專(zhuān)利名稱(chēng)：雞新城疫-H₉亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙佐劑疫苗及其制備方法，尤其是指一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
中國(guó)是國(guó)際公認(rèn)的養(yǎng)殖大國(guó)，但不是養(yǎng)殖強(qiáng)國(guó)。動(dòng)物疫病的防控水平低是制約我國(guó)跨入養(yǎng)殖業(yè)強(qiáng)國(guó)序列的重要限制因素之一。禽流感、高致病性豬藍(lán)耳病、狂犬病等動(dòng)物或人畜共患病的爆發(fā)和流行，不僅使養(yǎng)殖業(yè)屢受重創(chuàng)，更引發(fā)了國(guó)民乃至于國(guó)際上對(duì)我國(guó)公共衛(wèi)生、食品安全的關(guān)注和擔(dān)憂(yōu)，由此突顯了從根本上提高我國(guó)動(dòng)物疫病防控水平的緊迫性和重要性。隨著我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度越來(lái)越大，雞群受疫病侵害的危險(xiǎn)性也越來(lái)越大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)家禽的發(fā)病率和死亡率在12% 20%以上，高于發(fā)達(dá)國(guó)家4 8倍。家禽傳染病的流行一方面給養(yǎng)雞生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，影響了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入和養(yǎng)殖積極性；另一方面，又會(huì)造成雞肉及相關(guān)產(chǎn)品中病原微生物和藥物殘留，降低肉、蛋品質(zhì)，威脅人類(lèi)健康。如何控制畜禽疫病的流行，全面提升動(dòng)物防疫技術(shù)水平，已成為影響?zhàn)B雞業(yè)可持續(xù)性發(fā)展的主要障礙和瓶頸。雞的主要病毒性傳染病有雞新城疫(ND)、禽流感 (Al)、傳染性支氣管炎(IB)、減蛋綜合征(EDS)、傳染性法氏囊(IBD)、馬立克氏病(MD)、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病(RE)、雞傳染性貧血病(CIA)、禽白血病(AL)等，其中大部分是能導(dǎo)致機(jī)體免疫抑制的疫病。雞新城疫、禽流感是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)的傳染性疾病，高致病性禽流感更是世界養(yǎng)禽業(yè)的頭號(hào)大敵，常常引起感染雞群的大規(guī)模死亡。目前，HJ2亞型禽流感已遍布全國(guó)。雖然壓隊(duì)亞型禽流感病毒為低致病力毒株，即使人工感染也不一定引起死亡，但引起的產(chǎn)蛋下降和與其它病原混合感染或繼發(fā)感染，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。對(duì)于該病的防治， 國(guó)內(nèi)外的研究均表明，用壓隊(duì)亞型禽流感病毒研制禽流感油乳劑滅活疫苗，可以有效地預(yù)防該病。疫苗是應(yīng)用病原微生物或其代謝產(chǎn)物等，經(jīng)過(guò)一系列生產(chǎn)工藝而制備的生物制劑，應(yīng)用于畜禽后可被機(jī)體很好地吸收，且無(wú)毒、無(wú)副作用和有害殘留，是一種安全、高效的動(dòng)物保健制劑，可以廣泛用于無(wú)公害動(dòng)物性食品的生產(chǎn)和發(fā)展健康養(yǎng)殖業(yè)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外動(dòng)物疫病防控的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合我國(guó)的具體國(guó)情，應(yīng)用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種，是提高動(dòng)物疫病防疫水平最為重要的措施之一。當(dāng)前，多聯(lián)疫苗已成為動(dòng)物生物制品行業(yè)的研究熱點(diǎn)，其中包括雞新城疫-H9亞型禽流感(ND-AI(H9)) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，該二聯(lián)苗不含活病毒，具有安全性好、免疫持續(xù)期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是滅活疫苗僅能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞免疫刺激作用很小，更不能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。免疫抑制是指由于各種因素影響，使得機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答能力低下甚至缺失的現(xiàn)象。造成免疫抑制的因素很多，包括疾病、應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)等。由病原微生物感染而引起的免疫
