專(zhuān)利名稱(chēng)：抑制PAR-1基因表達(dá)的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抑制PAR-I (蛋白酶激活受體-1)基因表達(dá)的SiRNA(小分子干擾RNA) 及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
幾乎所有肝病均具有炎癥壞死，而只要有炎癥壞死，肝纖維化即發(fā)生。肝纖維化的不斷發(fā)展，引起肝小葉結(jié)構(gòu)改建和假小葉形成，導(dǎo)致肝硬化；纖維組織壓迫血管，引起門(mén)脈高壓和肝缺血，進(jìn)而加劇肝細(xì)胞壞死和炎癥，如此形成惡性循環(huán)。因此，阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)防治肝硬化具有重要意義。而且我國(guó)肝病發(fā)病率是比較高的國(guó)家之一，所以尋找有效途徑抑制肝纖維化，有相當(dāng)重要的意義。肝纖維化和它導(dǎo)致的最后階段的肝硬化，通常是由病毒感染，過(guò)度使用損害肝臟的藥物，代謝系統(tǒng)疾病，和遺傳因素引起的。肝纖維化的病理進(jìn)程，實(shí)際上是正常的肝組織被疤痕類(lèi)似的膠原蛋白代替，導(dǎo)致肝功能的喪失，過(guò)去認(rèn)為這個(gè)過(guò)程是一個(gè)不可逆的過(guò)程， 直到最近才認(rèn)為這個(gè)過(guò)程在早期是可以挽救的。根據(jù)目前的研究，表明星狀細(xì)胞在這個(gè)過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。正常的肝臟中，星狀細(xì)胞大約占肝體積的1.4%，相當(dāng)于每100個(gè)肝細(xì)胞中大約有3. 6-6個(gè)星狀細(xì)胞。纖維化的過(guò)程實(shí)際上是來(lái)自于門(mén)靜脈和竇周的α平滑肌細(xì)胞骨架陽(yáng)性的肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生和增殖的過(guò)程。雖然這種細(xì)胞有不止一種的潛在來(lái)源， 但被研究的最為清楚的就是肝星狀細(xì)胞，在它們沒(méi)有被活化成α平滑肌細(xì)胞骨架陽(yáng)性表型的細(xì)胞之前，它們的主要功能是貯存維生素Α，調(diào)節(jié)維甲酸的水平?？梢坏┍换罨螅鼈兙统蔀楦卫w維化中纖維膠原的主要來(lái)源，而且它們通過(guò)收縮和釋放致炎和致纖維因子，潛在的調(diào)節(jié)竇間隙的血流量?；罨男菭罴?xì)胞還能產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑，導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶降解肝細(xì)胞外基質(zhì)的功能受損，從而使細(xì)胞外基質(zhì)向膠原和纖維化轉(zhuǎn)變。隨著RNAi作為制藥技術(shù)的成熟，已有SiRNA藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，siRNA藥物具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)、特異性強(qiáng)，堿基的順序決定了它的特異性；(2)、設(shè)計(jì)便利，由于人類(lèi)基因庫(kù)已經(jīng)完成，這為siRNA的設(shè)計(jì)帶來(lái)了極大的便利，可以說(shuō)幾乎沒(méi)有基因不能作為siRNA的靶標(biāo)；03)、臨床研究便利，siRNA藥物作為核酸類(lèi)藥物，不管何種siRNA都具有大致相同的藥物代謝，藥物分布，藥物毒性，這為進(jìn)入臨床研究帶來(lái)了極大的便利；、由于RNAi —開(kāi)始就已將特定基因作為靶標(biāo)，所以siRNA分子藥理學(xué)明確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用RNAi (RNA干擾)技術(shù)，對(duì)候選的靶標(biāo)基因進(jìn)行效用、量效關(guān)系及特異性的評(píng)定，以提供能夠抑制PAR-I (蛋白酶激活受體-1)基因表達(dá)的siRNA(小分子干擾RNA)，并進(jìn)一步地提供該siRNA在臨床上的應(yīng)用。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，所述siRNA為下述PAR-1-01 PAR-1-08中的任意一種，PAR-1-01 PAR-1-08 分別為PAR-1-01
正義鏈序列SEQIDNO.1為5'-AGGGCAGUCUACUUAAAUA-3
反義鏈序列SEQIDNO.2為5，-UAUUUAAGUAGACUGCCCU-3 ’
PAR-1-02
正義鏈序列SEQIDNO.3為5'-CGGCC⑶GGUGUACAUGCU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.4為5'-AGCAUGUACACCACGGCCG-3 ‘
PAR-1-03
正義鏈序列SEQIDNO.5為5'-CCUUCAAGAUCAGCUACUA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.6為5'-UAGUAGCUGAUCUUGAAGG-3‘
PAR-1-04
正義鏈序列SEQIDNO.7為5'-ACAUGUACGCCUCCAUCAU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.8為5'-AUGAUGGAGGCGUACAU⑶-3‘
PAR-1-05
正義鏈序列SEQIDNO.9為5'-GCAUCUUCAUC⑶CUGCUU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.10 為 5'-AAGCAGACGAUGAAGAUGC-3‘
PAR-1-06
