專利名稱：一種er拮抗劑的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ER拮抗劑的新用途。
背景技術(shù)：
乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，全世界每年有百萬(wàn)婦女罹患乳腺癌。在我國(guó)， 乳腺癌已成為上升幅度最快的惡性腫瘤之一，現(xiàn)已居女性惡性腫瘤死亡率的首位?；熓侨橄侔┑闹饕o助治療手段，紫杉醇類化合物是近十年來(lái)治療乳腺癌有效的化療藥物。隨著紫杉醇類抗癌藥為主的化療方案的逐步應(yīng)用，乳腺癌病人的治愈率已經(jīng)有了相當(dāng)?shù)奶岣撸杂邢喈?dāng)部分的乳腺癌病人療效不佳，其主要原因是由于腫瘤的耐藥性造成了化療失敗，甚至導(dǎo)致患者病情惡化和死亡。腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇產(chǎn)生耐藥后，對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)和機(jī)理不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。目前研究已表明腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的多藥耐藥主要機(jī)制之一是MDRl (ABCBl)高表達(dá)引起的。該基因編碼的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PgP蛋白，能利用ATP能量將細(xì)胞內(nèi)的底物泵出細(xì)胞外，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物的絕對(duì)濃度降低，從而引起腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的耐藥。近年來(lái)許多臨床資料及文獻(xiàn)回顧顯示雌激素受體陽(yáng)性(ER+)的乳腺癌患者對(duì)化療的敏感性要比雌激素受體陰性(ER-)的患者差。因此，探索乳腺癌化療耐藥機(jī)制，并研究出能提高化療藥物敏感性的新藥物迫不及待。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種ER拮抗劑的新用途， 以實(shí)現(xiàn)有效解決。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下 ER拮抗劑在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用。所述的腫瘤為乳腺癌。所述的ER拮抗劑為ER拮抗劑ICI182，780。乳腺癌是女性中常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)有的化療藥物紫杉醇治療效果欠佳，而腫瘤的多藥耐藥性是影響乳腺癌療效的主要因素之一。臨床上已經(jīng)觀察到雌激素受體(ER) 表達(dá)水平與乳腺癌對(duì)紫杉醇化療的敏感性有著相關(guān)性，同時(shí)學(xué)術(shù)研究證實(shí)，在MCF-7細(xì)胞中ER蛋白可以與Spl轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而多藥耐藥基因MDRl 受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Spl的調(diào)控。因此，ER拮抗劑在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中的具有廣泛的應(yīng)用前景。提出以下假設(shè)ER能夠通過促進(jìn)MDRl基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的抗性，紫杉醇治療的同時(shí)應(yīng)用ER拮抗劑可以提高乳腺癌細(xì)胞化療敏感性，擬通過 cell culture,MTTaransfection,western blot等方法對(duì)以上假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，從而為乳腺癌治療及其多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)提供新的思路。有益效果本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)ER高水平表達(dá)是乳腺癌細(xì)胞耐藥的一個(gè)重要相關(guān)指標(biāo)，ER拮抗劑具有的優(yōu)點(diǎn)是抑制ER蛋白表達(dá)水平，阻斷雌激素對(duì)乳腺癌發(fā)生與發(fā)展的影響，其新用途在紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞模型中發(fā)揮了良好的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，在治療人乳腺癌對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中將具有廣泛的應(yīng)用。


圖1是RT-PCR鑒定MDRl和ER轉(zhuǎn)錄水平在耐藥與敏感株中表達(dá)結(jié)果圖； 圖2是western blot鑒定Pgp和ER蛋白水平在耐藥與敏感株中表達(dá)結(jié)果圖； 圖3是ER過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3. 1⑴-ER α的PCR鑒定結(jié)果圖4是ER干擾質(zhì)粒pSUPER-ER α -shRNA的BglII酶切鑒定結(jié)果圖5是western blot驗(yàn)證ER過表達(dá)的結(jié)果圖6是過表達(dá)ER后耐藥基因MDRl表達(dá)水平結(jié)果圖7是過表達(dá)ER后細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐受性結(jié)果圖8是western blot驗(yàn)證ER干擾的效果圖9是干擾ER后耐藥基因MDRl表達(dá)水平結(jié)果圖10是干擾ER后細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐受結(jié)果圖11是MTT檢測(cè)ER拮抗劑ICI182，780對(duì)細(xì)胞增殖的影響結(jié)果圖12是ER拮抗劑與低濃度/高濃度紫杉醇聯(lián)合用藥后對(duì)MCF-7/PTX細(xì)胞的治療效果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。