專利名稱：一種組織工程化傳導束及其構(gòu)建方法與應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程技術(shù)領域，具體涉及一種用于治療心臟房室傳導阻滯疾病的組織工程化傳導束及其制備方法與應用。
背景技術(shù)：
目前生物起搏治療房室傳導阻滯的思路是利用基因轉(zhuǎn)染或細胞移植的方法在傳導阻滯部位以下(如室間隔或左右心室壁)建立一個新的穩(wěn)定起搏點，提供并提高心室自主節(jié)律，從而使患者避免接受電子心臟起搏器的植入，達到生物心臟起搏所倡導的理想治療狀態(tài)。然而，外源基因?qū)胫委熋媾R諸多的困難，如基因在體內(nèi)缺乏長期穩(wěn)定的表達并且難以有效的調(diào)控；不能得到高效、安全、導向性好的載體系統(tǒng)等。細胞移植的方法，理論上可以克月艮上述基因?qū)氲木窒扌?Gepstein L. Cardiovascular therapeutic aspects of cell therapy and stem cells, Ann N Y Acad Sci，2006 ; 1080 :415-425)，然而，移植的細胞極易在心臟內(nèi)遷移、彌散，不能形成穩(wěn)定統(tǒng)一的心臟節(jié)律或傳導通路。特別是，導入基因和細胞在心室創(chuàng)建新的起搏點、力圖提高心室自主節(jié)律治療房室傳導阻滯的思路，和安置電子起搏器一樣，畢竟只是對傳導阻滯所產(chǎn)生癥狀的一個緩解治療，對心臟功能的全面改善和疾患的徹底治愈作用有限。針對上述基因轉(zhuǎn)染和細胞移植治療房室傳導阻滯存在的問題和面臨的困難，并綜合考慮生物起搏治療研究的現(xiàn)狀，利用傳導束細胞和支架材料在體外構(gòu)建組織工程化的傳導束，將之移植到心臟中修復或再建心臟傳導通路，應為房室傳導阻滯治療課題的理想解決方案。這一方案包括兩種思路其一是利用構(gòu)建好的組織工程化傳導束替代修復傳導通路中的阻滯點，從而使竇性節(jié)律的擴布在房室間暢通無阻，其二是利用構(gòu)建好的組織工程化傳導束在房室之間新建一條傳導通路，從而另辟溪徑溝通房室之間的沖動傳送。考慮到組織工程化傳導組織移植到傳導通路上的困難，第二種思路新建房室之間的傳導通路具有較好的可行性。房室傳導阻滯的位點一般發(fā)生在房室間隔內(nèi)的傳導路徑上，大體位置約在 Koch三角的區(qū)域，包括房室結(jié)以及與之相連的房結(jié)區(qū)和結(jié)束區(qū)。理論上，將組織工程化傳導束埋于房室交界處冠狀溝心外膜下的合適位置，則可越過阻滯位點并溝通其兩端的傳導， 達到對房室阻滯的治療目的。目前國內(nèi)外尚無構(gòu)建組織工程化傳導束的研究報道，僅有個例報道關于利用工程化組織構(gòu)建物新建房室傳導通路的研究。Choi等利用骨骼肌細胞和matrigel在體外構(gòu)建了一個組織體，并將之移植到大鼠心臟冠狀溝心外膜下，對再建房室傳導通路做了初步的嘗試。結(jié)果表明該構(gòu)建物可以和周圍宿主心肌建立電機械耦聯(lián)，并且允許房室之間有電沖動傳導，初步證明了利用生物工程化組織再建房室傳導通路的可行性(Choi YH, et al. Cardiac conduction through engineered tissue, Am J Pathol,2006 ； 169(1) 72-85)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種組織工程化傳導束。本發(fā)明的另一目的在于提供該組織工程化傳導束的構(gòu)建方法及其應用。本發(fā)明是利用膠原海綿和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導獲得的心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程化傳導束，用于治療心臟房室傳導阻滯的移植體。在構(gòu)建組織工程化傳導束的發(fā)明過程中，本發(fā)明人曾選用過殼聚糖、水凝膠、脫細胞基質(zhì)作為支架，但上述支架在生物力學性能和與細胞復合性能方面效果相對較差，因此最終選擇膠原海綿作為支架。本發(fā)明的關鍵在于如何利用膠原海綿和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導獲得的心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程化傳導束。膠原海綿是一種可降解的生物支架材料，在體外培養(yǎng)條件下隨著培養(yǎng)環(huán)境的改變和時間的推移會逐漸的萎縮和降解。且種子細胞在其上的生長是否良好亦受種植的時間、濃度、方式很大的影響。因此，控制種子細胞種植的時間、濃度、方式以及支架材料的大小、形狀等，是利用膠原海綿和心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程傳導束的關鍵。鑒于上述情況，本發(fā)明采用骨髓間充質(zhì)干細胞誘導獲得的心臟傳導細胞作為種子細胞，膠原海綿作為支架，在體外構(gòu)建具有心電傳導特性的組織工程傳導束，為治療心臟房室傳導阻滯疾病提供移植體。本發(fā)明提供了一種組織工程化傳導束的構(gòu)建方法，具體方法如下1.與心耳肌細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成為心臟傳導細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細胞，取心耳部位組織進行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細胞。