專利名稱：一種具有粘接性能的人工骨材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工骨材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
高能量損傷導(dǎo)致的粉碎骨折越來越多見，這在一定程度上給臨床醫(yī)生的治療帶了困難。特別是近關(guān)節(jié)的粉碎骨折，較小的碎骨片很難固定，如果去除過多勢(shì)必導(dǎo)致骨缺損， 影響骨折的愈合；如果按解剖位置放回又難以維持骨片的穩(wěn)定性，影響關(guān)節(jié)面的對(duì)合，造成后期創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。雖然目前對(duì)于粉碎骨折塊的治療可以通過螺釘、鋼針、鋼絲、 絲線等進(jìn)行固定，或僅保持骨折的力線位置讓其自行愈合，但如果粉碎骨折塊之間間隙較大或?qū)筒涣迹瑢?huì)明顯影響骨折的愈合時(shí)間及骨折的再塑型時(shí)間。采用醫(yī)用粘合劑對(duì)骨碎塊進(jìn)行粘合復(fù)位是目前較有前途的一種治療方法。然而， 目前普遍使用的醫(yī)用粘合劑或多或少都存在一些缺陷。如粘度和聚合速度難以控制，韌性差及耐水性差，凝固后柔軟性差。在骨組織粘接中，如骨折縫較大，膠體涂抹過多，由于降解緩慢會(huì)起到板障作用，影響骨折的愈合。分解時(shí)會(huì)產(chǎn)生有毒的甲醛；纖維蛋白類膠粘劑的粘接強(qiáng)度較低，又是血液制劑，不容易被病人所接受；傳統(tǒng)的骨科粘合劑-聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥，粘合強(qiáng)度較高，但在粘合過程中會(huì)產(chǎn)生有毒的單體，且在骨間容易形成較厚的阻隔影響骨折愈合。即使是近年來發(fā)展的磷酸鈣、磷酸鎂骨水泥，在改善骨愈合性能上有了很大提高，尤其是在骨缺損填充性能上表現(xiàn)優(yōu)異，但其粘合強(qiáng)度仍不理想。因此，研制具有生物活性、可控生物降解的人工骨材料，既具有骨缺損填充性能， 又具有較好粘接性能，成為醫(yī)用生物型骨粘合劑研究開發(fā)的主要目標(biāo)。隨著骨組織工程學(xué)的發(fā)展，針對(duì)臨床不同需求進(jìn)行不同類型組織工程骨的構(gòu)建已成為當(dāng)今研究的趨勢(shì)。羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)是天然骨的主要無機(jī)成分，在骨質(zhì)中大約占60wt%，其基本單元是針狀磷灰石晶體。HA具有良好的生物活性和生物相容性，大量研究表明HA具有較強(qiáng)的骨傳導(dǎo)和骨誘導(dǎo)性，能與骨組織較好的結(jié)合，是一種性能非常優(yōu)良的骨修復(fù)材料。20世紀(jì)50年代以來，科學(xué)家對(duì)人工合成的HA進(jìn)行了深入的研究， 合成出了純度很高的HA單晶。但是易碎、強(qiáng)度差、韌性差的缺點(diǎn)制約了 HA的臨床應(yīng)用。納米羥基磷灰石(n-HA)復(fù)合材料是指納米尺寸的HA與其他材料復(fù)合而成的新型材料。由于在結(jié)構(gòu)上與天然骨更為接近，n-HA復(fù)合材料比相應(yīng)的微米復(fù)合材料具有更好的生物學(xué)性能；同時(shí)優(yōu)化材料的組成、結(jié)構(gòu)和工藝將可能得到力學(xué)性能與天然骨更為匹配的骨修復(fù)材料。目前研究的n-HA復(fù)合材料可分為兩類非降解的和可降解的。在與n-HA復(fù)合的材料中可降解聚合物殼聚糖目前成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。殼聚糖(Chit0San，CQ是一種從海洋生物蝦蟹外殼中提取的天然多糖類物質(zhì)，在體內(nèi)可被吸收和利用，無免疫原性，與組織和細(xì)胞有很好的相容性。它的分子結(jié)構(gòu)和軟骨基質(zhì)糖氨多糖(GAG)結(jié)構(gòu)相似，對(duì)軟骨細(xì)胞有較好的吸附作用，促進(jìn)細(xì)胞在材料上的增殖與分化；促進(jìn)成骨細(xì)胞增值并持續(xù)表達(dá)I型膠原纖維。目前大量的研究證實(shí)納米羥基磷灰石/殼聚糖復(fù)合人工骨是一種性能非常優(yōu)良的骨修復(fù)材料。