正義鏈序列SEQIDNO.11 為 5'-CCACCAAC⑶CCUCCUGAU-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.12 為 5'-AUCAGGAGGAC⑶UG⑶GG-3‘
PAR-1-07
正義鏈序列SEQIDNO.13 為 5'-GCAGGGCAGUCUACUUAAA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.14 為 5'-UUUAAGUAGACUGCCCUGC-3‘
PAR-1-08
正義鏈序列SEQIDNO.15 為 5'-GCUCUAGCCACCUGAAUAA-3‘
反義鏈序列SEQIDNO.16 為 5'-UUAUUCAGGUGGCUAGAGC-3‘
上述的各siRNA序列的3‘端垂懸兩個(gè)dTdT，該垂懸不與mRNA序列互補(bǔ)，使正義鏈3'端更容易解鏈，從而增加其沉默效率。
上述的各siRNA序列可用于制備治療肝纖維化的藥物。
siRNA是RNAi途徑中的中間產(chǎn)物，是RNAi發(fā)揮效應(yīng)所必需的因子。siRNA的形
成主要由Dicer和Rde-I調(diào)控完成。由于RNA病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄等原因，細(xì)胞中出現(xiàn)了 dsRNA，Rde-I (RNAi缺陷基因-1)編碼的蛋白質(zhì)識(shí)別外源 dsRNA,當(dāng)dsRNA達(dá)到一定量的時(shí)候，Rde-I引導(dǎo)dsRNA與Rde-I編碼的Dicer (Dicer是一種 RNaseIII活性核酸內(nèi)切酶，具有四個(gè)結(jié)構(gòu)域=Argonaute家族的PAZ結(jié)構(gòu)域，III型RNA酶活性區(qū)域，dsRNA結(jié)合區(qū)域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區(qū))結(jié)合，形成酶-dsRNA復(fù)合體。 在Dicer酶的作用下，細(xì)胞中的單鏈靶mRNA(與dsRNA具有同源序列)與dsRNA的正義鏈互換，原來(lái)dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA復(fù)合物中釋放出來(lái)，然后，在ATP的參與下，細(xì)胞中存在的一種RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體RNA-induced silencing complex (RISC, 由核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、解旋酶等構(gòu)成，作用是對(duì)靶mRNA進(jìn)行識(shí)別和切割)利用結(jié)合在其上的核酸內(nèi)切酶的活性來(lái)切割dsRNA上處于原來(lái)正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA 反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，形成21-23nt的dsRNA小片段，這些小片段即為siRNA。RNAi干涉的關(guān)鍵步驟是組裝RISC和合成介導(dǎo)特異性反應(yīng)的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中，然后與靶標(biāo)基因編碼區(qū)或UTR區(qū)完全配對(duì)，降解靶標(biāo)基因，因此說(shuō)siRNA只降解與其序列互補(bǔ)配對(duì)的 mRNA。其調(diào)控的機(jī)制是通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)而沉默相應(yīng)靶位基因的表達(dá)，所以是一種典型的負(fù)調(diào)控機(jī)制。siRNA識(shí)別靶序列是有高度特異性的。而且它的合成非常簡(jiǎn)便，已經(jīng)成為一項(xiàng)很成熟的技術(shù)。本發(fā)明針對(duì)PAR-I基因設(shè)計(jì)合成了 8對(duì)siRNA，該8對(duì)siRNA能夠有效抑制PAR-I 基因的表達(dá)；同時(shí)由于siRNA技術(shù)越來(lái)越成熟，也為治療肝纖維化提供了可行的藥物。


圖1為可見(jiàn)光源條件下的siRNA轉(zhuǎn)染效率照片。圖2為熒光激發(fā)條件下的siRNA轉(zhuǎn)染效率照片。圖3為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同siRNA的PAR-I基因表達(dá)水平圖。圖中M0CK是未轉(zhuǎn)染任何siRNA的空白對(duì)照組；si-control是轉(zhuǎn)染si-control的 siRNA 的無(wú)關(guān)對(duì)照組；PAR-1-01 PAR-1-08 是轉(zhuǎn)染 PAR-1-01 PAR-1-08 的 siRNA 組圖4為熒光定量PCR檢測(cè)肝纖維化病理過(guò)程(天數(shù))與PAR-I的mRNA的表達(dá)水平關(guān)系圖。圖中天數(shù)用于衡量肝纖維化病理過(guò)程圖5為熒光定量PCR檢測(cè)肝纖維化病理過(guò)程(天數(shù))與TGF-betal的mRNA的表達(dá)水平關(guān)系圖。圖中天數(shù)用于衡量肝纖維化病理過(guò)程圖6為熒光定量PCR檢測(cè)肝纖維化病理過(guò)程(天數(shù))與Collal的mRNA的表達(dá)水平關(guān)系圖。圖中天數(shù)用于衡量肝纖維化病理過(guò)程圖7為PAR-1-01的siRNA在不同濃度下的量效曲線(xiàn)。圖8為原代肝星型細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)圖。圖9為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞(體外培養(yǎng) 48小時(shí))的PAR-I基因表達(dá)水平圖。