然后利用細胞培養(yǎng)池將心耳肌細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)2天之后，再施加旁分泌因子內(nèi)皮素-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(濃度范圍1X10_8M-1.5X10_8M，培養(yǎng)時間 6-7天)，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成為心臟傳導細胞。通過對縫隙鏈接蛋白40、HCN2等標記物的檢測進行心臟傳導細胞鑒定。2.利用膠原海綿和誘導獲得的心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程化傳導束將誘導成功的心臟傳導細胞制備成細胞懸液(濃度范圍lX106f/ml_1.2X106 個/ml)，采用沉淀法(參見《組織工程學教程》，人民軍醫(yī)出版社，2001版)將細胞懸液滴到支架材料(即膠原海綿支架)上，不使其溢出為準，種植該細胞到膠原海綿支架上(種植密度3 X IO5個/cm3-6 X IO5個/cm3)，定期更換培養(yǎng)液在體外條件下培養(yǎng)10-20天，直到細胞支架復合體形成有功能的傳導束，體外電刺激檢測傳導速率。上述的組織工程化傳導束的構(gòu)建方法中，膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提供。將膠原海綿剪成1.5X1.0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用。上述的組織工程化傳導束的構(gòu)建方法中，取誘導獲得的心臟傳導細胞，加0. 25% 胰酶(Gibco公司)1ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1_2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察， 細胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，1200轉(zhuǎn)低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 X IO6個/ml，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｉ鲜龅慕M織工程化傳導束的構(gòu)建方法中，于6孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細胞懸液， 將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。上述的心耳肌細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞可以選自犬、大鼠、兔子、小鼠等。
本發(fā)明還提供了經(jīng)上述方法構(gòu)建得到的組織工程化傳導束。本發(fā)明還提供了經(jīng)上述方法構(gòu)建得到的組織工程化傳導束在制備治療房室傳導阻滯疾病的移植體中的應用。本發(fā)明經(jīng)動物實驗證明，本發(fā)明構(gòu)建成功的組織工程化傳導束移植治療房室傳導阻滯取得良好效果。通過心臟移植手術(shù)，將構(gòu)建成功的組織工程化傳導束移植連接到心臟冠狀溝兩側(cè)房室心肌中，分別于兩周和一個月后給移植動物造房室傳導阻滯，心電圖監(jiān)測組織工程化傳導束改善房室傳導的情況。本發(fā)明獲取了一種具有心電傳導特性、可用于治療移植的組織工程化傳導束，為治療心臟房室傳導阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。


圖1 正常犬肢體二導聯(lián)(Lead II )心電2 房室傳導阻滯模型(射頻消融房室結(jié))犬肢體二導聯(lián)心電3 移植組織工程化傳導束犬消融房室結(jié)后心電圖
具體實施例方式現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。實施例1 誘導獲得的犬心臟傳導細胞種植到膠原海綿構(gòu)建組織工程化傳導束1、誘導犬骨髓間充質(zhì)干細胞制備心臟傳導細胞(1)分離、培養(yǎng)犬骨髓間充質(zhì)干細胞和犬心耳肌細胞A、骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)犬全骨髓直接貼壁法培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞抽取成年雜交犬(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，15千克)髂骨骨髓10ml，900Xg離心lOmin，棄上清與脂肪；加入紅細胞裂解液TrisNH4Cl,40C 5min去除紅細胞，以IX 106/ml接種于纖粘連蛋白(FN) (Sigma公司) 包被的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為60% DMEM-F12 (Gibco公司),10% FCS(Gibco公司)UOng/ml EGF(cytolab 公司)、1000U/ml LIF(Chemicon 公司)。24小時后去除懸浮未貼壁細胞，每3天換液1次，直到需要傳代。B、犬心耳肌細胞的分離培養(yǎng)取幼犬心耳肌組織塊；剪成Imm大小的碎塊，在0. 07%的胰酶(Gibco公司)中 4°C過夜消化。第一次的消化液棄去，再加入新鮮0. 