而海藻酸鈉(sodium alginate, SAL)是從天然海藻中提取的一種分子膠體，由于生物相容性好，且有較好的粘合性，已在組織工程中得到了廣泛的應(yīng)用。上述研究表明，羥基磷灰石、殼聚糖、海藻酸鈉具有良好的生物活性，適合作為生物活性材料。但如何將它們制備成既具有骨缺損填充性能，又具有較好粘接性能的人工骨材料，尚缺乏這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面提供了一種具有粘接性能的人工骨材料，該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，其中，羥基磷灰石 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的檸檬酸衍生物為檸檬酸與N-羥基琥珀亞胺發(fā)生反應(yīng)獲得的酯化產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)優(yōu)選70 25 5 60 30 10。更優(yōu)選的，65 28 7。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，該人工骨材料的固相組分和液相組分比例優(yōu)選1. 6 1 2. 5 l(g/ml)。更優(yōu)選的 2 1。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍優(yōu)選3mmoL/L 6mmoL/L。更優(yōu)選的，4mmoL/L。本發(fā)明另一方面提供了上述人工骨材料的制備方法，其包括步驟固相組分的制備1)分別配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的水溶液，配制的這四種水溶液中Ca(NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)= 60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻后，再加入Ca (NO3) 2溶液混合攪拌均勻；3)在溫度為35°C 55°C的條件下，攪拌步驟(2)獲得的混合溶液的同時(shí)加入 (NH4)2HPO4溶液，攪拌速度為15 30轉(zhuǎn)/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度為0. 4-0. 6mol/ min(以每分鐘添加的(NH4)2HPO4的摩爾數(shù)計(jì))，pH值控制在8. 8 10. 3，攪拌12小時(shí)以上；4)陳化、過濾，取固相；液相組分的制備 1)將檸檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1- (3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺的存在下，加入N-羥基琥珀亞胺進(jìn)行酯化反應(yīng)獲得所述的檸檬酸衍生物；2)再制備濃度范圍為ImmoL/L lOmmoL/L檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液；將上述制得的固相組分與液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即獲得所述的骨粘合劑。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，所述固相組分制備的步驟4)中，將過濾取得的固相洗滌后，置于醇溶劑中超聲分散，再攪拌至少12小時(shí)后，再次過濾后取固相。
本發(fā)明的人工骨材料，既是具有骨缺損填充性能的骨材料，又是具有較好粘接性能的骨粘合劑，同時(shí)也具有生物活性，可控生物降解性。具體的醫(yī)用效果方面，本發(fā)明的人工骨材料既能將粉碎的骨折塊粘接達(dá)到解剖復(fù)位，又能在骨折塊間隙及骨缺損處起到有效地填充作用，既保持正常骨的形態(tài)、保持了骨片的穩(wěn)定，又不影響骨折的愈合。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1固相組分制備1)按照羥基磷灰石的化學(xué)摩爾計(jì)量比Ca/P = 1. 67分別配制12ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和IOml的0. 