專利名稱：抑制黑色素生成的siRNA分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA分子及其應(yīng)用，尤其是抑制黑色素生成的siRNA分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小眼 畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(microphthalmia-associatedtranscription factor,MITF)，又稱小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，在黑色素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)上起著重要作用。MITF具有基本-螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic-helix-loop-helix-leucine zipper,bHLHZip)結(jié)構(gòu)(Hodgkinson CA 等，1993, Cell, 744:395_404)。人類的 MITF 基因定位于人類第三條染色體3P141-3P12 3。研究證實其在色素細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。MITF基因突變導(dǎo)致色素細(xì)胞的發(fā)育缺陷與功能障礙，同時MITF與其他信號分子發(fā)生復(fù)雜的相互作用。MITF可調(diào)控酪氨酸基因家族的表達(dá)，從而參與黑素生成的調(diào)控(Shibahara，S等，Pigment Cell Res，1998，11:329_336)。酪氨酸酶基因家族的三個成員:酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-1 (TRP-1)，酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2 (TRP-2)，基因的啟動子都含有一個“M box”的結(jié)構(gòu)，M box的核心結(jié)構(gòu)為“CATGTG”，MITF可以與該結(jié)構(gòu)結(jié)合，從而反式激活相應(yīng)的基因表達(dá)。MITF通過與酪氨酸酶基因家族啟動子的作用，一方面指導(dǎo)它們在黑素細(xì)胞中特異性表達(dá)，另一方面參與外界刺激對黑素細(xì)胞黑素生成的調(diào)控。根據(jù)人酪氨酸基因缺失和突變分析，發(fā)現(xiàn)在酪氨酸啟動子有三個結(jié)構(gòu):TDE、M box和E box，這三個結(jié)構(gòu)均含有“CATGTG”核心模色，它們對于酪氨酸在色素細(xì)胞中有效表達(dá)是必須的，而在非色素細(xì)胞中具有同樣結(jié)構(gòu)的啟動子僅有微弱表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MITF與這些結(jié)構(gòu)結(jié)合，刺激啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。MITF本身也具有細(xì)胞特異性，MITF在酪氨酸酶的黑素細(xì)胞特異性表達(dá)中起著關(guān)鍵作用。TRP-1和TRP-2也具有M-box結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在酪氨酸家族高度保守，MITF可與TRP-1基因M-box結(jié)合而活化其表達(dá)，并指導(dǎo)其在黑素細(xì)胞中特異性表達(dá)。(Aksan I等，Mol CellBiol,1998，18(12):6930_8)。黑色素細(xì)胞是皮膚的重要組成細(xì)胞之一，起源于胚胎神經(jīng)嵴，具有樹狀突起，屬于腺細(xì)胞，合成的黑素經(jīng)由樹狀突起分泌進(jìn)入角質(zhì)形成細(xì)胞，隨角質(zhì)形成細(xì)胞的脫落而排出體外，存在于表皮基底層。黑色素細(xì)胞通過合成黑色素形成皮膚顏色，同時可吸收紫外線，使機(jī)體免遭紫外線的損害。哺乳動物皮膚和毛發(fā)的顏色主要是由黑色素細(xì)胞產(chǎn)生的黑色素的相對數(shù)量和分布情況決定的(Sturm RA等，Bioessays, 1998, 20:712)0黑色素又分為真黑色素(Eu-melanin)(棕/黑)和假黑色素(Pheo-melanin)(紅/黃色)(Newton JM等,Mamma Genome, 2000,11:24)。黑色素細(xì)胞的發(fā)育、分化與黑色素的合成調(diào)節(jié)是一個復(fù)雜的過程，其中有多種信號分子參與該過程的調(diào)控，構(gòu)成復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)，其中MITF在其中扮演重要的角色。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是生物界中一種既古老且在進(jìn)化上又高度保守的現(xiàn)象，是由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的基因轉(zhuǎn)錄后沉默(Andrew Fire 等，Nature，1998，391:806_811)。小干擾 RNA (siRNA)是RNAi的效應(yīng)分子，由兩條互補(bǔ)的RNA單鏈構(gòu)成，長2廣23個核苷酸(nt)。由于RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以技術(shù)廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究、傳染性疾病以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。有研究報道，通過RNAi調(diào)節(jié)抑制MITF基因，可以調(diào)控下游酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)基因和酪氨酸酶相關(guān)蛋白I (tyrosinase relatedprotein-1，TRP-1)基因(Busca B 等，J Cell Biol，2005，49)，從而調(diào)控黑色素的生成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的 目的在于提供一種通過siRNA分子庫技術(shù)篩選出的高效靶向MITF基因的雙鏈siRNA分子，其下述正義鏈和反義鏈組成:
