端。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“連接肽”(linker)指位于IL-22單體和IL-22單體之間的、起連接作用的短肽。連接肽的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制。連接肽的長(zhǎng)度通常為5-50個(gè)氨基酸。通常，連接肽不影響或不顯著影響IL-22單體和IL-22單體形成正確的折疊和空間構(gòu)象。一些連接肽的例子包括(但并不限于)：較佳地，所述的連接肽具有選自下組的氨基酸序列：(a)疏水性氨基酸Gly和Pro構(gòu)成的3-16個(gè)氨基酸序列，例如Gly-Pro-Gly-Pro-Gly-Pro；(b)多克隆位點(diǎn)所編碼的氨基酸序列。該序列通常為5-20個(gè)，較佳地10-20個(gè)氨基酸；(c)來(lái)自于IL-22單體之外的蛋白的氨基酸序列，例如來(lái)自于IgG或白蛋白的氨基酸序列；(d)由(a)、(b)和(c)組合形成的氨基酸序列。優(yōu)選的連接肽包括：GSGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO：1中第147-162位)和ASTKGP(SEQIDNO：3中第147-152位)。此外，在融合蛋白的N端或C末端還可添加其他不影響IL-22單體活性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(dá)(如信號(hào)肽)，有利于純化(如6×His序列、釀酒酵母α-因子信號(hào)肽切割位點(diǎn)(Glu-Lys-Arg)，或可促進(jìn)融合蛋白的活性。二聚體的制備方法編碼本發(fā)明IL-22二聚體或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR擴(kuò)增或合成的方法獲得IL-22第一單體和/或IL-22第二單體的編碼DNA序列，然后將其拼接在一起，形成編碼本發(fā)明融合蛋白的DNA序列。為了提高宿主細(xì)胞的表達(dá)量，可以對(duì)IL-22二聚體編碼序列進(jìn)行改造，例如采用宿主細(xì)胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。在本發(fā)明中，可以采用酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏好的密碼子，并采用計(jì)算機(jī)DNA軟件對(duì)IL-22二聚體基因進(jìn)行檢測(cè)，排除在基因中不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列，包括內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列等。在獲得了編碼本發(fā)明新融合蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到本發(fā)明的新的融合蛋白。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”包括質(zhì)粒、粘粒、表達(dá)載體、克隆載體、病毒載體等。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，更佳地是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在獲得轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞后，可在適合表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞，從而表達(dá)出融合蛋白。然后再分離出表達(dá)的融合蛋白。藥物組合物和施用方法由于本發(fā)明IL-22二聚體可產(chǎn)生更強(qiáng)的受體激活信號(hào)并具有優(yōu)異的血清半衰期，因此本發(fā)明IL-22二聚體以及含有本發(fā)明IL-22二聚體為主要活性成分的藥物組合物可用于治療和預(yù)防神經(jīng)損傷疾病或神經(jīng)退行性疾病。其中，所述的神經(jīng)損傷疾病包括：中風(fēng)、脊柱損傷和伴有血腦屏障損傷的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。凰錾窠?jīng)退行性疾病選自：帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、肌萎縮側(cè)索硬化病、脊髓肌萎縮病、原發(fā)性側(cè)索硬化病、或脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)。本發(fā)明的藥物組合物包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明IL-22或其二聚體及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。通常，藥物組合物含有0.001-1000mg的IL-22或其二聚體/劑，較佳地0.05-300mg的IL-22或其二聚體/劑，更佳地，含有0.5-200mg的IL-22或其二聚體/劑。本發(fā)明的化合物及其藥理上可接受的鹽可制成各種制劑，其中包含安全、有效量范圍內(nèi)的本發(fā)明IL-22或其二聚體或其藥理上可接受的鹽及藥理上可以接受的賦形劑或載體。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明顯改善病情，而不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用?