07%的胰酶，37°C消化15分鐘，吸出消化液并中止消化，重復2-3次，直至全部組織塊消化完全。將消化液用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，IOOOrpm離心8min，加入含20% FBS (Gibco公司)的DMEM-F12培養(yǎng)基(Gibco公司)，37°C 5% (X)2培養(yǎng)4小時，吸出含未貼壁細胞的培養(yǎng)液在6孔板中培養(yǎng)，調(diào)整細胞數(shù)至 1 X 105/ml細胞，每孔接種2ml。培養(yǎng)48小時后換液。每孔加入2ml含0. lmmol/L BrdU (Sigma 公司)和20% FBS的DMEM-F12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。(2.)骨髓間充質(zhì)干細胞向心臟傳導細胞方向的誘導分化A、骨髓間充質(zhì)干細胞向心臟傳導細胞方向的誘導骨髓間充質(zhì)干細胞加入Transwell小室(Gibco公司)，密度為每孔1 X IO4個細胞。將種植細胞的Transwell小室插入生長心耳肌細胞的6孔板中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后，在上述六孔板和Transwell小室，加入旁分泌因子內(nèi)皮素_1 (Tocris)和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1 (RD公司)，使其終濃度為10_8M，連續(xù)培養(yǎng)7天后進行檢測鑒定誘導細胞。B、骨髓間充質(zhì)干細胞向心臟傳導細胞誘導后的鑒定犬骨髓間充質(zhì)干細胞誘導后倒置相差顯微鏡可以觀察到單個細胞的搏動，細胞形態(tài)大部分為梭形和三角形。免疫細胞化學檢測誘導前后細胞縫隙連接蛋白40(CX40)和HCN2(武漢博士德公司)的表達，結(jié)果顯示CX40和HCN2的陽性表達明顯升高(p<0. 05)，表明胚胎源性多能干細胞已經(jīng)向心臟傳導細胞方向轉(zhuǎn)化。全細胞膜片鉗技術(shù)檢測單個細胞的動作電位，顯示舒張末期有自動去極化，證明誘導后細胞為傳導細胞。2、組織工程化傳導束的構(gòu)建(1)膠原海綿準備膠原海綿由無錫貝迪生物有限公司提供。將膠原海綿剪成1.5X1. 0X0. 2cm大小，用鈷6°照射12小時以上消毒備用。(2)犬心臟傳導細胞接種膠原海綿取誘導獲得的心臟傳導細胞，加0.25%胰酶(Gibco公司)lml，于37°C、5% (X)2 培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的 DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司)Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，1200轉(zhuǎn)低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 X IO6個/ml，置4°C冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ?孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細胞懸液，將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細胞懸液， 種植密度總計約為3. 3Χ IO5個/cm3，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2周，每2天換一次液。3、組織工程化傳導束的檢測鑒定(I)HE染色觀察心臟傳導細胞在膠原海綿上的生長將上述生長2周的心臟傳導細胞和膠原海綿復合體制備成石蠟切片進行HE染色， 步驟如下蘇木素液染lOmin，自來水沖洗，75%鹽酸乙醇溶液分化30s，水洗lh，95%乙醇 1 2min，伊紅復染1 2min，95%乙醇1 2min，脫水透明，中性樹膠封片。通過HE染色觀察細胞膠原海綿復合體中心臟傳導細胞生長均勻、接觸緊密，心臟傳導細胞與膠原海綿復合良好。(2)多導生理儀檢測細胞膠原海綿復合體傳導速率使用多導生理儀檢測細胞膠原海綿復合體傳導速率，結(jié)果顯示電沖動的傳導速度為2. 363士0. 256m/s，類似在體傳導組織電沖動傳導速率，證明所構(gòu)建細胞膠原海綿復合體 (組織工程化傳導束)具有心臟傳導束的特性。實施例2 其余同實施例1，在骨髓間充質(zhì)干細胞向心臟傳導細胞方向的誘導中加入旁分泌因子內(nèi)皮素-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1濃度選1. 5X 10_8M，誘導培養(yǎng)時間選6天，組織工程化傳導束構(gòu)建中細胞種植密度選4X IO5個/cm3。
實施例3 其余同實施例1，骨髓間充質(zhì)干細胞和心耳肌細胞選大鼠。實施例4 組織工程化傳導束移植體內(nèi)觀察傳導效果通過開胸手術(shù)將上述實施例1構(gòu)建成功的組織工程化傳導束移植到犬(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，15千克)房室交界處的心外膜下，即將組織工程化傳導束連接到心臟冠狀溝兩側(cè)房室心肌中；移植前3天開始應用環(huán)孢素A (北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，劑量為0. 25mg/天)和潑尼松龍(上海通用藥業(yè)股份有限公司，劑量為0. Img/天)抑制免疫排斥反應。結(jié)果顯示移植組織可以在宿主心肌中存活，移植組織中的細胞和宿主心肌細胞形成了電機械藕聯(lián)；移植一個月后消融動物房室結(jié)，心電圖(奧爾科特生物有限公司)監(jiān)測顯示組織工程化傳導束可改善房室間傳導，證實所構(gòu)建的組織工程化傳導束具有再建心臟房室傳導通路的潛能，如圖1、2、3所示。