正義鏈:5’-GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’ (SEQ ID NO: 3)
反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’ (SEQ ID NO: 4)
其中，N為胞嘧啶核苷C、鳥嘌呤核苷G、腺嘌呤核苷A、尿嘧啶核苷U ;脫氧胞嘧啶核苷dC、脫氧鳥嘌呤核苷dG、脫氧腺嘌呤核苷dA或脫氧胸腺嘧啶核苷dT。換句話說，該雙鏈siRNA分子的主干序列為:
正義鏈:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGA-3’(SEQ ID NO: 5)
反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCC-3’(SEQ ID NO: 6)
在一個優(yōu)選的實施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是兩個脫氧胸腺嘧啶dTdT。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制備美白祛斑化妝品和治療高黑色素相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明針對參與黑色素形成調(diào)控的MITF基因的構(gòu)建siRNA分子庫，通過高通量篩選的方法篩選出能有效抑制黑色素生成的siRNA，通過RNAi調(diào)節(jié)抑制MITF基因，從而調(diào)控黑色素的生成。本發(fā)明篩選到的靶向MITF基因的siRNA可以作為藥物制劑或化妝品的一種有效成份，用于下調(diào)皮膚中黑色素基因的表達(dá)，以減少色素的含量和沉著，祛除皮膚上的斑點，如老年斑、痘印、色素斑、雀斑、妊娠斑或其它由陽光、炎癥、藥物等因素引起的色素變化，從而使人體肌膚變白。體外實驗證明，本發(fā)明的SiRNA分子的反義鏈可特異性地與MITF基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，下調(diào)黑色素相關(guān)基因的表達(dá)，最終抑制黑色素的生成，無明顯毒副作用。


圖1是合成的MITF基因保守區(qū)開放閱讀框瓊脂糖凝膠電泳檢測圖，制備得到的DNA片段大小為1563bp。左側(cè)條帶是DNA分子量Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖2是siRNA分子庫構(gòu)建流程示意圖。圖3是“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框結(jié)構(gòu)示意圖。圖4是PCR制備的“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框純化后瓊脂糖凝膠電泳檢測圖(部分)。圖中，最右側(cè)條帶是DNA分子量Marker (標(biāo)準(zhǔn)參照)。圖5是“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實時定量PCR檢測MITF基因的mRNA表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實驗組,縱坐標(biāo)表示MITF相對于GAPDH的mRNA表達(dá)水平，其中箭頭所指是M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組。圖6是化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實時定量PCR檢測MITF基因的mRNA表達(dá)量柱形圖，橫坐標(biāo)表示各處理實驗組，縱坐標(biāo)表示MITF相對于GAPDH的mRNA表達(dá)水平，其中M001-24為M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，“陰性對照組”為陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組。圖7是siRNA轉(zhuǎn)染 細(xì)胞后細(xì)胞生長曲線圖。橫坐標(biāo)表示各處理實驗組，縱坐標(biāo)表示各實驗組所測得的OD值(A45tl值)，其中M001-24為M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，“陰性對照組”為陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組。圖8是siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞中黑色素含量相對于正常組的柱形圖。橫坐標(biāo)表示各處理實驗組，縱坐標(biāo)表示黑色素相對于正常組百分含量，其中M001-24為M001-24轉(zhuǎn)染組，“正常組”為正常培養(yǎng)細(xì)胞未轉(zhuǎn)染組，“陰性對照組”為陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組。