；衔锏陌踩?、有效量根據(jù)治療對(duì)象的年齡、病情、療程等具體情況來(lái)確定?！八幚砩峡梢越邮艿馁x形劑或載體”指的是：一種或多種相容性固體或液體填料或凝膠物質(zhì)，它們適合于人使用，而且必須有足夠的純度和足夠低的毒性。“相容性”在此指的是組合物中各組份能與本發(fā)明的化合物以及它們之間相互摻和，而不明顯降低化合物的藥效。藥理上可以接受的賦形劑或載體部分例子有纖維素及其衍生物(如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素鈉、纖維素乙酸酯等)、明膠、滑石、固體潤(rùn)滑劑(如硬脂酸、硬脂酸鎂)、硫酸鈣、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄欖油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化劑(如吐溫)、潤(rùn)濕劑(如十二烷基硫酸鈉)、著色劑、調(diào)味劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、防腐劑、無(wú)熱原水等。施用本發(fā)明IL-22或其二聚體時(shí)，可以口服、直腸、腸胃外(靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下)、局部給藥。用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑、片劑、丸劑、散劑和顆粒劑。在這些固體劑型中，活性化合物與至少一種常規(guī)惰性賦形劑(或載體)混合，如檸檬酸鈉或磷酸二鈣，或與下述成分混合：(a)填料或增容劑，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合劑，例如，羥甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯膠；(c)保濕劑，例如，甘油；(d)崩解劑，例如，瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些復(fù)合硅酸鹽、和碳酸鈉；(e)緩溶劑，例如石蠟；(f)吸收加速劑，例如，季胺化合物；(g)潤(rùn)濕劑，例如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，例如，高嶺土；和(i)潤(rùn)滑劑，例如，滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固體聚乙二醇、十二烷基硫酸鈉，或其混合物。膠囊劑、片劑和丸劑中，劑型也可包含緩沖劑。固體劑型如片劑、糖丸、膠囊劑、丸劑和顆粒劑可采用包衣和殼材制備，如腸衣和其它本領(lǐng)域公知的材料。它們可包含不透明劑，并且，這種組合物中活性化合物或化合物的釋放可以延遲的方式在消化道內(nèi)的某一部分中釋放?？刹捎玫陌窠M分的實(shí)例是聚合物質(zhì)和蠟類(lèi)物質(zhì)。必要時(shí)，活性化合物也可與上述賦形劑中的一種或多種形成微膠囊形式。用于口服給藥的液體劑型包括藥學(xué)上可接受的乳液、溶液、懸浮液、糖漿或酊劑。除了活性化合物外，液體劑型可包含本領(lǐng)域中常規(guī)采用的惰性稀釋劑，如水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例知，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特別是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油或這些物質(zhì)的混合物等。除了這些惰性稀釋劑外，組合物也可包含助劑，如潤(rùn)濕劑、乳化劑和懸浮劑、甜味劑、嬌味劑和香料。除了活性化合物外，懸浮液可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯、微晶纖維素、甲醇鋁和瓊脂或這些物質(zhì)的混合物等。用于腸胃外注射的組合物可包含生理上可接受的無(wú)菌含水或無(wú)水溶液、分散液、懸浮液或乳液，和用于重新溶解成無(wú)菌的可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。適宜的含水和非水載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、多元醇及其適宜的混合物。用于局部給藥的本發(fā)明IL-22或其二聚體的劑型包括軟膏劑、散劑、貼劑、噴射劑和吸入劑?；钚猿煞衷跓o(wú)菌條件下與生理上可接受的載體及任何防腐劑、緩沖劑，或必要時(shí)可能需要的推進(jìn)劑一起混合。本發(fā)明IL-22或其二聚體可以單獨(dú)給藥，或者與其他藥學(xué)上可接受的化合物聯(lián)合給藥。含有本發(fā)明的白介素-22或其二聚體的微膠囊可用于本發(fā)明的白介素-22的緩釋給藥。重組蛋白的微囊緩釋給藥技術(shù)已成功應(yīng)用于重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)、重組人干擾素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnsonetal.，Nat.Med.，2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther27：1221-1223(1993)；WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399；U.S.Pat.No.5654010。