權(quán)利要求
1.一種組織工程化傳導束的構(gòu)建方法，其特征在于該方法包括如下步驟A、與心耳肌細胞共培養(yǎng)誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成為心臟傳導細胞抽取骨髓接種培養(yǎng)獲得骨髓間充質(zhì)干細胞，取心耳部位組織進行原代培養(yǎng)獲得心耳肌細胞，然后利用細胞培養(yǎng)池將心耳肌細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)2天之后，再施加旁分泌因子內(nèi)皮素-1和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1，濃度均為1 X 10_8M-1. 5 X ，培養(yǎng)時間為6-7天， 誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成為心臟傳導細胞；B、利用膠原海綿和誘導獲得的心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程化傳導束將誘導成功的心臟傳導細胞制備成細胞懸液，濃度為1 X IO6個/ml-1. 2X IO6個/ml， 采用沉淀法將細胞懸液滴到膠原海綿支架上，不使其溢出為準，種植該細胞到膠原海綿支架上，種植密度為3 X IO5個/cm3-6X IO5個/cm3 ；培養(yǎng)10-20天，直到細胞支架復合體形成有功能的傳導束。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程化傳導束的構(gòu)建方法，其特征在于其中的膠原海綿剪成1.5X1.0X0. 2cm大小，用鈷6(1照射12小時以上消毒備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種組織工程化傳導束的構(gòu)建方法，其特征在于其中的步驟 B具體為取誘導獲得的心臟傳導細胞，加0. 25%胰酶1ml，于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中消化1_2分鐘，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞胞體回縮呈圓形，加含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基Iml終止消化，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，1200轉(zhuǎn)低速離心5分鐘，棄去上清液，加入含血清的培養(yǎng)液，用玻璃滴管吹打成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為1 X IO6個/ml，置4°C冰箱保存于6孔培養(yǎng)板底滴加50 μ 1的細胞懸液，將膠原海綿置于細胞懸液中，待海綿將細胞懸液吸收后再向海綿表面滴加50μ 1的細胞懸液，置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育1小時，再向培養(yǎng)孔中加入2ml新鮮含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37°C，含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，每2天換一次液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種組織工程化傳導束的構(gòu)建方法，其特征在于其中的心耳肌細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞可以選自犬、大鼠、兔子或小鼠。
5.一種如權(quán)利要求1至4任一所述的組織工程化傳導束的構(gòu)建方法得到的組織工程化傳導束。
6.一種如權(quán)利要求5所述的組織工程化傳導束在制備治療房室傳導阻滯疾病的移植體中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學工程技術(shù)領域，目前基因轉(zhuǎn)染和細胞移植治療房室傳導阻滯存在很多問題和困難，綜合考慮生物起搏治療研究的現(xiàn)狀，利用傳導束細胞和支架材料在體外構(gòu)建組織工程化的傳導束，將之移植到心臟中修復或再建心臟傳導通路，應為房室傳導阻滯治療課題的理想解決方案。但目前國內(nèi)外尚無構(gòu)建組織工程化傳導束的研究報道。本發(fā)明目的在于提供一種組織工程化傳導束和構(gòu)建方法，是利用膠原海綿和骨髓間充質(zhì)干細胞誘導獲得的心臟傳導細胞構(gòu)建組織工程化傳導束。本發(fā)明的組織工程化傳導束具有心電傳導特性、可用于治療移植，為治療心臟房室傳導阻滯所致心律失常疾病帶來了希望。
文檔編號A61L27/24GK102488922SQ20111040581
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者吳愛群, 張傳森, 張喜, 李玉泉, 楊向群, 藺海燕 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學