專利名稱：一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠及其制備方法
一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用于神經(jīng)損傷修復(fù)中神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，具體涉及一種應(yīng)用于小間室神經(jīng)吻合法的水凝膠及其制備方法。背景技術(shù)：
神經(jīng)吻合方法在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中對(duì)術(shù)后肢體功能的恢復(fù)程度有著重要影響。 周圍神經(jīng)的修復(fù)關(guān)鍵是修復(fù)神經(jīng)束本來(lái)的連續(xù)性，傳統(tǒng)的神經(jīng)吻合方法是端端神經(jīng)外膜吻合法。隨著技術(shù)的進(jìn)步，該方法已經(jīng)達(dá)到了較高的水平，然而其功能恢復(fù)卻依舊不甚理想。 究其原因，臨床發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的神經(jīng)吻合法難以準(zhǔn)確對(duì)接功能相同的神經(jīng)束，且在各束斷端之間會(huì)發(fā)生扭曲、交錯(cuò)，甚至斷端逃逸，或形成神經(jīng)瘤等，直接影響了神經(jīng)功能的恢復(fù)；其次， 由于神經(jīng)吻合口及周圍的瘢痕組織增生較神經(jīng)束明顯快速，可侵入吻合口機(jī)械地阻礙再生神經(jīng)軸突長(zhǎng)入吻合口等。
神經(jīng)受損后要成功再生，除了防止神經(jīng)胞體不可逆變性以外，最主要的是引導(dǎo)再生軸突延長(zhǎng)通過(guò)損傷區(qū)，并使軸突生長(zhǎng)錐尋找、識(shí)別到靶器官，以建立新的軸突。傳統(tǒng)的神經(jīng)吻合方法難以保證上述因素，于是各種新方法應(yīng)運(yùn)而生，其中小間室神經(jīng)吻合法是目前研究的熱點(diǎn)。
小間室神經(jīng)吻合法要求為損傷神經(jīng)提供有利的微環(huán)境一“神經(jīng)再生室”，神經(jīng)再生室作為一個(gè)相對(duì)密閉的空間，是一個(gè)符合神經(jīng)生長(zhǎng)的微環(huán)境。在神經(jīng)遠(yuǎn)端分泌活性物質(zhì)的作用下，近端再生的軸突在神經(jīng)再生室內(nèi)有選擇的被引導(dǎo)進(jìn)入遠(yuǎn)端功能相同的神經(jīng)內(nèi)膜管內(nèi)，避免神經(jīng)生長(zhǎng)錯(cuò)誤，即再生的運(yùn)動(dòng)突長(zhǎng)入遠(yuǎn)端的感覺(jué)神經(jīng)內(nèi)膜管，能防止周圍組織成纖維細(xì)胞進(jìn)入神經(jīng)斷端阻礙神經(jīng)再生，有助于提高軸突再生的數(shù)量和質(zhì)量，使再生的軸突長(zhǎng)入靶器官，形成有效連接，恢復(fù)肢體功能。
理想的神經(jīng)再生室包括良好的血液供應(yīng)和能充分發(fā)揮神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性和趨向性，以促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)。但是目前 應(yīng)用的神經(jīng)再生室方法包括硅膠再生室、幾丁質(zhì)再生室、 外膜袖套式再生室和小間隙靜脈橋接再生室等，還存在各種問(wèn)題或不足，例如硅膠再生室不可降解，需第二次手術(shù)取出硅膠管；幾丁質(zhì)再生室因幾丁質(zhì)體內(nèi)降解速度慢而限制了它的廣泛應(yīng)用；外膜袖套式再生室吻合操作要求嚴(yán)格，操作比較復(fù)雜，術(shù)后外膜套容易瘢痕化；小間隙靜脈橋接再生室因小間隙處較軟，內(nèi)部缺少支撐，容易受壓變扁，此外神經(jīng)盲目生長(zhǎng)，短時(shí)間內(nèi)神經(jīng)纖維近遠(yuǎn)端之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系難以連接。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有神經(jīng)吻合術(shù)中小間室神經(jīng)吻合法的不足之處，提供一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠及其制備方法，利用該水凝膠相變特點(diǎn)聯(lián)合黏合法應(yīng)用，提高神經(jīng)吻合質(zhì)量及速度，實(shí)現(xiàn)安全快捷的神經(jīng)吻合。