本發(fā)明的白介素-22或其二聚體的緩釋制劑可用具有良好生物兼容性和寬泛生物可降解性的乳酸羥基乙酸高聚物(PLGA)制備。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和羥基乙酸可被人體很快清除。而且，該高聚物的降解能力可隨其分子量和組成的不同，從幾個(gè)月延長(zhǎng)到幾年(Lewis，“Controlledreleaseofbioactiveagentsformlactide/glycolidepolymer，”in：M.ChasinandR.Langer(Eds.)，BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker：NewYork，1990)，pp.1-41))。本發(fā)明的藥物組合物的劑量和濃度范圍可因?qū)嶋H使用情況的不同而變化。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)知如何根據(jù)實(shí)際需求去選擇合適的劑量和給藥途徑。對(duì)于不同種系，例如人和鼠之間藥物劑量范圍的調(diào)整原則，可參見(jiàn)Mordenti，J.andChappell，W.“Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics”InToxicokineticsandNewDrugDevelopment，Yacobietal.；PergamonPress，NewYork1989，pp.42-96。使用藥物組合物時(shí)，是將安全有效量的本發(fā)明IL-22或其二聚體適用于需要治療的哺乳動(dòng)物(如人)，其中施用時(shí)劑量為藥學(xué)上認(rèn)為的有效給藥劑量，對(duì)于60kg體重的人而言，每次給藥劑量通常為0.01～300mg，優(yōu)選0.5～100mg。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于：1.IL-22或其二聚體在體外能激活神經(jīng)細(xì)胞STAT3。2.IL-22二聚體在動(dòng)物模型已證實(shí)可有效治療神經(jīng)損傷疾病。3.IL-22二聚體能夠延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期，改善藥物的動(dòng)力學(xué)，減少注射頻率；能顯著增強(qiáng)體內(nèi)生物活性。4.IL-22或IL-22二聚體在顯著抑制PD模型動(dòng)物黑質(zhì)體多巴胺能神經(jīng)元的丟失，激發(fā)多巴胺能神經(jīng)元的功能。5.IL-22或IL-22二聚體顯著抑制海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，改善AD模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。6.IL-22或IL-22二聚體在神經(jīng)退行性疾病中具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，有效治療神經(jīng)退行性疾病。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1用常規(guī)方法制備和純化，獲得結(jié)構(gòu)如圖1-圖3所示的IL-22二聚體(序列為SEQIDNO：1，或單體序列如SEQIDNO：2-5所示)。例如，由IL-22-Fc復(fù)合物制備IL-22二聚體，具體制備方法如下：a.IL-22二聚體表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建采用全基因合成IL-22-Fc復(fù)合物的cDNA序列(如SEQIDNO：6或SEQIDNO：7所示，其中SEQIDNO.：6編碼SEQIDNO.：2所示的單體，SEQIDNO.：7編碼SEQIDNO.：3所示的單體)，將人IL-22單體的基因與IgG2的Fc基因片段連接，5’端引入EcoRI位點(diǎn)，以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)所需要的元件如Kozak序列和信號(hào)肽序列，3’端引入XbaI位點(diǎn)，克隆到市售的pUC19質(zhì)粒，命名為pIL-22-Fc，轉(zhuǎn)化常規(guī)的E.coliTG1。用EcoRI和XbaI酶切pUC19質(zhì)粒，回收約1300bp的IL-22-Fc片段，與經(jīng)EcoRI和XbaI酶切后的pcDNA3(Invitrogen)表達(dá)質(zhì)粒相連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pEX-IL-22-Fc。表達(dá)質(zhì)粒pEX-IL-22-Fc通過(guò)線性化轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，表達(dá)IL-22二聚體，ELISA法檢測(cè)表達(dá)量，篩選出蛋白產(chǎn)量較高的細(xì)胞株，并制備細(xì)胞庫(kù)。b.IL-22二聚體的分離純化將重組CHO細(xì)胞用常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)從而表達(dá)重組蛋白。