3抑制尤為嚴(yán)重。在禽類(lèi)，有些免疫抑制性疾病具有明顯的臨床癥狀，其危害易被認(rèn)識(shí)到，而有些雖不表現(xiàn)臨床癥狀，但由于免疫抑制使機(jī)體免疫力低下，從而造成對(duì)多種致病因子易感性增強(qiáng)及疫苗免疫失敗。所以，家禽的免疫抑制性疾病不僅因疾病本身造成發(fā)病及死亡， 同時(shí)由免疫抑制造成的一系列惡性結(jié)果，給養(yǎng)禽生產(chǎn)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，由于家禽出現(xiàn)的免疫抑制問(wèn)題越來(lái)越多，對(duì)免疫增強(qiáng)劑的研究也越來(lái)越受到有關(guān)專(zhuān)家的重視。現(xiàn)在多數(shù)研究著眼于使用各種免疫增強(qiáng)劑來(lái)提高機(jī)體特異性和非特異性免疫功能、防止免疫抑制的發(fā)生。常用的免疫增強(qiáng)劑有鹽酸左旋咪唑、硒、福氏佐劑、油佐劑、維生素E、蜂膠、中藥制劑(黃芪、黨參、香菇等多糖物質(zhì))以及細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)移因子和干擾素、白細(xì)胞介素)寸。鹽酸左旋咪唑(LMS)是一種廣譜高效的抗線(xiàn)蟲(chóng)藥物，以后又被發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)作用。LMS的咪唑環(huán)可與免疫細(xì)胞上的胸腺生成素受體結(jié)合，刺激T細(xì)胞分化及對(duì)抗原的反應(yīng)，增加干擾素的產(chǎn)量，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的吞噬作用。鹽酸左旋咪唑?qū)τ诩?xì)胞免疫功能受到抑制的動(dòng)物作用更為明顯，能將低下的免疫功能調(diào)整到正常水平。所以 LMS雖無(wú)抗微生物的作用，但可提高雞對(duì)細(xì)菌及病毒感染的抵抗力，可使受抑制的細(xì)胞免疫功能恢復(fù)正常。目前認(rèn)為，鹽酸左旋咪唑?qū)γ庖叻磻?yīng)的調(diào)節(jié)作用與劑量有關(guān)，劑量小無(wú)免疫調(diào)節(jié)作用，劑量大不但沒(méi)有調(diào)節(jié)作用有時(shí)反而有抑制作用，甚至?xí)l(fā)生中毒。只有適合的劑量才能增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。因此，對(duì)于不同動(dòng)物種類(lèi)、同一動(dòng)物不同日齡或體重、同一動(dòng)物不同的使用途徑和方法，其使用劑量都有差異，只有經(jīng)過(guò)大量應(yīng)用試驗(yàn)，方能找出針對(duì)某種動(dòng)物適用的劑量。傳統(tǒng)的油乳劑滅活疫苗能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)，但其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)很弱。LMS是一種良好的免疫增強(qiáng)劑，它不僅能增強(qiáng)細(xì)胞免疫機(jī)能，還能使受抑制的吞噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞功能恢復(fù)正常，而且也可提高疫苗的體液免疫反應(yīng)，大大增強(qiáng)疫苗的免疫效果。 有關(guān)LMS作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于雞群疫苗免疫的研究較多，主要集中在通過(guò)口服途徑提高疫苗的免疫效力，而將LMS加入油乳劑滅活疫苗的報(bào)道則少見(jiàn)，更未見(jiàn)在雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中添加LMS的報(bào)道。有關(guān)研究結(jié)果表明給6周齡雛雞口服鹽酸左旋咪唑， 對(duì)雞新城疫病毒感染雞可顯著增加抗體滴度；用MD疫苗免疫的同時(shí)口服鹽酸左旋咪唑促進(jìn)了馬立克氏病疫苗接種雞細(xì)胞免疫和體液免疫的功能，外周血液中T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化明顯增強(qiáng)，血清內(nèi)抗MD特異性抗體明顯升高。另有報(bào)道在ND油乳劑滅活疫苗中加入適量的鹽酸左旋咪唑，可以明顯提高疫苗免疫雞的HI抗體水平。有關(guān)專(zhuān)利資料敘述在禽霍亂油乳劑滅活疫苗水相中加入鹽酸左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E注射液，可使禽霍亂疫苗在免疫期內(nèi)攻毒保護(hù)率達(dá)94. 4% 97. 6% (專(zhuān)利號(hào)200510027333. 4)；在禽傳染性鼻炎疫苗水相中加入鹽酸左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E注射液，在免疫期內(nèi)攻毒保護(hù)率達(dá)100% (專(zhuān)利號(hào) 200510027331.5)；將1 5%左旋咪唑加入囊尾蚴細(xì)胞液中制備成豬囊尾蚴疫苗。在所有報(bào)道和專(zhuān)利資料中，未見(jiàn)有在ND-AI (H9)滅活病毒液中添加LMS，制備成雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，通過(guò)抗原濃縮技術(shù)，增加雞新城疫-H9亞型禽流感(ND-AI (H9)，下同)二聯(lián)油乳劑滅活疫苗溶液?jiǎn)挝恢械目乖浚⒃谥泼邕^(guò)程中加入適合劑量的免疫增強(qiáng)劑——鹽酸左旋咪唑(LMS)，以提高常規(guī)油乳劑滅活疫苗的免疫效力，制備出一種增效型的雞ND-H9AI 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗。 