05g/ml的(NH4)2ΗΡ04溶液備用；制備2%羧甲基殼聚糖的水溶液 IOml ；制備2%海藻酸鈉的水溶液5ml ；2)然后將海藻酸鈉溶液和羧甲基殼聚糖溶液混合連續(xù)攪拌證使其完全混合均勻；再將Ca(NO3)2溶液加入到混合液中混勻；3)在40°C下劇烈攪拌(攪拌速度為20轉(zhuǎn)/min)混合液同時(shí)將(NH4)2HPO4溶液逐漸滴入，滴加速度^il/min，該過程pH值維持在9 10左右，攪拌M小時(shí)后；4)所得漿料于室溫下陳化一天，將沉淀過濾、洗滌沉淀；為防止團(tuán)聚可以再將沉淀物在乙醇中超聲分散，并攪拌12小時(shí)，再次過濾后于80°C真空烘干，并研磨成粉，玻璃瓶密封。液相組分制備將3g檸檬酸加入到15ml 二甲基甲酰胺(DMF)中，在1_(3_ 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺(EDC)(濃度0. 015% )存在下和N-羥基琥珀亞胺(HOSu)(濃度 0. 4% )反應(yīng)制得檸檬酸衍生物(CAD)。再將檸檬酸衍生物加入到二甲基亞砜(DMSO)溶液， 使CAD濃度為4mmoL/L，玻璃瓶密封備用。人工骨材料的漿體制備按照固相組分液相組分=1.0 0.5(g ml)，用藥匙攪拌1 2min，形成均勻的漿狀物即獲得實(shí)施例1的人工骨材料漿體。實(shí)施例2固相組分制備1)按照羥基磷灰石的化學(xué)摩爾計(jì)量比Ca/P = 1. 67分別配制6ml的0. lg/ml的 Ca(NO3)2溶液和6ml的0. 05g/ml的(NH4)2HPO4溶液備用；制備2%羧甲基殼聚糖的水溶液 35ml ；制備2%海藻酸鈉的水溶液20ml ；步驟2)-4)同實(shí)施例1。液相組分的制備同實(shí)施例1。人工骨材料的漿體制備按照固相組分液相組分=1.2 0.5(g ml)，用藥匙攪拌1 2min，形成均勻的漿狀物即獲得實(shí)施例1的人工骨材料漿體。 人工骨材料性能技術(shù)指標(biāo)測(cè)定如下1)ρΗ 值測(cè)定分別取實(shí)施例1、2獲得人工骨材料的固相組分1. 0g，加入5ml去離子水，再加入 0. 5ml 液相組分，pH 電子測(cè)試儀測(cè)量 lmin、5min、10min、20min、30min、lh、2h、10h、24h 的 pH值。
結(jié)果固化過程中pH值為6. 9 7. 7，符合國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn)。2)固化時(shí)間參照ISO 3107中關(guān)于磷酸鋅水泥的測(cè)試方法，在37°C、100%濕度環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試實(shí)施例1、2獲得人工骨材料的漿體。測(cè)試5個(gè)樣本，取平均值。結(jié)果固化時(shí)間為12 18min，能滿足臨床操作要求。3)抗壓強(qiáng)度測(cè)定將實(shí)施例1、2獲得的人工骨材料的漿體制成8mmX 12mm的圓柱體，在37°C、100% 濕度環(huán)境中進(jìn)行固化，24h后取出樣本，生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上測(cè)試樣本抗壓縮強(qiáng)度。測(cè)試5個(gè)樣本，取平均值。結(jié)果抗壓強(qiáng)度為4. 5士2. 1MP，與人松質(zhì)骨的強(qiáng)度相當(dāng)。4)抗拉強(qiáng)度測(cè)定取新鮮豬股骨頭部松質(zhì)骨標(biāo)本48對(duì)，制備Icm2骨折斷面，隨機(jī)分成6組，每組8 對(duì)。脈沖槍沖洗骨折斷面骨屑，將實(shí)施例1、2獲得的人工骨材料的漿體調(diào)和成糊狀，粘接骨斷面后用骨折固定鉗固定，分別于室溫25°C和37°C、100%濕度下(模擬體內(nèi)環(huán)境)固化30min、a!、24h后，于加載速度為lOmm/min條件下，生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)上測(cè)量股骨頭抗拉強(qiáng)度。結(jié)果豬股骨頭粘接體于室溫25 °C和371、100(%濕度下固化301^11，其抗拉強(qiáng)度分別 77. 21 士 7. 3N/cm2 和 79. 47 士 8. 6N/cm2 ；固化 2h 分別為 96. 38 士 10. 15N/cm2 和 103. 