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞上清(含有IL-22復(fù)合物、IL-22二聚體、IL-22多聚體及代謝物)，細(xì)胞上清收集后經(jīng)過(guò)濾、多級(jí)凝膠層析純化，例如，rProteinASepharoseFF(GEHealthcare，cat#17-1279-04)捕獲，用20-50mM檸檬酸緩沖液，0.1-2MNaCl，pH3.5-3.8的緩沖液洗脫，得到純度＞90％的IL-22二聚體，接下來(lái)采用PPA復(fù)合介質(zhì)的凝膠層析(PALLLifeSciencesCat#：k364-01)，用20-50mMNaAc/HAC，pH3.0-5.0的緩沖液洗脫，洗脫液經(jīng)低pH滅活病毒，Nano20膜除病毒過(guò)濾等，最終獲得IL-22二聚體。分離純化得到的IL-22二聚體的純度＞95％(采用反向HPLC分析)。電泳顯示，純化后IL-22二聚體(由二個(gè)SEQIDNO.：2所示單體構(gòu)成)分子量為52±10KD(采用還原型SDS-PAGE分析)，與預(yù)測(cè)值相符。紫外吸收光譜為280nm。IL-22二聚體在體外能刺激Colo205細(xì)胞產(chǎn)生IL-10(ED50為10-1000ng/mL)。實(shí)施例2IL-22二聚體體內(nèi)半衰期大鼠皮下單次注射IL-22二聚體(由二個(gè)序列如SEQIDNO：2所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)100μg/kg，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如下表1所示(n＝6)。而單體IL-22(重組人白介素22)在大鼠的半衰期約1.3小時(shí)。表1實(shí)施例3IL-22或IL-22二聚體對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的激活作用取孕17天SD大鼠的胎鼠的全腦放入預(yù)冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。剪碎腦組織成1mm3大小，加入10mL0.125％胰酶，并放入37℃孵箱內(nèi)消化15min，隨后吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM+10％FBS的離心管內(nèi)終止消化，用移液槍吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。用無(wú)血清神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基neurobasal(invitrogen，貨號(hào)：21103049)+無(wú)血清添加劑B27(invitrogen，貨號(hào)：17504044)培養(yǎng)8天，每2天換液一次。培養(yǎng)至第八天，分別用不同濃度IL-22二聚體(由二個(gè)序列如SEQIDNO：2所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)和IL-22(IL-22二聚體的終濃度：0.3μg/mL；IL-22的終濃度：1.2μg/mL)處理神經(jīng)元15分鐘。將含藥物的培養(yǎng)基上清完全吸出，細(xì)胞用PBS洗兩遍，按照細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明步驟裂解細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液(CellSignalingTechnology，貨號(hào)：9803；主要成分：20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA，1％Triton，2.5mMsodiumpyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mMNa3VO4，1μg/mlleupeptin，1mMPMSF)冰上裂解細(xì)胞20分鐘，用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，12000rpm，4℃離心10分鐘。吸取上清，測(cè)定蛋白濃度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA試劑盒(invitrogen，貨號(hào)：KH00481)檢測(cè)STAT磷酸化水平變化。結(jié)果如圖4所示：與空白對(duì)照組相比，IL-22、IL-22二聚體均能激活神經(jīng)元細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)的生物活性。其中，IL-22單體(終濃度為1.2μg/mL)可使神經(jīng)元p-STAT3的信號(hào)水平上升5.4倍，而IL-22二聚體，其終濃度僅為0.3μg/mL，相當(dāng)于IL-22單體的終濃度的1/10，而且可以使神經(jīng)元p-STAT3的信號(hào)水平上升7.8倍，可見(jiàn)，IL-22二聚體對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的激活作用顯著優(yōu)于IL-22單體。實(shí)施例4IL-22二聚體在局灶性腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ?Focalcerebralischemia)中的治療作用雄性SD大鼠，體重為250～300g。動(dòng)物分成3組：模型組(MCAO+溶劑，n＝12)，IL-22二聚體組(MCAO+IL-22-D100μg/kg，IL-22-D由二個(gè)序列如SEQIDNO：2所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)，假手術(shù)組(手術(shù)+溶劑，n＝12)。