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，包括雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗、免疫增強(qiáng)劑鹽酸左旋咪唑和油佐劑。在每ml雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中加入了 0. 5 16mg鹽酸左旋咪唑。所述油佐劑為白油佐劑，在每ml雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中含有0. 66 0. 75ml的白油佐劑。所述白油佐劑成分的重量配比進(jìn)口注射用白油94份、司班-806份和硬脂酸鋁2 份。一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟(1)用雞新城疫病毒La Sota株、H9亞型禽流感病毒HP株分別接種易感雞胚，經(jīng)過(guò)孵育，收獲感染胚液，通過(guò)抗原濃縮裝置，將含毒胚液濃縮，再用甲醛溶液滅活，制成滅活的ND-AI (H9)混合濃縮毒液；(2)按比例將鹽酸左旋咪唑準(zhǔn)確添加到滅活的新城疫、H9亞型禽流感混合毒液中， 并在毒液中加入質(zhì)量3% 5%的Tween-80 ；(4)然后將加有鹽酸左旋咪唑的混合毒液按體積比1 3水油比緩緩加入到油相中，用乳化罐充分乳化，制成雙佐劑滅活疫苗；(5)進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)以及安全性和效力檢驗(yàn)，待檢驗(yàn)合格后，得到雞 ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗。所述油相為白油佐劑，白油佐劑的制備為按重量份數(shù)，將進(jìn)口注射用白油94份、 司班-806份和硬脂酸鋁2份充分混合后高壓滅菌，冷卻后待用。所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗在提高雞體液免疫、增強(qiáng)雞細(xì)胞免疫、提高雞增重率方面的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明人在現(xiàn)有油乳劑滅活疫苗的基礎(chǔ)上，開(kāi)展了在雞 ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中添加免疫增強(qiáng)劑——LMS的試驗(yàn)研究，旨在通過(guò)鹽酸左旋咪唑免疫增強(qiáng)劑來(lái)啟動(dòng)和調(diào)節(jié)家禽的非特異性免疫功能，并特異地增強(qiáng)ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的免疫效力，最終通過(guò)雞自身免疫抵抗力的提高和滅活疫苗的免疫作用，來(lái)預(yù)防新城疫、H9型禽流感的發(fā)生，這對(duì)避免免疫抑制、疫苗免疫失敗現(xiàn)象的發(fā)生，增強(qiáng)雞體液免疫力，防止這兩種疫病的發(fā)生和流行，具有十分重要的實(shí)際意義。同時(shí)對(duì)促進(jìn)生長(zhǎng)和雞增重也有很大的貢獻(xiàn)。同時(shí)本發(fā)明所說(shuō)的雙佐劑是指由司盤(pán)-80、白油、硬脂酸鋁組成的油佐劑，和鹽酸左旋咪唑免疫增強(qiáng)劑。其中白油佐劑能起到緩釋作用，持續(xù)不斷地刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，與抗原物質(zhì)合并使用時(shí)，能延長(zhǎng)免疫期和增強(qiáng)抗原物質(zhì)的免疫原性；鹽酸左旋咪唑能有效地增強(qiáng)油乳劑疫苗的細(xì)胞免疫作用，同時(shí)也能提高疫苗的血清抗體水平。因此雙佐劑的配合，可特異地增強(qiáng)ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗的免疫效力并能持久地發(fā)揮免疫作用。試驗(yàn)證明，雙佐劑用于病毒的滅活疫苗更能起到良好的增強(qiáng)效果。


圖1是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后雞體重增長(zhǎng)圖；圖2是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后雞ND抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律；圖3是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后雞H9AI抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律；圖4是接種不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率值；圖5是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后肉雞體重增長(zhǎng)圖；圖6是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后肉雞ND抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律；圖7是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后肉雞H9AI抗體水平消長(zhǎng)規(guī)律；圖8是免疫不同ND-AI (H9) ニ聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后肉雞淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率值。