專利名稱：中藥臘腸豆及其提取物的制藥用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥的用途，具體而言，本發(fā)明涉及中藥臘腸豆及其提取物的用途，屬于中藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的慢性傳染病。HIV主要侵犯、破壞T4淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞免疫功能受損,最終并發(fā)各種機(jī)會(huì)性感染和腫瘤。艾滋病嚴(yán)重地威脅著人類的生存，已引起世界衛(wèi)生組織及各國政府的高度重視。艾滋病在世界范圍內(nèi)的傳播越來越迅猛，嚴(yán)重威脅著人類的健康和社會(huì)的發(fā)展，已成為威脅人們健康的第四大殺手。聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署2006年5月30日宣布自1981年6月首次確認(rèn)艾滋病以來，25年間全球累計(jì)有6500萬人感染艾滋病毒，其中250萬人死亡。到2005年底，全球共有3860萬名艾滋病病毒感染者，當(dāng)年新增艾滋病病毒感染者410萬人，另有280萬人死于艾滋病。據(jù)聯(lián)合國艾滋病規(guī)劃署《2008艾滋病流行狀況報(bào)告》指出，2007年，全球防治艾滋病的努力取得了顯著進(jìn)展，艾滋病流行首次呈現(xiàn)緩和局勢，新增艾滋病毒感染者的數(shù)量以及因艾滋病死亡的人數(shù)都出現(xiàn)下降。2007年全球新增艾滋病毒感染者270萬，比2001年下降了30萬；因艾滋病死亡的人數(shù)為200萬，比2001年下降20萬。人類免疫缺陷病毒(Human Tmmuno deficiency Virus, HIV),顧名思義它會(huì)造成人類免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在美國首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病(獲得性免疫缺陷綜合征)。目前已發(fā)現(xiàn)兩種HIV病毒株系，分別為HIV-1和HIV-2。兩者具有相似的病毒結(jié)構(gòu)和傳播途徑。HIV-1廣泛分布于世界各地，是引起全世界AIDS流行的病原，目前HIV的研究也是以HIV-1為主。自1981年發(fā)現(xiàn)首例艾滋病病例以來，世界各國的科學(xué)家們就致力于尋找抗艾滋病藥物。隨著人們對HIV病毒學(xué)和分子生物學(xué)等方面研究的深入。近年來隨著人們對AIDS更深一步的了解以及對HIV-1感染機(jī)制的闡明，抗HIV的藥物篩選模型逐步建立并取得很好的應(yīng)用，是以病毒酶為目的靶標(biāo)的篩選模型，主要分為以HIV蛋白酶，逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶為靶點(diǎn)的篩選模型。1986年,Kramer等首次報(bào)導(dǎo)HIV蛋白酶(protease)可作為潛在的艾滋病藥物“革巴標(biāo)，，。(Kramer RA.Sehaber MD, Skalla AM, et al.HTLV-1II gag protein is processed inyeas t cells by the virus pol protease[J].Science,1986,231 (4745): 1580-1584.)HIV蛋白酶是由兩條相同的肽鏈組成的同質(zhì)二聚體，具有C對稱軸，每條肽鏈由99個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。HIV蛋白酶的活性中心位于兩條肽鏈之間，由兩個(gè)起催化的天冬氨酸(Asp 25和Asp 25’)組成。在這兩個(gè)天冬氨酸殘基的附近有一個(gè)水分子，在催化過程中此水分子作為親核體。兩個(gè)單體的相同的氨基酸殘基構(gòu)成與底物鍵合的縫隙，其一邊由上述的兩個(gè)天冬氨酸殘基組成，另一邊是由此二聚體形成的β_發(fā)卡式的結(jié)構(gòu)。HIV蛋白酶在病毒復(fù)制過程中的主要作用是將gag和gag-pol基因產(chǎn)物裂解成病毒成熟所需要的結(jié)構(gòu)蛋白(基質(zhì)、殼、核殼)和酶類(蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶)。雖然在體內(nèi)抑制這種酶的活性，其子代病毒仍會(huì)產(chǎn)生，但卻是不成熟和不具傳染性的。因此抑制HIV蛋白酶，可阻止病毒進(jìn)一步感染。目前人們已經(jīng)制備了大量的肽類和非肽類HIV蛋白酶抑制劑。根據(jù)這一思路人們合成了多種HIV-1蛋白酶抑制劑，已有10個(gè)HIV-1蛋白酶抑制劑成功應(yīng)用于臨床，如沙奎那韋、利托那韋、印地那韋、奈非那韋、安普那韋、阿扎那韋、地瑞那韋等。由于HIV-1病毒易變異的特點(diǎn)，耐藥性的問題也隨之出現(xiàn)，而國際上使用的高效的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療(HAART，或稱“雞尾酒療法”)并不能根除體內(nèi)的病毒，而長期的藥物治療也會(huì)帶來一些副作用，且價(jià)格較高(每人每年高達(dá)15000美金)。