專利名稱：一種鐘花報(bào)春花提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鐘花報(bào)春花提取物，屬藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自由基，是外層電子軌道上含有不配對(duì)電子的原子、原子團(tuán)和分子的總稱，包括 (1)氧自由基，如超氧陰離子自由基、羥基自由基；O)脂性自由基，它是由氧自由基和多價(jià)不飽和脂肪酸作用后生成的中間代謝產(chǎn)物，如烷自由基、烷氧自由基和烷過氧自由基等； ⑶其他自由基，如氯自由基、甲基自由基和NO。自由基具有強(qiáng)氧化性，可損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起慢性疾病及衰老反應(yīng)。研究表明，炎癥、腫瘤、衰老、血液病、以及心、肝、 肺、皮膚等各方面疑難疾病的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多或清除自由基能力下降有著密切的關(guān)系。因此，降低體內(nèi)自由基的損害顯得尤為重要。目前，多使用自由基清除劑(又稱抗氧化劑)來降低體內(nèi)自由基含量。自由基清除劑是具有清除自由基作用的物質(zhì)，常見的有抗氧化酶SOD、維生素E、C、硒、輔酶Q、谷胱甘肽等單體活性物質(zhì)。同時(shí)，研究人員也發(fā)現(xiàn)，中藥在清除自由基中也發(fā)揮著重要作用，如人參、 三七、丹參、女貞子、黃精、首烏、靈芝、麥冬、虎杖等單味中藥材，以及生脈飲等中藥復(fù)方，均具是優(yōu)異的自由基清除劑。鐘花報(bào)春(Primula sikkmensis Hook)是一種常見的藏藥材，屬于報(bào)春花科報(bào)春花屬植物，以花入藥，是藏藥“相相直吾”其中的一種原植物。花黃色，鐘狀，聚生于花葶頂端，主產(chǎn)于西藏東部及南部、青海東南部、四川西部、云南西北部；生于海拔3750-4500米的林緣濕草地、水溝邊；分布于尼泊爾、錫金、不丹、緬甸。具有清熱解毒，瀉肝膽火、止血等作用，還能用于心脈瘀阻、血脈不暢，療效確切，在甘孜藏族地區(qū)廣泛使用，資源十分豐富。邱建平等利用正交試驗(yàn)研究了從鐘花報(bào)春的花中提取總黃酮的優(yōu)選工藝，指出以 60%乙醇，20倍溶媒用量，回流提取3次，每次1小時(shí)，提取得到的總黃酮含量較高，提取物中總黃酮含量可達(dá)到7%左右。(邱建平，等，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化鐘花報(bào)春花總黃酮提取工藝，成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009年4卷4期)。目前，還未見將鐘花報(bào)春花總黃酮的用于清除自由基的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種鐘花報(bào)春花提取物。本發(fā)明的另一目的是提供該提取物的制備方法和用途。本發(fā)明提供了一種鐘花報(bào)春花提取物，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)不得低于 50% w/w。其中，所述的鐘花報(bào)春花提取物來源于報(bào)春花科報(bào)春花屬植物鐘花報(bào)春!Simula sikkimensis Hook的花的提取物。進(jìn)一步地，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為50-60% w/w。更進(jìn)一步地，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為50-55% Wi
本發(fā)明還提供了一種制備上述提取物的方法，它包括如下步驟(1)取鐘花報(bào)春花，以50-95% V/V乙醇提取，合并提取液備用；(2)將步驟(1)中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，再用30% -95% 的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報(bào)春花提取物。進(jìn)一步地，步驟(1)中采用50-70% V/V乙醇提??；步驟O)中選用30-40% V/V 乙醇進(jìn)行洗脫。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟⑴中采用60% V/V乙醇提??；步驟⑵中選用30% V/V乙醇進(jìn)行洗脫。更進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟⑴中采用60% V/V乙醇提取3次。