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明研制的ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，是一種用于預(yù)防雞新城疫、H9亞型禽流感的增效型滅活疫苗，由雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗和免疫增強(qiáng)劑組成，其特征是在常規(guī)雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中每ml添加0. 5_16mg LMS免疫增強(qiáng)劑。用本發(fā)明提供的二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗免疫蛋雞和肉雞，比常規(guī)疫苗的ND、AI (H9) HI抗體滴度提高0. 5 2. 0Log2,能刺激雞體的細(xì)胞免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用，并能調(diào)節(jié)受抑制的免疫功能恢復(fù)正常，能夠比常規(guī)的二聯(lián)苗更好地保護(hù)雞群免受新城疫病毒(NDV)、H9型禽流感病毒(AI(H9)V)的侵襲。本發(fā)明所述的雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，其中的免疫增強(qiáng)劑為鹽酸左旋咪唑，購(gòu)于南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司(批號(hào)為1^080似4，含量為98.5%)；新城疫種毒La Sota毒株購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(E5，AV1615) ;H9亞型禽流感種毒HP毒株來(lái)源于河南農(nóng)大禽病研究所。本發(fā)明所述的雙佐劑滅活疫苗劑型為油乳劑。本發(fā)明采用皮下注射方式，將含LMS的ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗給SPF雞和肉雛雞接種，通過(guò)檢測(cè)疫苗免疫刺激反應(yīng)程度，較系統(tǒng)的研究雙佐劑疫苗對(duì)雞細(xì)胞免疫和體液免疫的影響，目的旨在探索不同劑量LMS對(duì)雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗免疫效果的影響，篩選出適合蛋雞和肉雛雞使用的LMS劑量，為日后規(guī)?；a(chǎn)該疫苗提供科學(xué)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為有效地應(yīng)用于雞群奠定基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開(kāi)了如下的技術(shù)方案本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種用于預(yù)防新城疫、H9型禽流感的增效油乳劑雙佐劑滅活疫苗的制備方法，按如下的步驟進(jìn)行制備(1)按常規(guī)方法制備油相(油佐劑)將進(jìn)口注射用白油94份、司班-806份和硬脂酸鋁2份充分混合后高壓滅菌，冷卻后待用；(2)用雞新城疫種毒La Sota毒株，H9型禽流感種毒HP毒株分別接種易感雞胚， 經(jīng)過(guò)孵育，收獲感染胚液，通過(guò)抗原濃縮裝置，將含毒胚液濃縮，再用甲醛溶液滅活，制成滅活的ND-&AI混合毒液。(3)按一定比例將鹽酸左旋咪唑準(zhǔn)確添加到滅活的ND-AI (H9)混合毒液中，并在毒液中加入質(zhì)量3 5%的Tween-80，充分混合均勻，制成水相；
(4)然后將加有鹽酸左旋咪唑的混合毒液按1 3水油比緩緩加入到油相(油佐劑)中，用乳化罐充分乳化，制成油乳劑滅活疫苗；(5)最后進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)以及安全性和效力檢驗(yàn)，待檢驗(yàn)合格后，得到雞 ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)的用于預(yù)防雞新城疫、H9亞型禽流感的雙佐劑滅活疫苗的免疫試驗(yàn)包括雙佐劑滅活疫苗在增強(qiáng)SPF雞和肉雛雞細(xì)胞免疫和體液免疫方面的應(yīng)用。同時(shí)本發(fā)明也公開(kāi)了雙佐劑滅活疫苗在提高雞增重率方面的應(yīng)用。具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)、方法及結(jié)果如下(一 )試驗(yàn)設(shè)計(jì)本研究將不同劑量的左旋咪添加到常規(guī)的雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中， 以SPF雞和肉雛雞作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)(HI)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法，對(duì)注射雙佐劑滅活疫苗后的雞只進(jìn)行血清中抗體水平和外周淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率值檢測(cè)評(píng)估，從而判斷不同劑量鹽酸左旋咪唑在雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中的免疫增強(qiáng)作用。