麻醉后，大鼠的右頸總動(dòng)脈(CCA)、右頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、右頸外動(dòng)脈(ECA)通過(guò)頸部手術(shù)暴露在外。一種頭部硅膠包裹的線栓通過(guò)大鼠頸外動(dòng)脈插入頸總動(dòng)脈再回?fù)苤令i內(nèi)動(dòng)脈進(jìn)行阻塞，插入長(zhǎng)度大約18.5±0.5mm。插入后感覺(jué)略微受阻，表明已到達(dá)中動(dòng)脈處，能夠阻塞中動(dòng)脈的血流供應(yīng)。阻塞60min后，線栓被拔出約10mm左右進(jìn)行再灌注。IL-22二聚體組分別于再灌注0.5h和48h時(shí)，皮下注射IL-22二聚體100μg/kg，假手術(shù)組和模型組皮下注射相同體積的溶劑。整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，動(dòng)物體溫被保持在36.5℃。假手術(shù)組只切開(kāi)頸部皮膚分離頸部動(dòng)脈，不插入線栓。21天后動(dòng)物被安樂(lè)處死取出大腦。用2mm的冠狀切片模具將大腦切成6片，放在2％TTC溶液中，37℃避光溫孵20-30min，最后固定在10％福爾馬林溶液中。固定后將這些腦切片用數(shù)碼相機(jī)拍照，白色未染上的部分為梗死區(qū)。然后計(jì)算其體積百分比％＝(對(duì)側(cè)腦半球面積-同側(cè)腦半球未梗死部位面積)/對(duì)側(cè)腦半球面積*100％。梗死面積的測(cè)量用Photoshop7.0軟件完成。神經(jīng)學(xué)癥狀的臨床評(píng)價(jià)神經(jīng)功能學(xué)分?jǐn)?shù)在手術(shù)的0天，1天，2天，3天或者第0，1，2，3，7，14，21天被評(píng)價(jià)，其分?jǐn)?shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0-無(wú)神經(jīng)功能性損傷；1-左前肢不能伸展；2-不連續(xù)地向左邊轉(zhuǎn)圈；3-連續(xù)的向左邊轉(zhuǎn)圈；4-向左側(cè)傾倒；5-神經(jīng)意識(shí)喪失，不能自發(fā)行走。結(jié)果如圖5-6所示，模型組梗死體積為54.7％。與模型組比較，注射IL-22二聚體后顯示出了顯著的治療效果(P＜0.01)，其梗死體積為33.8％，相對(duì)于模型組，IL-22二聚體組的梗死體積減少了20.9％。在術(shù)后第三天，IL-22二聚體組與模型組相比，神經(jīng)功能評(píng)分有顯著性差異(P＜0.05)，提示IL-22二聚體可以保護(hù)神經(jīng)的壞死，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。實(shí)施例5IL-22二聚體在食蟹猴體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)成年健康獼猴，8只，雌雄各半，體重3-5公斤，按動(dòng)物體重隨機(jī)分成2組，分別為IL-22二聚體30、100μg/kg給藥組，其中給藥組各組4只/組，雌雄各半。分別皮下注射給予相應(yīng)劑量的IL-22二聚體(由二個(gè)序列如SEQIDNO.：2所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)，給藥體積0.2ml/kg體重，單次給藥，于給藥前、給藥后0.5、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、144、168小時(shí)下肢隱靜脈取血0.6ml，室溫靜置30min后，分離血清，采用ELISA試劑盒(Biolegend，Cat#434507)檢測(cè)血清中的IL-22二聚體濃度，檢測(cè)結(jié)果采用非房室模型分析藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如下表2所示。IL-22在食蟹猴體內(nèi)的半衰期(t1/2z)約為2hr。表2藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)(均值±SD，n＝4)實(shí)施例6IL-22二聚體、IL-22的體外活性分析本實(shí)施例利用某些細(xì)胞在受到IL-22刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生IL-10，通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)的OD值，從而測(cè)定IL-22的活性。方法如下：Colo205細(xì)胞(ATCCNumberCCL-222，人結(jié)腸癌細(xì)胞)培養(yǎng)于RPMI164010％FBS培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，棄上清，加入PBS洗去殘留培養(yǎng)基，加入2～5mL0.25％Trypsin-EDTA消化，加入培養(yǎng)基吹打均勻，1500rpm離心5min，收集細(xì)胞，然后用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制成5.0×105Cell/ml的細(xì)胞懸液，于96孔板各孔分別添加100μL/孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。次日，取出CO2培養(yǎng)箱中的96孔板，于4℃條件下，800rpm離心5分鐘，從各孔抽出細(xì)胞上清液90μL，并補(bǔ)入90μL0.1％BSA/RPMI1640，加入IL-22二聚體(由二個(gè)SEQIDNO.