步驟⑵中選用30% V/V乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)。本發(fā)明還提供了上述鐘花報(bào)春花提取物在制備自由基清除劑中的用途。進(jìn)一步地，所述自由基清除劑為超氧陰離子自由基清除劑、羥基自由基清除劑、 DPPH自由基清除劑。本發(fā)明還提供了一種抗氧化的保健品或/和藥物組合物，它是由上述的鐘花報(bào)春花提取物為活性成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。本發(fā)明鐘花報(bào)春花提取物對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均具有良好的清除能力，表明鐘花報(bào)春花提取物具有良好的抗氧化作用，為抗氧化的保健品或/和藥物提供了一種新的選擇。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明鐘花報(bào)春花提取物的制備取干燥的鐘花報(bào)春花粗粉，加入20倍量60%乙醇浸泡后，加熱回流提取3次，每次 lh，趁熱抽濾，合并濾液，減壓回收至無醇味后，加入適量蒸餾水后，用正丁醇萃取，減壓回收正丁醇溶液至無正丁醇味后，加入適量蒸餾水溶解，過濾后，濾液上經(jīng)預(yù)處理的DlOl大孔吸附樹脂，先用蒸餾水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，然后用30%乙醇洗脫，收集洗脫液，直至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，合并洗脫液，回收溶劑后，干燥即得鐘花報(bào)春花提取物，其中，總黃酮以蘆丁計(jì)含量為52. 5%。本發(fā)明鐘花報(bào)春花提取物的制備方法不限于實(shí)施例中所述的方式，現(xiàn)有的黃酮提取方法均能用于對(duì)鐘花報(bào)春花提取物的提取，如堿水提取等；對(duì)總黃酮的精制也可采用其他型號(hào)的大孔吸附樹脂進(jìn)行精制，洗脫溶劑除采用乙醇以外，也可以采用弱堿溶液進(jìn)行洗脫，也可提高黃酮含量。實(shí)施例2鐘花報(bào)春花提取物制備方法的篩選1.總黃酮含量測(cè)定方法1.1對(duì)照品溶液的制備取蘆丁對(duì)照品0. 01006g，置于50ml容量瓶中，加60 %乙醇定容至刻度，制得濃度為0. 2012mg/ml的對(duì)照品溶液，備用。1.2樣品溶液的制備按照各制備方法制備得到的浸膏轉(zhuǎn)移至IOOml容量瓶中，并定容至刻度，從此溶液中精密移取IOml于IOOml容量瓶中，并用60%乙醇定容至刻度，即制得樣品溶液，備用。1.3測(cè)定波長(zhǎng)的確定精密移取對(duì)照品溶液7ml和供試品溶液2ml，分別置于2支25ml容量瓶中，均加入 60 %乙醇稀釋至7ml，混勻，加5 %亞硝酸鈉溶液Iml，搖勻，放置6min，再加10 %硝酸鋁溶液 lml，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉溶液10ml，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外可見分光光度法(《藥典》05年版附錄VA)，在200-800nm進(jìn)行掃描， 測(cè)得對(duì)照品溶液和樣品溶液的最大吸收波長(zhǎng)分別為506. 5Inm和498. 67nm。兩者的最大吸收波長(zhǎng)接近，因此確定506nm為測(cè)定波長(zhǎng)。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品溶液(0.2012mg/ml) 0. 0ml, 1. Oml，2. Oml，3. Oml，4. Oml，5. Oml，
6.Oml，7. Oml，分別置于25ml容量瓶中，各加60 %乙醇至7. Oml，加5 %亞硝酸鈉溶液 (0. 050g/ml) 1. 0ml，搖勻，放置 6min，再加 10%硝酸鋁溶液(0. 09972g/ml) 1. 0ml，搖勻，放置6min.加氫氧化鈉試液(0. 04308g/ml) 10ml，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15min,以相應(yīng)試劑為空白，找紫外可見分光光度法(《藥典》05版附錄VA)，在506nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 12. 785X-0. 001 R2 = 0. 9992。1.5樣品液的測(cè)定從供試品溶液中精密移取細(xì)1于1支25ml容量瓶中，然后用60%乙醇溶液稀釋至