具體實施例方式本發(fā)明的siRNA分子來源于針對MITF基因開放閱讀框的保守區(qū)而制備的siRNA分子庫，本發(fā)明所用siRNA分子庫技術(shù)是百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù)(中國發(fā)明專利申請?zhí)枮?200710024217.6，專利名稱:PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備方法)，其優(yōu)點在于所制備得到的siRNA隨機(jī)分布于MITF開放閱讀框區(qū)段，長度可控性分布于19-23 bp，可以提高有效靶位點的命中率。siRNA的制備可采用多種方法，比如:化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄、酶切長鏈dsRNA、載體表達(dá)siRNA、PCR合成siRNA表達(dá)元件等，這些方法的出現(xiàn)為研究者提供了可選擇的空間，可以更好地獲得基因沉默效率。在細(xì)胞中，作為該siRNA分子的另一種表達(dá)形式，可將其制備成DNA表達(dá)框形式，比如:U6啟動子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動子。本發(fā)明的siRNA分子可以作為美白祛斑化妝品中的有效成份，也可以作為治療高黑色素相關(guān)疾病的有效成份。出于應(yīng)用目的，可將SiRNA分子作為藥物直接給藥于受藥者身上特定部位，比如色素斑塊。優(yōu)選地，本發(fā)明的siRNA作為美白祛斑化妝品中的有效成份。出于應(yīng)用目的，siRNA分子可以與其它輔助劑制成適當(dāng)劑型，只要其適合于應(yīng)用、并且能恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。任選地，上述藥物劑型中可以包含任何藥學(xué)可接受的輔助劑，只要其適合于相應(yīng)的給藥體系、并且恰當(dāng)?shù)乇３謘iRNA分子的活性。為了實現(xiàn)本發(fā)明的設(shè)計思想并驗證篩選得到的siRNA的抑制黑色素生成的效果，設(shè)計了如下實驗方案:
(I)構(gòu)建凋亡抑制因子MITF基因開放閱讀框的siRNA分子庫，該分子庫中包含靶向至MITF基因的siRNA效應(yīng)分子，長度分布于19-23 bp。(2)制備具有相應(yīng)效應(yīng)的siRNA表達(dá)框，其結(jié)構(gòu)為“U6啟動子-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl啟動子”，使其更易于體外篩選。
(3 )運用實時定量PCR檢測方法，檢測上述siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄出的效應(yīng)siRNA分子對MITF基因的抑制作用。(4)化學(xué) 合成上述方法篩選得到的siRNA，在體外細(xì)胞實驗中進(jìn)一步運用實時定量PCR檢測方法檢測MITF基因的mRNA表達(dá)水平。(5)用CCK8法檢測上述篩選到的siRNA對細(xì)胞的毒性。(6)用已有報道的方法，檢測上述篩選到的siRNA對細(xì)胞黑色素生成的影響。下述實施例僅用于闡明本發(fā)明，并非是對本發(fā)明進(jìn)行限制。實施例1 siRNA分子庫的制備
1.MITF基因靶序列的獲得:美國NCBI數(shù)據(jù)庫中MITF基因共有八種轉(zhuǎn)錄變異體(transcript variant)序列,選擇有代表性的轉(zhuǎn)錄變異體1(NCBI數(shù)據(jù)庫號:NM_198159)開放閱讀框(Open Reading Frame, 0RF)進(jìn)行合成，由百奧邁科生物技術(shù)(Biomics Biotech)有限公司全基因合成長度為1563bp的MITF的ORF序列(全長基因瓊脂糖凝膠電泳檢測圖如圖1所示)。用PCR的方法制備MITF基因的兩段保守區(qū)，分別用引物:
保守區(qū) I 上游引物:5’ -AGGTGCAGACCCACCTCGAAA-3’ (SEQ ID NO: 7)；
保守區(qū) I 下游引物:5’ -TGTGAGCTCCCTTTTTATGTTG-3’ (SEQ ID NO: 8)；
保守區(qū) 2 上游引物:5’ -AGTCTGAAGCAAGAGCACTGG-3’ (SEQ ID NO: 9)；
保守區(qū) 2 下游引物:5’-CTAACAAGTGTGCTCCGTCTC-3’ (SEQ ID NO: 10)，
擴(kuò)增其保守區(qū)作為靶序列合成構(gòu)建siRNA分子庫，擴(kuò)增長度分別為527bp(SEQ ID NO:1)和 683bp (SEQ ID NO: 2)。保守區(qū)1:527bp
481aggtg cagacccacc tcgaaaaccc
541 caccaagtac cacatacagc aagcccaacg gcagcaggta aagcagtacc tttctaccac 601 tttagcaaat aaacatgcca accaagtcct gagcttgcca tgtccaaacc agcctggcga 661 tcatgtcatg ccaccggtgc cggggagcag cgcacccaac agccccatgg ctatgcttac 721 gcttaactcc aactgtgaaa aagagggatt ttataagttt gaagagcaaa acagggcaga 781 gagcgagtgc ccaggcatga acacacattc acgagcgtcc tgtatgcaga tggatgatgt 841 aatcgatgac atcattagcc tagaatcaag ttataatgag gaaatcttgg gcttgatgga 901 tcctgctttg caaatggcaa atacgttgcc tgtctcggga aacttgattg atctttatgg 961 aaaccaaggt ctgcccccac caggcctcac catcagcaac tcctgtccag ccaaccttcc 1021 caacataaaa agggagctca ca(SEQ ID NO:1)
保守區(qū)2:683bp
1021agtctga agcaagagca ctggccaaag agaggcagaa