因此，尋找新型HIV-1蛋白酶抑制劑和找到能有效抑制病毒、修復(fù)人體免疫力、低毒、廉價(jià)的抗HIV藥物仍然是現(xiàn)階段研究人員急需解決的問題。天然產(chǎn)物及其衍生物被用于治療各種疾病由來已久。與合成藥物相比而言，天然產(chǎn)物具有結(jié)構(gòu)多樣性，功能多樣性，副作用低等優(yōu)點(diǎn)，其中傳統(tǒng)中藥更是歷經(jīng)幾千年醫(yī)療驗(yàn)證，因此從中篩選結(jié)構(gòu)新穎，作用方式獨(dú)特的HIV蛋白酶抑制劑具有很大意義。天然產(chǎn)物 又稱次級(jí)代謝產(chǎn)物(Secondary Metabolites),具有結(jié)構(gòu)的多樣性和生物活性的多樣性。天然產(chǎn)物及其衍生物在以往的疾病治療中發(fā)揮了無可限量的作用，也是當(dāng)今藥物研發(fā)過程中最具潛力的資源之一(Newman DJ, Gragg GM, Snader KM.Nat ProdR印，2000，17(3):215-234 ；Lee K-H.J Nat Prod.2004,67(2):273-283)?，F(xiàn)在對中藥等傳統(tǒng)藥物、海洋生物以及微生物代謝過程中的天然產(chǎn)物研究方興未艾，每年都會(huì)有大量結(jié)構(gòu)新穎的化合物被發(fā)現(xiàn)提供出來，這些新穎化合物是合成方法所無法實(shí)現(xiàn)的藥物和藥物先導(dǎo)化合物的重要源泉，在新藥和先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)中起著重要作用。對于天然產(chǎn)物尤其是來源于中藥等的天然產(chǎn)物的研究是很有必要的，因?yàn)橹兴幵谖覈延袛?shù)千年應(yīng)用的歷史，是一個(gè)偉大的藥物小分子化合物的寶庫，因此從中藥等天然產(chǎn)物中進(jìn)行重要病毒或重要疾病相關(guān)靶蛋白抑制劑的篩選是很有必要的。臘腸豆為豆科植物臘腸豆(Cassia fistula L.)的果實(shí)。性味苦涼，清熱解毒，理氣潤腸。治胃痛，瘧疾，感冒，麻疹，水痘，便秘。已有不少專利公開中藥可以作為潛在的抗艾滋病病毒藥物，劉光明等在CN101982187A中公開核桃殼提取物、周英在CN101507778A中公開了茶葉提取物、戴好富等在CN101411796A中公開了檳榔提取物、陳光英等在CN101254224中公開了青梅提取物、吳南屏等在CN1850144中公開了金銀花提取物、張?zhí)m珍在CN1255355中公開了葉下珠提取物均具有抗艾滋病病毒作用。除此之外，沒有有關(guān)臘腸豆(Cassia fistula L.)在抗艾滋病藥物中的應(yīng)用，而且，以上的提取物也沒有能最終確定其抗艾滋病病毒的活性成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明選取Hiv-1蛋白酶作為靶標(biāo)蛋白，通過體外酶活高通量篩選(HTS)作為初步篩選的活性評(píng)價(jià)方法篩選臘腸豆提取物，找出具備發(fā)展為具有全新抗艾滋病潛力的藥物。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了中藥臘腸豆在制備治療艾滋病的藥物中的用途，特別是提供了中藥臘腸豆在制備抑制HIV-1蛋白酶的藥物中的用途。
本文中的中藥臘腸豆是豆科植物臘腸豆(Cassia fistula L.)的果實(shí)。本文中的臘腸豆為臘腸豆原生藥材。本文中的中藥臘腸豆提取物是水提取物或有機(jī)溶劑提取物，優(yōu)選有機(jī)溶劑提取物，其中有機(jī)溶劑提取物優(yōu)選為乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚分別提取得到的提取物或者上述溶劑的兩種以上先后提取得到的提取物。其中，乙醇優(yōu)選95 %的乙醇。其中，臘腸豆的乙醇提取物由以下方法制備得到:取一定量的臘腸豆藥材用95%乙醇進(jìn)行回流提取，料藥比例為2:1 20:1 (L/Kg)，每次提取I 8小時(shí)，共計(jì)提取三次。將提取液經(jīng)過濾后減壓蒸干得浸膏。本發(fā)明以HIV-1蛋白酶為靶點(diǎn)，從臘腸豆提取物中分離提純出HIV-1蛋白酶抑制齊U。本發(fā)明提供的HIV-1蛋白酶抑制劑為自皮杉醇，其中自皮杉醇來自臘腸豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物。本發(fā)明還提供了一種用于制備HIV-1蛋白酶抑制劑的藥物組合物，該藥物組合物是由所述的臘腸豆原生藥材或其有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。以上述中藥臘腸豆或其提取物為活性成分，與藥學(xué)上可接受的輔助添加劑成分混合后，按相應(yīng)的常規(guī)藥物制劑方法，可以制備抑制HIV-1蛋白酶活性、預(yù)防和/或治療艾滋病的藥物。例如，與在口服制劑中可以被接受的崩解劑、賦形劑、潤滑劑、粘合劑、填充劑等常用輔助添加成分混合后，按常規(guī)的操作方法和過程，可以制成為片劑、丸劑、膠囊劑或多種相應(yīng)的緩釋劑、控釋劑等固體口服制劑形式的藥物；與常規(guī)的增溶劑、乳化劑、潤飾劑、起泡或消泡劑等表面活性劑、稀釋劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、矯味劑、增稠劑等混合后，按相應(yīng)的常規(guī)方法，可以制備成為合劑、糖漿、口服液等液體制劑形式的口服藥物；與常規(guī)的懸浮劑、穩(wěn)定劑、分散劑或調(diào)節(jié)溶液滲透壓劑混合，按相應(yīng)的常規(guī)方法，配置成注射液。