7.0ml，然后按照對(duì)照品溶液的顯色方法顯色。精密量取60%乙醇細(xì)1，作為空白對(duì)照，后續(xù)顯色處理同上述對(duì)照品。在506nm處測(cè)定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程計(jì)算總黃酮含量。2、本發(fā)明鐘花報(bào)春花提取物的提取方法考察2. 1單因素方法考察本實(shí)驗(yàn)以不同乙醇濃度為考察因素，以鐘花報(bào)春中總黃酮得率為考察指標(biāo)，篩選鐘花報(bào)春中總黃酮的最佳提取工藝條件。2. 1. 1儀器與材料(1)儀器與試藥UV-2500 型紫外-可見分光光度計(jì) PerkinElmer Lambda 35UV/VISSpectrometer ； 熱回流裝置，超聲儀，R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申順生物科技有限公司)，DZF-6021型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，瑞士 PAG-160A電子天平，F(xiàn)Al 104電子天平(上海精天電子儀器廠)，電子恒溫不銹鋼水浴鍋(上海宏興機(jī)械儀器實(shí)業(yè)制造公司)，DGG-9140B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，SHE-III循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器廠)，蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)為10080-200707)， 95 %乙醇，90 %乙醇，80 %乙醇，70 %乙醇，60 %乙醇，5 %亞硝酸鈉溶液；10 %硝酸鋁溶液； 4. 3%氫氧化鈉溶液以上試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水系重蒸水。(2)實(shí)驗(yàn)藥材鐘花報(bào)春花由重慶中藥研究所涂永勤博士鑒定為鐘花報(bào)春!Simula sikkimensis Hook 的干燥花。2. 1. 2方法與結(jié)果
(1)總黃酮的提取取I號(hào)內(nèi)鐘花報(bào)春花適量于托盤內(nèi)鋪開，同時(shí)取II號(hào)內(nèi)鐘花報(bào)春花適量于另一托盤內(nèi)鋪開，一起放入烘箱中，30°C干燥過夜。將烘干的藥材快速地用打粉機(jī)打成粗粉，然后平鋪于托盤中，置于烘箱中30°C干燥一定時(shí)間(約2小時(shí))然后用袋子封裝好置于干燥器中保存?zhèn)溆?。分別精密稱取I號(hào)藥材粉末5. 000g, 4. 998g，4. 998g，4. 996g，4. 997g，置于5 支250ml潔凈的圓底燒瓶中，分別加入IOOml的95%，90%，80%，70%，60%乙醇浸泡藥材 30分鐘。分別精密稱取II號(hào)藥材粉末4. 997g，5. 000g, 4. 998g，4. 999g，5. 002g，置于5支 250ml潔凈的圓底燒瓶中，然后同I號(hào)藥材粉末一樣處理。將I號(hào)和II號(hào)中每?jī)蓚€(gè)所用乙醇濃度相同的樣品置于同一水浴鍋中回流提取2小時(shí)，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %乙醇的水浴溫度分別為86°C，85°C，84. 5°C，83. 5°C，82. 5°C，然后分別趁熱抽濾，濾渣再加IOOml 同第一次提取的溶劑回流提取2次，每次1小時(shí)，然后合并濾液備用。(配制不同濃度乙醇溫度為18°C )。洗10個(gè)大小基本一致的蒸發(fā)皿，置減壓干燥箱中減壓60°C干燥過夜備用。 蒸發(fā)皿減壓干燥后分別精密稱重，重量如下所示表1不同乙濃度干燥后的重量
I 95% I 90% I 80%I 70% I 60%1195% 1190% II80% 1170% 1160%蒸發(fā)皿重(g)41. 991 38. 164 45.574 43. 516 41,.417 40. 902 45. 957 43. 518 45. 933 45. 178將各自合并的濾液分別減壓濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮是的水浴溫度為50°C )到一定程度，然后轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的蒸發(fā)皿中，60°C水浴揮干，然后將含浸膏的蒸發(fā)皿置減壓干燥器中 60°C減壓干燥過夜。含浸膏的蒸發(fā)皿經(jīng)壓干燥后，精密稱定各含膏蒸發(fā)皿總重，結(jié)果如下表所示表 2