為證實(shí)ER拮抗劑在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥性藥物中的具有廣泛的應(yīng)用，提出以下假設(shè)ER能夠通過促進(jìn)MDRl基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)藥物的抗性，紫杉醇治療的同時(shí)應(yīng)用ER拮抗劑可以提高乳腺癌細(xì)胞化療敏感性。以下實(shí)施例通過cell culture, MTTaransfection.western blot等方法對(duì)以上假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證，從而證實(shí)ER拮抗劑在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中將具有廣泛的應(yīng)用。實(shí)施例1
模擬臨床給藥方式建立耐紫杉醇的乳腺癌MCF-7細(xì)胞系(MCF-7/PTX)，應(yīng)用MTT方法進(jìn)行細(xì)胞耐藥性分析。MCF-7細(xì)胞系，ATCC公司購(gòu)買。細(xì)胞培養(yǎng)采用常規(guī)的紫杉醇間歇給藥法建立耐藥細(xì)胞株MCF-7/PTX。將細(xì)胞分為四組，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物中加入紫杉醇至終濃度分別為10nM、50nM、200nM、 ΙΟΟΟηΜ。較多細(xì)胞脫壁、死亡，貼壁存活細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%飽和度時(shí)傳代。并以相同藥物濃度每周給藥，持續(xù)刺激10次，脫藥培養(yǎng)6個(gè)月。光吸收值檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞消化、離心后，用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以1 X IO4個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積IOOul，24h后分別加入不同濃度的、由MEM培養(yǎng)基稀釋的紫杉醇(設(shè)6個(gè)濃度梯度，各濃度之間相差8倍；每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)平行孔)，并設(shè)不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)基的空白對(duì)照組和接種細(xì)胞但不加藥物的對(duì)照組；7 后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL) IOul ；繼續(xù)培養(yǎng)4h之后，棄上清，各加入150ul DMS0，震蕩lOmin。選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值(Α)。根據(jù)A 值計(jì)算細(xì)胞存活率(vital rate, VR) =VR (%)=(用藥組A值-空白對(duì)照組A值)/ (對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)X 100%。根據(jù)各藥物VR，由藥物濃度的對(duì)數(shù)值與VR線性回歸求出各藥物的半數(shù)抑制濃度(50%inhibitory concentration, IC50,并計(jì)算相對(duì)耐藥指數(shù)RI (resistanceindex) :RI=IC50 (耐藥細(xì)胞)/ IC50 (誘導(dǎo)前細(xì)胞)。最后取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。結(jié)果如表1所示，從數(shù)據(jù)可以看出，成功建立了紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/ PTX，測(cè)其耐藥指數(shù)(IC50)較同代數(shù)的敏感細(xì)胞系MCF-7增加了 5. 5倍，因此乳腺癌細(xì)胞系 MCF-7/PTX可以被用來(lái)研究ER拮抗劑應(yīng)用于制備治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物。表1乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的半數(shù)致死濃度表_
權(quán)利要求
1.ER拮抗劑在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為乳腺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的ER拮抗劑為ER拮抗劑 ICI182, 780。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種ER拮抗劑的新用途，該用途為在制備用于治療腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤為乳腺癌，所述的ER拮抗劑為ER拮抗劑ICI182,780。通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)ER(雌激素受體)高水平表達(dá)是乳腺癌細(xì)胞耐藥的一個(gè)重要相關(guān)指標(biāo)，ER拮抗劑具有的優(yōu)點(diǎn)是抑制ER蛋白表達(dá)水平，阻斷雌激素對(duì)乳腺癌發(fā)生與發(fā)展的影響，其新用途在紫杉醇耐藥的乳腺癌細(xì)胞模型中發(fā)揮了良好的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，在治療人乳腺癌對(duì)紫杉醇耐藥的藥物中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P15/14GK102512427SQ20111042254
公開日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者孫玉潔, 時(shí)俊鋒, 韓曉 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)