進(jìn)一步的，本發(fā)明 提供了該藥物組合物的制備方法，包括以下步驟:(a)取一定量的臘腸豆，用1-3倍量的95%乙醇回流提取3次，合并提取液，濃縮得浸膏。(b)稱取一定量步驟(a)中的浸膏，用蒸餾水分散，分別經(jīng)過石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取得到石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層和水層4部分，濃縮以后得相應(yīng)的粗組分。(c)取步驟(b)所得的粗組分，進(jìn)行HIV-1蛋白酶的抑制率測定。(d)利用硅膠柱層析、sephadex LH-20凝膠柱層析色譜法對步驟(C)測得的具有高活性的粗組分，做進(jìn)一步分離。分離過程中遵循活性跟蹤的原則只對有活性的部分進(jìn)行分離純化。(e)將純化的單一組分進(jìn)行核磁共振分析確認(rèn)結(jié)構(gòu)。(f)對步驟(e)確認(rèn)的單一組分進(jìn)行HIV-1蛋白酶抑制活性測定，確定IC5tl值。通過本發(fā)明的HIV-1蛋白酶抑制劑的篩選方案從臘腸豆中提取分離出了 HIV-1蛋白酶抑制劑，其中乙酸乙酯萃取層對HIV-1蛋白酶有明顯的抑制活性，從中分離的二苯乙烯類化合物自皮杉醇對HIV-1蛋白酶的抑制活性IC5tl達(dá)59 μ M。按照本發(fā)明，可以將上述含有中藥臘腸豆或其提取物，或中藥臘腸豆及其提取物與其它具有預(yù)防和/或治療艾滋病作用的西藥或中藥活性成分配伍組成的復(fù)方制劑，按照常規(guī)的制劑技術(shù)，制備成口服制劑或注射劑。


圖1示出HIV-1蛋白酶抑制劑篩選模型的示意圖。圖2示出臘腸豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物的分離純化流程圖。圖3示出臘腸豆的95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物經(jīng)過分離純化后得到的八個(gè)部分的活性篩選結(jié)果。圖4示出自皮杉醇抑制HIV-1蛋白酶的IC5tl曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1臘腸豆原生藥藥品與浸膏制備取中藥臘腸豆為原生藥，按常規(guī)方法粉碎，過篩，制成粒度為60 80目的臘腸豆細(xì)粉，滅菌，分裝即成。稱取2公斤臘腸豆細(xì)粉，用8升95%乙醇提取三次，每次回流3小時(shí)，合并有機(jī)相，濃縮后的浸膏165克。備用。實(shí)施例2HIV-1蛋白酶的表達(dá)、純化、蛋白活性檢測以及IC5tl值的測定

DHIV-1蛋白酶的表達(dá)、純化:a)HIV-1蛋白酶片段的擴(kuò)增及表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物PCR將HIV-1蛋白酶編碼片段擴(kuò)增，回收PCR產(chǎn)物及pET_l Ia載體用NdeI和BamH I酶切，回收目的片段，將酶切后的片段與線性化載體進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化E.col1.DH5a感受態(tài)細(xì)胞。挑取轉(zhuǎn)化的克隆進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆進(jìn)行DNA測序。HIV-1蛋白酶的基因序列:
權(quán)利要求
1.中藥臘腸豆在制備治療艾滋病的藥物中的用途。
2.中藥臘腸豆在制備抑制HIV-1蛋白酶的藥物中的用途。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述臘腸豆為豆科植物臘腸豆(Cassia fistula L.)的果實(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述臘腸豆為臘腸豆的原生藥材。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述臘腸豆經(jīng)有機(jī)溶劑提取。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其中所述有機(jī)溶劑為乙醇、乙酸乙酯、正丁醇或石油醚中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán) 利要求6所述的用途，其中乙醇濃度為95%。
全文摘要
本發(fā)明提供中藥臘腸豆在制備治療艾滋病的藥物中的用途，特別是在制備抑制HIV-1蛋白酶的藥物中的用途。本發(fā)明提供的臘腸豆乙酸乙酯萃取物對HIV-1蛋白酶活性的抑制率為83.4％，從臘腸豆中分離出來的白皮杉醇對HIV-1蛋白酶抑制活性的IC50值為59μM。
文檔編號(hào)A61P31/18GK103156907SQ201110410429
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者陳衛(wèi)強(qiáng), 楊誠, 馮金磊, 張壇杰, 李金楠, 唐延婷, 郭宇 申請人:天津市國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院