I 95%I 90%I 80%I 70%I 60%1195%1190%II80%1190%II60%蒸發(fā)皿重41.99138.16445.57443.51641.14740.90245.95743.51845.93345.178(g)含膏蒸發(fā)43.24239.60747.22945.20443.05842.45847.70145.46248.01747.302皿重(g)浸膏重(g)1.2511.4431.6551.6881.6411.5561.7441.9442.0842.124由上表數(shù)據(jù)經(jīng)處理得“不同濃度乙醇提取浸膏情況”，結(jié)果表明60%乙醇提取的浸
膏量最多。各浸膏用各自的提取溶劑溶解并定容于IOOml容量瓶中，并超聲處理，使其全部溶解，放冷至室溫，備用。2. 1.3樣品液的測(cè)定分別從供試品溶液I 95%,90%,80%, 70%,60%, 1195%,90%,80%, 70%,60% 中精密移取7ml, 5ml, 4ml, 4ml, 7ml, 5ml, 5ml, 4ml, 4ml于10支25ml容量瓶中，然后分別用各自相應(yīng)濃度的乙醇溶液稀釋至7ml，然后按照對(duì)照品溶液的顯色方法顯色。然后以各自試劑為空白對(duì)照，分別在500nm和506nm處測(cè)定吸光度A，結(jié)果如下表所示
表3各樣品吸光度情況
權(quán)利要求
1.一種鐘花報(bào)春花提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)不得低于 50% w/w。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為 50-60% w/w。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)為 50-55% w/w。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的提取物，其特征在于所述的鐘花報(bào)春花提取物來源于報(bào)春花科報(bào)春花屬植物鐘花報(bào)春!Simula sikkimensis Hook的花的提取物。
5.一種制備權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的提取物的方法，它包括如下步驟(1)取鐘花報(bào)春花，以50-95%V/V乙醇提取，合并提取液備用；(2)將步驟(1)中的提取液回收乙醇后，用正丁醇萃取，將正丁醇層回收正丁醇后，上大孔吸附樹脂，先用水洗脫至不發(fā)生三氯化鐵反應(yīng)和鹽酸鎂粉反應(yīng)，再用30% -95%的乙醇洗脫，收集洗脫液，回收溶劑后，干燥，即得鐘花報(bào)春花提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于步驟⑴中采用50-70%V/V乙醇提??； 步驟O)中選用30-40% V/V乙醇進(jìn)行洗脫。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟⑴中采用60%V/V乙醇提?。徊襟E ⑵中選用30% V/V乙醇進(jìn)行洗脫。
8.權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的鐘花報(bào)春花提取物在制備自由基清除劑中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述自由基清除劑為超氧陰離子自由基清除劑、羥基自由基清除劑、DPPH自由基清除劑。
10.一種抗氧化的保健品或/和藥物組合物，其特征在于它是由權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述的鐘花報(bào)春花提取物為活性成分，加上藥學(xué)上常用的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種鐘花報(bào)春花提取物，該提取物中總黃酮的含量以蘆丁計(jì)不得低于50％w/w。本發(fā)明鐘花報(bào)春花提取物對(duì)超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基均具有良好的清除能力，表明鐘花報(bào)春花提取物具有良好的抗氧化作用，為抗氧化的保健品或/和藥物提供了一種新的選擇。
文檔編號(hào)A61P39/06GK102423324SQ20111042861
公開日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月20日
發(fā)明者張旭, 彭騰, 李鴻翔, 賀鋼民, 鄧赟, 邱建平 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)