：2所示單體構(gòu)成)至終濃度1.4、4.1、12.3、37.0、111.1、333.3、1000、3000ng/mL，加入IL-22至終濃度0.01、0.04、0.12、0.37、1.1、3.3、10、30ng/mL，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20hr，收集細(xì)胞上清液，采用IL-22ELISA試劑盒(R&D，Cat#S1000B)檢測(cè)OD值。結(jié)果如圖7所示，IL-22二聚體的半數(shù)有效濃度(ED50)值為229ng/mL(2675pM)，IL-22的ED50為0.54ng/mL(32.4pM)。以上結(jié)果顯示，雖然體外實(shí)驗(yàn)中IL-22活性略優(yōu)于IL-22二聚體的活性，而IL-22二聚體在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和有效活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于IL-22，可見(jiàn)評(píng)價(jià)IL-22二聚體的生物活性宜采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。?shí)施例3和6的結(jié)果提示，IL-22單體或二聚體形式對(duì)不同細(xì)胞的作用存在很大差異。對(duì)神經(jīng)細(xì)胞而言，IL-22二聚體對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的激活作用明顯優(yōu)于IL-22單體的作用，對(duì)人結(jié)腸癌類(lèi)細(xì)胞(如Colo205細(xì)胞)而言，IL-22單體的活性略優(yōu)于較IL-22二聚體的活性。因此，實(shí)施例3的體外測(cè)定方法更適合用于測(cè)定二聚體IL-22的活性(尤其是針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用)，也更適合反映二聚體IL-22在體內(nèi)的活性。實(shí)施例7IL-22或IL-22二聚體對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性的保護(hù)作用PC12細(xì)胞是一種大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系，體外培養(yǎng)能合成、代謝、傳遞多巴胺，可作為體外模型篩選具有活性的化合物。實(shí)驗(yàn)將PC12細(xì)胞按40000個(gè)/孔種于96孔板，培養(yǎng)基成分：DMEM，10％馬血清+5％FCS，1％Penicillin-Streptomycin。MPP+(Sigma)加入至30～3000μm終濃度，分別加入IL-22至終濃度為0.04ng/mL、0.4ng/mL、4ng/mL、40ng/mL，IL-22二聚體(由兩個(gè)選自序列如SEQIDNO：2-5所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)至終濃度為0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL。培養(yǎng)24hr后，采用熒光細(xì)胞存活分析(Fluorimetriccellviabilityassay)。結(jié)果顯示，MPP+處理后，PC12細(xì)胞的存活率隨著MPP+濃度的增加而降低，IL-22和IL-22二聚體對(duì)PC12細(xì)胞均顯示出顯著的保護(hù)作用。實(shí)施例8IL-22或IL-22二聚體對(duì)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的激活作用取孕14天SD大鼠的胎鼠的全腦放入預(yù)冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取黑質(zhì)，剪碎成1mm3大小，加入10mL0.125％胰酶，并放入37℃孵箱內(nèi)消化15min，隨后吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM+10％FBS的離心管內(nèi)終止消化，用移液槍吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。用無(wú)血清神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基neurobasal(invitrogen，貨號(hào)：21103049)+無(wú)血清添加劑B27(invitrogen，貨號(hào)：17504044)培養(yǎng)8天，每2天換液一次。培養(yǎng)至第八天，分別用不同濃度IL-22二聚體(IL-22-D，其中IL-22-D為由兩個(gè)選自序列如SEQIDNO：2-5所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)和IL-22單體(IL-22二聚體的終濃度：1、10、100ng/mL；IL-22的終濃度：0.4、4、40ng/mL)處理神經(jīng)元15分鐘。