(二)雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的制備方法本發(fā)明公開(kāi)了預(yù)防新城疫、H9亞型禽流感的鹽酸左旋咪唑-油佐劑雙佐劑滅活疫苗的制備方法，按如下的步驟進(jìn)行制備1按常規(guī)方法制備油相將注射用白油94份、司班-806份和硬脂酸鋁2份充分混合后高壓滅菌，冷卻后待用。2將ND病毒和AI (H9)病毒分別接種10日齡和11日齡易感雞胚，在36°C下孵育3 或4天后置-4°C下冷胚過(guò)夜待收毒；3分別收獲二種接毒雞胚尿囊液，使用濃縮裝置分別濃縮ND病毒和AI (H9)病毒的尿囊液，使其尿囊液中ND病毒含量彡IO8 8EID50, H9AI病毒含量彡IO8 4EID50 ；4在濃縮后的ND病毒液和AI (H9)病毒液中加入0. 2%的甲醛進(jìn)行滅活；5病毒液滅活后，在水相中加入3 5%的Tween-80混合均勻，制成水相；再加入一定劑量的鹽酸左旋咪唑溶液充分混勻；6在乳化罐中將水相與油相按1 3水油比例充分混合乳化，制成雙佐劑滅活疫苗；7最后進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)以及安全性和效力檢驗(yàn)，待檢驗(yàn)合格后，得到 ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗。(三)雞ND-AI(H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的免疫效果試驗(yàn)本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)的預(yù)防新城疫、H9亞型禽流感的鹽酸左旋咪唑-油佐劑雙佐劑滅活疫苗的免疫效果試驗(yàn)包括雙佐劑滅活疫苗對(duì)SPF雞和肉雛雞在體液免疫和細(xì)胞免疫方面的應(yīng)用。1雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗在SPF雞上免疫效力的比較試驗(yàn)1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物20日齡SPF蛋雛雞70只。1. 1. 2試劑濃縮無(wú)菌新城疫和H9亞型禽流感滅活毒液、鹽酸左旋咪唑、白油佐劑； 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)用各種試劑。
1. 1. 3設(shè)施和物品中空超濾濃縮設(shè)備，乳化設(shè)備，制苗用器皿，紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)用藥劑、物品和儀器等。1. 2試驗(yàn)方法1. 2. 1雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的制備在制備N(xiāo)D-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗時(shí)，分別在疫苗水相中加入五個(gè)不同劑量的鹽酸左旋咪唑(表1)，再按水相油相 1 3比例進(jìn)行乳化。1.2.2試驗(yàn)分組和疫苗免疫將20日齡SPF雞分為7組，每組10只。1 5組為試驗(yàn)組，頸部皮下注射添加不同劑量鹽酸左旋咪唑的雞ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗0. 5ml/ 只；第6組為常規(guī)疫苗對(duì)照組，按0. 5ml/只接種不添加鹽酸左旋咪唑的ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗；第7組為空白對(duì)照組，注射同一劑量的生理鹽水(表1)。表IND-H9AI 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗中左旋咪唑添加劑量及試驗(yàn)分組
組另Ij左旋咪唑添加劑量(mg/ml)試驗(yàn)雞數(shù)注射途徑注射劑量第1組二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗+110只頸部皮下0. 5 ml/只第2組二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗+210只頸部皮下0. 5 ml/只第3組二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗+410只頸部皮下0. 5 ml/只第4組二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗+810只頸部皮下0. 5 ml/只第5組二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗+1610只頸部皮下0. 5 ml/只第6組常規(guī)二聯(lián)油乳劑滅活疫苗10只頸部皮下0. 5 ml/只第7組空白對(duì)照組(生理鹽水)5只頸部皮下0. 5 ml/只1. 2. 3疫苗的安全性在疫苗注射后觀察試驗(yàn)雞的精神、飲食情況以及注射部位的炎癥反應(yīng)，以了解疫苗的安全性。1. 2. 4疫苗對(duì)雞增重的影響在疫苗注射后對(duì)每只雞進(jìn)行稱(chēng)重，并詳細(xì)記錄。1. 2. 5新城疫和氏亞型禽流感HI抗體水平的檢測(cè)在免疫前和免疫后10d、20d、 30d、40d、50d、60d、70d、80d、90d時(shí)，對(duì)各組雞進(jìn)行HI抗體水平的檢測(cè)。