22士 12. 06N/cm2 ；固化 24h 后分別為 112. 46士 14. 43N/cm2 和 117. 16士 18. 54N/cm2。固化相同時(shí)間后不同室溫條件下抗拉強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)。不同室溫條件下固化30min和池其平均抗拉強(qiáng)度分別達(dá)固化24h最大抗拉強(qiáng)度的72%和94%。5)抗稀散性觀察實(shí)施例1、2獲得的人工骨材料的漿體迅速灌入2. 5ml醫(yī)用注射器，于混合后60s 注入蒸餾水中，靜置Mh，觀察抗稀散情況。結(jié)果獲得的人工骨材料固化物仍保持完整，無潰散現(xiàn)象。6)掃描電鏡(SEM)觀察取實(shí)施例1、2獲得的人工骨材料的固化產(chǎn)物，真空干燥后浸入液氮中冷凍，低溫下制造斷裂面，再次干燥后表面噴金，電鏡下直接觀察孔形態(tài)、結(jié)構(gòu)、孔徑和孔的貫通性。結(jié)果固化產(chǎn)物呈多孔結(jié)構(gòu)，孔徑為100 300um，大多數(shù)孔徑為100 150um。各個(gè)孔徑之間還有小孔貫通，材料孔內(nèi)無HA晶體聚集，孔壁上有大量細(xì)小的HA晶體，分布相對(duì)比較均勻，材料具有很高的孔隙率，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。綜上所述，實(shí)施例1、2獲得的人工骨材料，其基本性能完全達(dá)到了目前對(duì)于人工骨材料(醫(yī)用粘合劑、骨水泥等)的醫(yī)用要求標(biāo)準(zhǔn)。人工骨材料漿體的應(yīng)用例1取健康成年新西蘭大白兔72只，體重2 2. 5kg,雌雄不限，隨機(jī)分為6組，每組 12只，每組隨機(jī)選擇6只作為實(shí)驗(yàn)組，另6只作為對(duì)照組。動(dòng)物腹腔內(nèi)注射2. 5%戊巴比妥鈉Omg/kg)，麻醉滿意后，常規(guī)消毒鋪巾，經(jīng)脛前入路，逐層切開皮膚、皮下組織和深筋膜， 顯露脛骨中段，剝離骨膜后，常規(guī)方法鋸斷脛骨制作脛骨中段橫斷骨折模型，實(shí)驗(yàn)組拭干骨折斷端血跡后用實(shí)施例1的人工骨材料漿體粘接骨折斷端并將骨折塊間的縫隙及缺損的部位填充抹平，加壓并維持10 15min，以使?jié){體充分固化。對(duì)照組單純用2. 5mm克氏針?biāo)枨粌?nèi)固定。沖洗傷口后逐層縫合切口，術(shù)后正常飼養(yǎng)，每日肌肉注射青霉素40萬U。術(shù)后 2、4、6、8、10、12周分批分組處死動(dòng)物。術(shù)后大體觀察骨折愈合情況良好。組織切片觀察骨細(xì)胞正常長(zhǎng)入骨折線，10周的組織骨折線已不清晰，證明骨細(xì)胞完全長(zhǎng)入與正常骨組織切片一致，達(dá)到了與克氏針?biāo)枨粌?nèi)固定同樣的效果。人工骨材料漿體的應(yīng)用例2成年健康新西蘭大白兔M只，雌雄各半，體重310 3Mkg。于兔耳緣靜脈注入 3%戊巴比妥鈉靜脈麻醉，側(cè)臥位固定，后肢驅(qū)血后上止血帶。無菌操作下，于兩側(cè)脛骨內(nèi)髁處作皮膚切口，逐層切開，暴露脛骨內(nèi)髁。在脛骨平臺(tái)下約0. 5cm處與平臺(tái)成45，制備雙側(cè)脛骨平臺(tái)骨折模型。隨機(jī)選取一側(cè)為實(shí)驗(yàn)側(cè)，沖凈骨屑，人工骨材料漿體填入骨折斷端，巾鉗固定10 15min后，放松止血帶，縫合。另一側(cè)為對(duì)照側(cè)，采用L形鋼板內(nèi)固定。術(shù)后不作外固定，允許動(dòng)物自由活動(dòng)。術(shù)后隨機(jī)選擇3d，3、6和9周進(jìn)行觀察，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只。X 線片及大體觀察，術(shù)后9周實(shí)驗(yàn)一側(cè)骨折愈合；組織學(xué)觀察9周人工骨材料漿體完全吸收， 骨折完全愈合。