圖10為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞(體外培養(yǎng) 48小時(shí))的TGF-betal、Collal基因表達(dá)水平圖。圖11為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞 (體外培養(yǎng)48小時(shí))的TGF-betal、Collal基因表達(dá)水平圖。圖12為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞(體外培養(yǎng) 5天)的PAR-I基因表達(dá)水平圖。圖13為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞(體外培養(yǎng) 5天)的TGF-betal、Collal基因表達(dá)水平圖。圖14為熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度的PAR-1-01的siRNA的原代肝星型細(xì)胞 (體外培養(yǎng)5天)的TGF-betal、Collal基因表達(dá)水平圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明利用PCR和Wfesternblot技術(shù)確定了 HSC-T6肝星型細(xì)胞能夠在RNA和蛋白水平大量表達(dá)PAR-I基因，所以本發(fā)明采用大鼠HSC-T6肝星型細(xì)胞系(來(lái)自于湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù))作為siRNA篩選細(xì)胞，該細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)劑(含10%體積比的胎牛血清中)，培養(yǎng)條件為37°C，5%體積比的二氧化碳，每三天傳代一次。1、siRNA的設(shè)計(jì)合成根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理，針對(duì)PAR-I基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了 8對(duì)siRNA(參見(jiàn)表 1)。PAR-1-01 PAR-1-06設(shè)計(jì)成大小鼠同源的siRNA，目的主要是為了能夠利用大鼠的 HSC-T6細(xì)胞系進(jìn)行siRNA的篩選，而不必從大鼠或小鼠的肝臟中分離肝星型細(xì)胞，同時(shí)在后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中能夠利用小鼠作為病理模型，由于小鼠體重較大鼠輕很多，所以給藥劑量可以大大減少，可以大大減低siRNA合成費(fèi)用。設(shè)計(jì)方法及步驟為(1)利用NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)分別找到大鼠和小鼠PAR-I基因的RNA序列，它們?cè)贜CBI的Accessions分別為NM_012950. 2和NM_010169. 3 ； (2)利用CLUSTAL X (2. 0)序列比對(duì)軟件將兩條序列進(jìn)行比對(duì)并找到同源部分；(3)利用Whitehead Institute在其網(wǎng)站(網(wǎng)址為:http//jura, wi. mit. edu/bioc/siRNAext/home. php)上發(fā)布的siRNA設(shè)計(jì)軟件，針對(duì)同源部分進(jìn)行設(shè)計(jì)；(4)利用NCBI的blastn的程序，調(diào)用數(shù)據(jù)庫(kù)nt/nr進(jìn)行分析，結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的這6對(duì) siRNA不會(huì)與大鼠、小鼠除PAR-I基因之外的其它基因的序列同源。PAR-1-07 PAR-1-08 是僅針對(duì)大鼠PAR-I基因的siRNA設(shè)計(jì)，目的在于去除同源序列這個(gè)限制因素，使得siRNA 的設(shè)計(jì)結(jié)果更加可靠。上述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供合成。為提高所述siRNA的基因沉默效率，所述PAR-1-01 PAR-1-08的siRNA的 3'端垂懸有兩個(gè)由脫氧核苷組成的堿基TT。
權(quán)利要求
1.抑制PAR-I基因表達(dá)的siRNA，其特征在于，所述siRNA為 PAR-1-07 正義鏈序列 SEQ ID NO. 13 為 5，- GCAGGGCAGUCUACUUAAA- 3， 反義鏈序歹Ij SEQ ID NO. 14 為 5，- UUUAAGUAGACUGCCCUGC- 3，。
2.如權(quán)利要求1所述的抑制PAR-I基因表達(dá)的siRNA，其特征還在于，所述siRNA的3’ 端垂懸有兩個(gè)用于提高基因沉默效率的由脫氧核苷組成的懸掛堿基TT。
3.如權(quán)利要求1或2所述的抑制PAR-I基因表達(dá)的siRNA，其特征于，所述siRNA序列用于制備治療肝纖維化的藥物。
全文摘要
本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原理，針對(duì)PAR-1基因的mRNA序列設(shè)計(jì)了8對(duì)siRNA，該8對(duì)siRNA可以用于抑制PAR-1基因表達(dá)的siRNA，由于PAR-1基因的表達(dá)水平與肝纖維化密切相關(guān)，抑制PAR-1基因的表達(dá)就能有效延緩甚至阻斷肝纖維化的病理進(jìn)程，達(dá)到治療肝硬化的目的。上述8對(duì)siRNA序列可用于制備治療肝纖維化的藥物。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102382838SQ20111037767
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者張紅, 潘振華, 盛青松 申請(qǐng)人:無(wú)錫奧瑞生物醫(yī)藥科技有限公司