將培養(yǎng)基完全吸出，細(xì)胞用PBS洗兩遍，按照細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明步驟裂解細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液(CellSignalingTechnology，貨號(hào)：9803；主要成分：20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA，1％Triton，2.5mMsodiumpyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mMNa3VO4，1μg/mlleupeptin，1mMPMSF)冰上裂解細(xì)胞20分鐘，用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，12000rpm，4℃離心10分鐘。吸取上清，測(cè)定蛋白濃度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA試劑盒(invitrogen，貨號(hào)：KH00481)檢測(cè)STAT磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，IL-22和IL-22二聚體(IL-22-D)均能激活多巴胺能神經(jīng)元STAT3的生物學(xué)活性。實(shí)施例9IL-22或IL-22二聚體對(duì)MPTP誘導(dǎo)的動(dòng)物帕金森氏病(PD)模型的治療作用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫毗啶(MPTP)，可以特異性的損傷多巴胺能神經(jīng)元，使黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量丟失，出現(xiàn)類(lèi)似帕金森氏病的癥狀。實(shí)驗(yàn)選取C57/BL6J小鼠，雄性，～28g，12-14周，動(dòng)物飼養(yǎng)于室溫24±2℃的環(huán)境中，維持光-暗12小時(shí)循環(huán)交替，給以充足的飼料，自由飲水。50只小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，分別為溶劑對(duì)照組、MPTP模型組、MPTP+IL-2240μg/kg組、MPTP+IL-22-D40μg/kg組、MPTP+IL-22-D100μg/kg組，其中IL-22-D為由二個(gè)序列如SEQIDNO：2-5所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成的IL-22二聚體。MPTP以30mg/kg的劑量腹腔注射，連續(xù)給予5天，恢復(fù)一天后(從第7天起)MPTP+IL-2240μg/kg組按IL-2240μg/kg皮下注射給藥，每天給藥IL-22，每天一次，連續(xù)7天，即從第7～13天；MPTP+IL-22-D40μg/kg組按40μg/kg皮下注射給藥，于第7、9、11天分別給藥IL-22-D一次；MPTP+IL-22-D100μg/kg組按100μg/kg皮下注射給藥，于第7、9、11天分別給藥IL-22-D一次；溶劑對(duì)照組皮下注射給予等體積的生理鹽水。第14天對(duì)動(dòng)物進(jìn)行以下評(píng)價(jià)。a.PD小鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)在本實(shí)驗(yàn)于MPTP末次給藥后第10天進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)。方法：爬桿法(poletest)用于檢測(cè)PD中典型行為學(xué)癥狀-運(yùn)動(dòng)徐緩(Matsuuraetal.，1997；Arakietal.，2001；Katoetal.，2004)。將小鼠頭向上輕柔的放在粗糙的桿頂(直徑8mm，高55cm)。小鼠從頭向上調(diào)整至頭完全向下的時(shí)間記錄為T(mén)-turn(timetoturn)，小鼠從向下運(yùn)動(dòng)至四肢全部到達(dá)桿底的時(shí)間記錄為T(mén)-LA(locomotionactivitytime)，超過(guò)30s按照30s記錄。每只小鼠重復(fù)檢測(cè)5次取平均值。結(jié)果顯示，IL-22和IL-22二聚體均能顯著改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠行為學(xué)異常。b.檢測(cè)紋狀體內(nèi)多巴胺的濃度方法：小鼠斷頭處死，將紋狀體取出稱重后裝在1.5ml的離心管中，并立即置于碎冰中。樣本每10mg加入300μl冰水浴中的樣品處理液(0.2M高氯酸、0.2mM焦亞硫酸鈉、0.01％EDTA-2Na，同時(shí)含有0.3μMDHBA作為內(nèi)標(biāo))。以上混合液使用超聲儀超聲粉碎，隨后將其在4℃下10,000g離心20min。取其上清液并用0.22μM水相濾膜過(guò)濾，采用高效液相色譜法檢測(cè)紋狀體多巴胺的濃度。結(jié)果顯示，IL-22和IL-22二聚體能顯著抑制MPTP誘導(dǎo)的小鼠紋狀體多巴胺濃度的降低。c.黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的情況觀察方法：10％水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛灌流后取腦。4％多聚甲醛后固定24h，再將樣本轉(zhuǎn)入10％，20％，30％的蔗糖溶液中梯度脫水至樣本沉底，在-20℃冰凍切片機(jī)中做中腦與紋狀體部位冠狀切片，小鼠腦切片厚度為15μm。TH為多巴胺能能神經(jīng)元的特異性標(biāo)記。一抗為單克隆小鼠抗TH(1∶1000，CHEMICON)，與紋狀體和中腦部位的腦片4℃共同孵育過(guò)夜，PBS洗三遍后用生物素化二抗，室溫孵育1h。