1081 aaaggacaat cacaacctga ttgaacgaag aagaagattt aacataaatg accgcattaa 1141 agaactaggt actttgattc ccaagtcaaa tgatccagac atgcgctgga acaagggaac 1201 catcttaaaa gcatccgtgg actatatccg aaagttgcaa cgagaacagc aacgcgcaaa 1261 agaacttgaa aaccgacaga agaaactgga gcacgccaac cggcatttgt tgctcagaat 1321 acaggaactt gaaatgcagg ctcgagctca tggactttcc cttattccat ccacgggtct1381 ctgctctcca gatttggtga atcggatcat caagcaagaa cccgttcttg agaactgcag 1441 ccaagacctc cttcagcatc atgcagacct aacctgtaca acaactctcg atctcacgga 1501 tggcaccatc accttcaaca acaacctcgg aactgggact gaggccaacc aagcctatag 1561 tgtccccaca aaaatgggat ccaaactgga agacatcctg atggacgaca ccctttctcc 1621 cgtcggtgtc actgatccac tcctttcctc agtgtccccc ggagcttcca aaacaagcag 1681 ccggaggagc agtatgagca tggaagagac ggagcacact tgttag (SEQ ID NO: 2)
2.siRNA分子庫構(gòu)建:用百奧邁科生物技術(shù)有限公司的專利技術(shù)構(gòu)建siRNA分子庫(專利申請?zhí)枮?200710024217.6，專利名稱:PCR高通量構(gòu)建siRNA全位點分子庫制備方法)，構(gòu)建流程示意圖如圖2所示。成功構(gòu)建MITF保守區(qū)的siRNA分子庫，隨機(jī)挑取克隆進(jìn)行測序，其序列長度可控性分布在19-23 bp之間，顯示出位點及長度的多樣性。實施例2
siRNA表達(dá)框的制備與靶點篩選 1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器:PCR儀(ABI公司)；實時定量PCR儀(BiO-Rad公司)；瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(北京六一)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)等。1.2 材料和試劑:lkb plus DNA Ladder (Invitrogen 公司)；Pfu DNA 聚合酶(Biomics Biotech) ；Agarose (BBI公司)；dNTP (上海生工)；瓊脂糖凝膠純化試劑盒(Biomics Biotech), Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司),TurboCapture mRNA kit(QIAGEN 公司)，EzOmics One-Step qPCR kit(Biomics Biotech)等。其他生化試劑均購于上海生工，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司配置成工作溶液。1.3 PCR 引物(Biomics Biotech 合成)序列如下:
5’ U6 啟動子引物:5’ -AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3’ (SEQ ID NO: 11)；
3’ Hl 啟動子引物:5’ -TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3’ (SEQ ID NO: 12)；
MITF 基因正向引物:5’ -CATCACCTTCAACAACAAC-3’ (SEQ ID NO: 13)；
MITF 基因反向引物:5’ -ATGCTCATACTGCTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 14)；
GAPDH 基因正向引物:5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (SEQ ID NO: 15)；
GAPDH 基因反向引物:5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (SEQ ID NO: 16)。2.siRNA表達(dá)框的制備
2.1 PCR擴(kuò)增制備siRNA表達(dá)框“U6_siRNA轉(zhuǎn)錄模板-Hl，，:用MITF siRNA陽性克隆質(zhì)粒為模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通過PCR的方法擴(kuò)增制備(表達(dá)框示意圖如圖3所示)。各PCR 反應(yīng)體系為(50 μ I 反應(yīng)體系):0.5μ I 模板 DNA (10-50ng)，ly I 5’U6啟動子引物(10 μ M)，I μ I 3，Hl 啟動子引物(10 μ Μ)，I μ I dNTP (10mM),0.5μ I Pfu DNA聚合酶，用ddH20補(bǔ)足到50 μ 1，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性lmin，95°C變性15sec，58 °C退火30sec, 72°C延伸30seC，20個循環(huán)。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增得到的表達(dá)框，并用瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物條帶單一，片段大小為約為380 384bp，符合設(shè)計要求(瓊脂糖凝膠電泳檢測圖如圖4所示)。3.靶點篩選3.1細(xì)胞培養(yǎng):黑色素瘤細(xì)胞A375在含10% 83的01^11培養(yǎng)基中，371:、5% CO2培養(yǎng)