1. 2. 6淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)使用四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞免疫功能。在注苗后10d、20d、31d、42d、Md、66d時(shí)，從1 7組各隨機(jī)取5只雞進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞免疫功能。1. 3試驗(yàn)結(jié)果1. 3. 1疫苗的安全性通過(guò)臨床觀察，接種疫苗后，除了試驗(yàn)5組外，其它雞精神、吃料、飲水均正常，注射部位也無(wú)腫脹、破潰和硬結(jié)等異常變化；注射大劑量鹽酸左旋咪唑滅活疫苗的第5組雛雞有一定反應(yīng)，其雞的精神有些沉郁、吃料減少，但1 2天均恢復(fù)正常。1. 3. 2疫苗對(duì)雞增重的影響疫苗對(duì)雞增重的影響試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。從表2和圖1可以看出，接種添加中等劑量鹽酸左旋咪唑疫苗的2、3、4組SPF雞增重效果明顯，平均體重比常規(guī)疫苗組對(duì)照組多出IOOg左右。但是添加大劑量和小劑量鹽酸左旋咪唑疫苗的第5、1組增重效果與未添加鹽酸左旋咪唑苗組差異不顯著，第5組反而有一定的抑制作用。表2免疫不同ND-AI (H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗后雞體重增長(zhǎng)記錄(g)
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權(quán)利要求
1.一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，其特征在于，包括雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗、免疫增強(qiáng)劑鹽酸左旋咪唑和油佐劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，其特征在于， 在每ml雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中加入了 0. 5 16mg鹽酸左旋咪唑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，其特征在于， 所述油佐劑為白油佐劑，在每ml雞ND-AI (H9) 二聯(lián)油乳劑滅活疫苗中含有0. 66 0. 75ml 的白油佐劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗，其特征在于， 所述白油佐劑成分的重量配比進(jìn)口注射用白油94份、司班-806份和硬脂酸鋁2份。
5.一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)用雞新城疫病毒LaSota株、H9亞型禽流感病毒HP株分別接種易感雞胚，經(jīng)過(guò)孵育，收獲感染胚液，通過(guò)抗原濃縮裝置，將含毒胚液濃縮，再用甲醛溶液滅活，制成滅活的 ND-AI (H9)混合濃縮毒液；(2)按比例將鹽酸左旋咪唑準(zhǔn)確添加到滅活的新城疫、H9亞型禽流感混合毒液中，并在毒液中加入質(zhì)量3% 5%的Tween-80 ；(4)然后將加有鹽酸左旋咪唑的混合毒液按體積比1 3水油比緩緩加入到油相中，用乳化罐充分乳化，制成雙佐劑滅活疫苗；(5)進(jìn)行物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)以及安全性和效力檢驗(yàn)，待檢驗(yàn)合格后，得到雞ND-AI(H9) 二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗的制備方法， 其特征在于，所述油相為白油佐劑，白油佐劑的制備為按重量份數(shù)，將進(jìn)口注射用白油94 份、司班-806份和硬脂酸鋁2份充分混合后高壓滅菌，冷卻后待用。
7.如權(quán)利要求1所述的雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗在提高雞體液免疫、增強(qiáng)雞細(xì)胞免疫、提高雞增重率方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雞新城疫-H9亞型禽流感二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗及其制備方法，該二聯(lián)苗是由濃縮并滅活的ND和AI(H9)毒液、鹽酸左旋咪唑和油佐劑組成，其中每ml滅活疫苗中含有0.5-16mg鹽酸左旋咪唑免疫增強(qiáng)劑。使用本發(fā)明制備的增效ND-AI(H9)二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗免疫雞，能有效地提高肉、蛋雞體液免疫及細(xì)胞免疫水平，并有促生長(zhǎng)、提高增重率作用。該二聯(lián)雙佐劑滅活疫苗免疫效果明顯優(yōu)于常規(guī)的雞ND-AI二聯(lián)油乳劑滅活疫苗，可有效保護(hù)雞群免受ND病毒和AI(H9)病毒的侵襲，在免疫期內(nèi)不發(fā)生雞新城疫和H9型禽流感。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102416177SQ201110412639
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者劉建, 劉海霞, 王英珍 申請(qǐng)人:天津瑞普高科生物藥業(yè)有限公司