SABC復(fù)合物室溫孵育1h。DAB顯色，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，紋狀體TH陽(yáng)性染色光密度掃描。結(jié)果顯示，IL-22和IL-22二聚體可以明顯抑制MPTP誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的大量丟失。實(shí)施例10IL-22或IL-22二聚體對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞STAT3的激活作用取孕17天SD大鼠的胎鼠的全腦放入預(yù)冷的D-Hanks液中，在解剖顯微鏡下取海馬。剪碎成1mm3大小，加入10mL0.125％胰酶，并放入37℃孵箱內(nèi)消化15min，隨后吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的DMEM+10％FBS的離心管內(nèi)終止消化，用移液槍吹打數(shù)次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內(nèi)。重復(fù)上述步驟2～3次。用無(wú)血清神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基neurobasal(invitrogen，貨號(hào)：21103049)+無(wú)血清添加劑B27(invitrogen，貨號(hào)：17504044)培養(yǎng)8天，每2天換液一次。培養(yǎng)至第八天，分別用不同濃度IL-22二聚體(由兩個(gè)選自序列如SEQIDNO：2-5所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)和IL-22(IL-22二聚體的終濃度：1、10、100ng/mL；IL-22單體的終濃度：0.4、4、40ng/mL)處理神經(jīng)元15分鐘。將培養(yǎng)基完全吸出，細(xì)胞用PBS洗兩遍，按照細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明步驟裂解細(xì)胞。用細(xì)胞裂解液(CellSignalingTechnology，貨號(hào)：9803；主要成分：20mMTris-HCl(pH7.5)，150mMNaCl，1mMNa2EDTA，1mMEGTA，1％Triton，2.5mMsodiumpyrophosphate，1mMbeta-glycerophosphate，1mMNa3VO4，1μg/mlleupeptin，1mMPMSF)冰上裂解細(xì)胞20分鐘，用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，12000rpm，4℃離心10分鐘。吸取上清，測(cè)定蛋白濃度。另取100μl的上清用STAT3[pY705]ELISA試劑盒(invitrogen，貨號(hào)：KH00481)檢測(cè)STAT磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，IL-22二聚體(IL-22-D)與IL-22單體均能激活海馬神經(jīng)元STAT3的生物學(xué)活性。實(shí)施例11IL-22或IL-22二聚體對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用PC12細(xì)胞用神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)后可長(zhǎng)出突起，具有神經(jīng)細(xì)胞特性，Aβ(β淀粉樣蛋白)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡可作為體外模擬埃爾茨海默(AD)模型。將PC12細(xì)胞培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM，10％FCS，1％Penicillin-Streptomycin)，胰酶消化，重懸于含NGF50ng/mL的培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度調(diào)整為2X104cells/孔加入96孔板，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24hr。加入Aβ至終濃度1-100μmol/L，分別用不同濃度的IL-22單體和IL-22-D(IL-22-D由二個(gè)選自序列如SEQIDNO：2-5所示的IL-22-Fc單體構(gòu)成)處理，IL-22單體的終濃度分別為0.4、4、40ng/mL，IL-22-D的終濃度分別為1、10、100ng/mL，模型孔加入等體積的PBS，陰性對(duì)照孔不加Aβ，繼續(xù)培養(yǎng)24hr。Hochest染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，或MTT法檢測(cè)PC12細(xì)胞的增殖。與陰性對(duì)照孔相比，模型孔的PC12細(xì)胞細(xì)胞核熒光染色明顯不均勻，可見(jiàn)到細(xì)胞凋亡引起的致密濃染的高熒光細(xì)胞核，IL-22單體和IL-22二聚體處理的PC12細(xì)胞細(xì)胞核熒光染色均勻，未見(jiàn)到明顯的致密濃染的高熒光細(xì)胞核。IL-22和IL-22二聚體均能抑制NGF分化后Aβ誘導(dǎo)所致的PC12細(xì)胞的凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。