箱培養(yǎng)。3.2細(xì)胞 鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IX IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用無抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamin 2000的說明書操作，“U6-siRNA轉(zhuǎn)錄模板-H1”表達(dá)框DNA量按0.2 μ g/孔加入。3.3實時定量PCR檢測MITF基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,按80 μ I無RNase水/孔溶解RNA，取4 μ I RNA為模板進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測樣本中MITF基因的mRNA表達(dá)水平，同時擴(kuò)增看家基因GAPDH作為內(nèi)參對照。每個反應(yīng)做3個平行實驗。建立如下25μ I反應(yīng)體系:4μ I模板RNA，
12.5μ I 2 X Master Mix, I μ I 正向引物(6 μ Μ)，I μ I 反向引物(6 μ Μ)，0.5 μ I 50 X SYBRGreen I,用無RNase水補(bǔ)足體系至25 μ I。反應(yīng)條件:40°C反轉(zhuǎn)錄30min, 95°C預(yù)變性7min,95°C變性20sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，循環(huán)45次，并測定溶解曲線。3.4結(jié)果分析:用2_Λ 法分析實驗結(jié)果，并作出柱狀圖，如圖5所示，結(jié)果顯示MITF多個位點的siRNA均呈現(xiàn)較好的沉默效果，尤其是Μ001-24，相對于未轉(zhuǎn)染組其沉默效果達(dá)到81%。尤其須需要說明的是，Μ001-24正義鏈序列與MITF基因保守區(qū)的第1636-1658位(下劃線部分 tccactcctttcctcagtgtccc)相對應(yīng)。實施例3
化學(xué)合成siRNA驗證沉默效果 1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器:核酸合成儀(GE公司)、PCR儀(ABI公司);實時定量PCR儀(Bio-Rad公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)等。1.2 材料和試劑:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司)，DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)，TurboCapture mRNA kit (QIAGEN 公司)，EzOmics One-Step qPCR kit (BiomicsBiotech)等。其他生化試劑均購于上海生工，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司配置成工作溶液。1.3實時定量PCR引物(Biomics Biotech合成)序列如下:
MITF 基因正向引物:5’ - CATCACCTTCAACAACAAC-3’ (SEQ ID NO: 13)；
MITF 基因反向引物:5’ -ATGCTCATACTGCTCCTC-3’ (SEQ ID NO: 14)；
GAPDH 基因正向引物:5’ -GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’ (SEQ ID NO: 15)；
GAPDH 基因反向引物:5’ -GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ (SEQ ID NO: 16)。2.化學(xué)合成制備siRNA
利用百奧邁科生 物技術(shù)有限公司擁有的核酸合成儀(AKTA Oligo Pilot)分別合成M001-24的正義鏈(sense strand)和反義鏈(antisense strand)的RNA。并進(jìn)行純化，將正義鏈和對應(yīng)的反義鏈退火成siRNA雙鏈(duplex)，分裝10D/管，最后冷凍干燥，轉(zhuǎn)染前用無RNase水溶解至20 μ Μ。其中陰性對照組的siRNA序列為(5，-3’ ):
正義鏈:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT (SEQ ID NO: 17)，反義鏈:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT (SEQ ID NO: 18)。3.沉默效率驗證
3.1細(xì)胞培養(yǎng):黑色素瘤細(xì)胞A375在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3.2細(xì)胞 鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IX IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用無抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按照Lipofectamin 2000的說明書轉(zhuǎn)染，RNA按IOnM/孔加入。3.3實時定量PCR檢測MITF基因mRNA水平:用mRNA提取純化試劑盒TurboCapture mRNA kit提取純化細(xì)胞RNA,操作按試劑盒說明書進(jìn)行,按80 μ I無RNase水/孔溶解RNA，取4 μ I RNA為模板進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)。用基因特異性引物檢測樣本中MITF mRNA表達(dá)水平，同時擴(kuò)增看家基因GAPDH作為內(nèi)參對照。每個反應(yīng)做3個平行。建立如下25 μ I反應(yīng)體系:4 μ I模板RNA，12.5μ12XMaster Mix, I μ I 正向引物(6 μ M)，I μ I 反向引物(6 μ Μ)，0.5 μ I 50XSYBR GreenI，用無RNase水補(bǔ)足體系至25 μ I。反應(yīng)條件:40°C反轉(zhuǎn)錄30min, 95°C預(yù)變性7min, 95°C變性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循環(huán) 45 次。3.4結(jié)果分析:用法分析實驗結(jié)果，并作柱狀圖，如圖6所示，結(jié)果顯示靶向至MITF基因的M001-24沉默效果達(dá)到87%。實施例4 細(xì)胞毒性檢測