經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)明人制備了一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，解決了現(xiàn)有神經(jīng)吻合術(shù)中小間室神經(jīng)吻合法的不足之處，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下。
一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，該水凝膠中泊洛沙姆或其衍生物濃度為10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分的濃度為O. 1% (ff/V)-5% (W/V)。
上述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即α -氫-ω羥聚(氧乙烯)a_聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)。嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO (CH2CH2O) a (OCHCH3CH2)b (CH2CH2O)。，在共聚物中a和c為2 150，b為15 67。
上述的生物可降解大分子包括蛋白、多糖、可溶性淀粉及其衍生物。
上述的營(yíng)養(yǎng)成分是指醫(yī)學(xué)公知的具有營(yíng)養(yǎng)或刺激神經(jīng)生長(zhǎng)作用的成分，包括激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、刺激因子、趨化因子、白細(xì)胞介素、維生素、氨基酸、干擾素、單糖、 雙糖、低聚糖、有機(jī)弱酸。
上述的有機(jī)弱酸包括檸檬酸、酒石酸、富馬酸、硼酸、醋酸。
上述的水凝膠中泊洛沙姆濃度為15% (ff/V)-25% (W/V)，生物可降解大分子和/ 或營(yíng)養(yǎng)成分濃度為0.25% (ff/V)-l% (W/V)。
上述的水凝膠在37°C以下呈流動(dòng)的高分子膠液狀，在37°C _45°C之間凝固成固態(tài)凝膠。
一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠的制備方法，在無(wú)菌操作環(huán)境下，將泊洛沙姆或其衍生物分散于注射用水中，溶解，加入生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分，振搖至完全溶解，形成水凝膠，水凝膠中泊洛沙姆或其衍生物濃度為10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分的濃度為O. 1% (ff/V)-5% (W/V)。
上述制備的水凝膠可以進(jìn)一步冷凍干燥形成凍干粉，密封于西林瓶中保存，臨用前注入注射用水，輕微振搖恢復(fù)形成水凝膠。
本發(fā)明解決了現(xiàn)有神經(jīng)吻合術(shù)中小間室神經(jīng)吻合法的不足，具有以下優(yōu)點(diǎn)(I) 本發(fā)明的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用，避免現(xiàn)有報(bào)道的小間室神經(jīng)吻合法手術(shù)復(fù)雜、材料不可降解、小間隙處內(nèi)部缺少支撐和容易受壓變型等不足。(2)本發(fā)明的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用，增加了吻合口的密閉性能，促進(jìn)神經(jīng)定向生長(zhǎng)，降低了神經(jīng)功能束的錯(cuò)對(duì)、卷曲等問(wèn)題。(3)應(yīng)用本發(fā)明的水凝膠，為神經(jīng)再生創(chuàng)造了一個(gè)良好營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，保證神經(jīng)的快速生長(zhǎng)。(4)應(yīng)用本發(fā)明的水凝膠，不會(huì)限制再生室腔的橫面積，避免瘢痕形成。
具體實(shí)施方式
以下從具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例一、制備含有泊洛沙姆338、羥乙基淀粉和重組人生長(zhǎng)激素的水凝膠
本實(shí)施例選用泊洛沙姆338、生物可降解大分子羥乙基淀粉和營(yíng)養(yǎng)成分重組人生長(zhǎng)激素為原料，制備水凝膠。
水凝膠的制備稱取3. Og泊洛沙姆338、0. 09g羥乙基淀粉130/0. 4和O. Olg重組人生長(zhǎng)激素，加入IOml注射用水完全溶解形成水凝膠，冷凍干燥成凍干粉，灌裝于無(wú)菌西林瓶中，密封。臨用時(shí)加入IOml注射用水，輕微振搖，形成水凝膠。