本發(fā)明的人工骨材料具有一定的粘合性能，可以將粉碎骨折塊粘接是的骨折片拼接達(dá)到骨折部位的解剖形態(tài)，同時(shí)對(duì)骨折塊間的縫隙及缺損的部位填充(“抹平”縫隙、缺陷)，達(dá)到無縫、無缺損狀態(tài)，既保持正常骨的形態(tài)、保持了骨片的穩(wěn)定，又不影響骨折的愈合，加快新骨的形成和改建，縮短骨折的愈合時(shí)間及骨折的再塑型時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種人工骨材料，其特征在于該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照 0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，其中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)=85 10 5 45 35 20 ；所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液，所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 ImmoL/L 10mmoL/L ；所述的檸檬酸衍生物為檸檬酸與N-羥基琥珀亞胺發(fā)生反應(yīng)獲得的酯化產(chǎn)物。
2.如權(quán)利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)=70 25 5 60 30 10。
3.如權(quán)利要求2所述的人工骨材料，其特征在于所述的固相組分中，羥基磷灰石羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)=65 觀7。
4.如權(quán)利要求1所述的人工骨材料，其特征在于該人工骨材料的固相組分和液相組分比例為 1.6 1 2. 5 l(g/ml)。
5.如權(quán)利要求1所述的人工骨材料，其特征在于所述檸檬酸衍生物的濃度范圍為 3mmoL/L 6mmoL/L0
6.如權(quán)利要求1所述的人工骨材料的制備方法，其特征在于其包括步驟固相組分的制備1)分別配制Ca(N03)2、(NH4)2HPO4、羧甲基殼聚糖和海藻酸鈉的水溶液，配制的這四種水溶液中Ca (NO3)2 (NH4)2HPO4 羧甲基殼聚糖海藻酸鈉(質(zhì)量比)=60 25 10 5 30 15 35 20 ；2)將羧甲基殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液混合攪拌均勻后，再加入Ca(NO3)2溶液混合攪拌均勻；3)在溫度為35°C 55 °C的條件下，攪拌步驟(2)獲得的混合溶液的同時(shí)加入 (NH4)2HPO4溶液，攪拌速度為15 30轉(zhuǎn)/min，(NH4)2HPO4溶液的添加速度為0. 4-0. 6mol/ min，pH值控制在8. 8 10. 3，攪拌12小時(shí)以上；4)陳化、過濾，取固相；液相組分的制備1)將檸檬酸溶解在二甲基甲酰胺中，并在1-(3- 二甲基氨丙基)-3-碳化二亞胺的存在下，加入N-羥基琥珀亞胺進(jìn)行酯化反應(yīng)獲得所述的檸檬酸衍生物；2)再制備濃度范圍為ImmoL/L lOmmoL/L檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液；將上述制得的固相組分與液相組分按照0.8 1 4 1 (g/ml)的比例混合均勻即獲得所述的骨粘合劑。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述固相組分制備的步驟4)中，將過濾取得的固相洗滌后，置于醇溶劑中超聲分散，再攪拌至少12小時(shí)后，再次過濾后取固相。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工骨材料及其制備方法，該人工骨材料由其固相組分和液相組分按照0.8∶1～4∶1(g/ml)的比例混合制備而成，所述的固相組分包含羥基磷灰石、羧甲基殼聚糖、海藻酸鈉，所述的液相組分為檸檬酸衍生物的二甲基亞砜溶液。本發(fā)明的人工骨材料，既是具有骨缺損填充性能的骨材料，又是具有較好粘接性能的骨粘合劑，既能將粉碎的骨折塊粘接達(dá)到解剖復(fù)位，又能在骨折塊間隙及骨缺損處起到有效地填充作用，既保持正常骨的形態(tài)、保持了骨片的穩(wěn)定，又不影響骨折的愈合。
文檔編號(hào)A61L27/12GK102363049SQ20111036005
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者肖海軍, 薛鋒 申請(qǐng)人:上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院