1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器:細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)等。1.2 材料和試劑:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司),DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，CCK8試劑盒(同仁化學(xué))等。其他生化試劑均購于上海生工，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司配置成工作溶液。2.細(xì)胞毒性檢測
2.1細(xì)胞培養(yǎng):黑色素瘤細(xì)胞A375在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按IX IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)的操作步驟進(jìn)行，實驗的不同RNA分子按濃度為10 nM/孔加入。2.3 CCK-8測定:在不同時間點測定。在細(xì)胞板每孔加入1/10培養(yǎng)基體積的CCK-8溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5 4 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度。2.4結(jié)果分析:根據(jù)所測得的A45tl值(( 值)，作生長曲線圖，如圖7所示，與正常組相比，M001-24對黑色素瘤細(xì)胞有一定的生長抑制用，但無明顯的毒性作用。實施例5 黑色素含量的測定
1.主要儀器、試劑和材料
1.1儀器:細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)；酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)等。1.2 材料和試劑:Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司),DMEM 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胰蛋白酶(Gibco公司)，CCK8試劑盒(同仁化學(xué))等。其他生化試劑均購于上海生工，由百奧邁科生物技術(shù)有限公司配置成工作溶液。2.細(xì)胞毒性檢測
2.1細(xì)胞培養(yǎng):黑色 素瘤細(xì)胞A375在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5 % C02培
養(yǎng)箱培養(yǎng)。2.2細(xì)胞鋪板并轉(zhuǎn)染:將細(xì)胞按1X IO5/孔接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在無抗含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染按Lipofectamin 2000(Invitrogen公司)的操作步驟進(jìn)行，實驗的不同RNA分子按濃度為10 nM/孔加入。2.3 黑色素含量測定:參照 Jones K 等人(Jones K et al.Pigment Cell Res2002;15:335-40)的方法，經(jīng)改進(jìn)后進(jìn)行黑色素含量測定。A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，用PBS洗滌兩次，用0.25%胰蛋白酶消化，并用完全培養(yǎng)基終止消化，1，OOOrpm離心5 min，棄上清液，每孔加I ml PBS重懸細(xì)胞,用血球計數(shù)板計數(shù),然后1，OOOrpm離心5min,棄上清液，細(xì)胞沉淀在超凈工作臺中干燥，每IO6個細(xì)胞溶于500 μ I的I N含1 % DMSO的NaOH溶液。經(jīng)80°C加熱1 h后冷卻。用酶標(biāo)儀在475 nm波長處測定吸光度。2.4結(jié)果分析:根據(jù)所測得的A475值(0D值)，作柱狀圖，如圖8所示，與正常組相比，M001-24處理組的細(xì)胞中黑色素含量下降了約43%，明顯抑制了黑色素的生成。
權(quán)利要求
1.種雙鏈SiRNA分子，其具有如下序列結(jié)構(gòu):正義鏈:5’ -GGGACACUGAGGAAAGGAGUGGANn-3’(SEQ ID NO: 3)反義鏈:5’ -UCCACUCCUUUCCUCAGUGUCCCNn-3’(SEQ ID NO: 4)，其中，N為脫氧胸腺嘧啶核苷dT ;n為O或2。
2.權(quán)利要求1所述的siRNA分子在美白祛斑化妝品中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所 述的siRNA分子在制備治療高黑色素相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種靶向MITF基因的雙鏈siRNA分子及其在美白祛斑化妝品或制備治療黑色素基因相關(guān)疾病藥物中的應(yīng)用。該siRNA分子正義鏈為SEQIDNO:3，反義鏈為SEQIDNO:4，其中，反義鏈可特異性地與MITF基因的mRNA結(jié)合，降解mRNA，從而干擾轉(zhuǎn)錄后翻譯過程，達(dá)到降低黑色素的目的。
文檔編號A61P17/00GK103088020SQ20111033147
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者朱遠(yuǎn)源, 李鐵軍 申請人:江蘇吉康生物技術(shù)有限公司