實(shí)施例二、制備含有泊洛沙姆188和富馬酸的水凝膠
本實(shí)施例選用泊洛沙姆188和營(yíng)養(yǎng)成分富馬酸為原料，制備水凝膠。
水凝膠的制備稱取2. 5g泊洛沙姆188和O. 5g富馬酸，20°C水浴中振搖或攪拌至完全溶解形成水凝膠，灌裝于無(wú)菌注射器中，密封。
實(shí)施例三、制備含有泊洛沙姆407、酪氨酸和人血白蛋白的水凝膠
本實(shí)施例選用泊洛沙姆407、生物可降解大分子人血白蛋白和營(yíng)養(yǎng)成分酪氨酸為原料，制備水凝膠。
水凝膠的制備稱取2g泊洛沙姆407、0. 2g人血白蛋白和O. 05g酪氨酸分散于 IOml注射用水中，攪拌至完全溶解，形成水凝膠，灌裝于無(wú)菌注射器中，密封。
實(shí)施例四、制備含有泊洛沙姆407衍生物和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的水凝膠
泊洛沙姆有多種衍生物結(jié)構(gòu)，本實(shí)施例選用泊洛沙姆407的肝素化衍生物和營(yíng)養(yǎng)成分神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子為原料，制備水凝膠。
泊洛沙姆407肝素化衍生物的合成稱取泊洛沙姆407 (相對(duì)分子量M = 12000， 其中a = c = 101,b = 56) 12g,于一圓底燒瓶中，加入2mmol的丁二酐、2mmol的4- 二甲基氨基吡啶及O. 55ml三乙胺，并溶解于200ml 二氧六環(huán)中，攪拌反應(yīng)過(guò)夜，得末端為羧基的泊洛沙姆，以其為反應(yīng)物，利用1-乙基_3，3-二甲基氨丙基碳化二亞胺(EDC)/N-羥基于二酰亞胺(NHS)方法，加入IOg的低分子肝素鈉，攪拌反應(yīng)24h。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析袋透析3天，所得產(chǎn)物通過(guò)冷凍干燥得到固體粉末，得到泊洛沙姆407肝素化衍生物。
水凝膠的制備稱取Ig上述合成的泊洛沙姆407肝素化衍生物，分散于IOml注射用水中，加入O. Olg神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，完全溶解，溶液灌裝于一次性無(wú)菌注射器中，密封。
實(shí)施例五、膠凝溫度測(cè)定本實(shí)施例以實(shí)施例1-4得到的水凝膠為對(duì)象，測(cè)定膠凝溫度。
實(shí)驗(yàn)方法實(shí)施例1-4得到水凝膠各取5ml，在4°C下放置過(guò)夜，然后逐步升溫，精確測(cè)定水凝膠隨溫度變化黏度值，每個(gè)樣品測(cè)定三次，取平均值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)施例1-4得到的水凝膠的膠凝溫度分別為37. 80C >37. 6°C>38. (TC、 38. 2°C。因此，實(shí)施例1-4得到的水凝膠具備在37 °C以下呈流動(dòng)的液體狀態(tài)狀，在 37 0C -45 V之間凝固成固態(tài)凝膠的特性。
實(shí)施例六、黏合法進(jìn)行動(dòng)物神經(jīng)吻合實(shí)驗(yàn)
本實(shí)施例考察本發(fā)明的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑在神經(jīng)吻合術(shù)中的應(yīng)用性能。
實(shí)驗(yàn)方法健康雄性Wistar大鼠20只，體重250g 300g,隨機(jī)分為兩組，即粘合組(本發(fā)明的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑的實(shí)驗(yàn)組)和縫合組(應(yīng)用縫合法的對(duì)照組)，每組 10只，采用大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)為修復(fù)模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。大鼠腹腔注射I %戊巴比妥鈉(40mg/ kg)進(jìn)行麻醉，取左側(cè)股后部縱行切口，切開(kāi)皮膚，分離肌肉，由股后外側(cè)肌間隙顯露左側(cè)坐骨神經(jīng)，在坐骨神經(jīng)距梨狀肌出口1. 5cm處用雙面刀片切斷坐骨神經(jīng)，粘合組切除小部分神經(jīng)使神經(jīng)斷端外膜留有2 3_間隙，將實(shí)施例四制備的水凝膠灌注到橫斷神經(jīng)的兩斷端，應(yīng)用精確溫度定點(diǎn)加熱器將兩斷端加熱至40-41 °C，橫斷神經(jīng)斷端內(nèi)的水凝膠形成固體，將兩斷端在手術(shù)顯微鏡下以準(zhǔn)確對(duì)合，在連接處涂醫(yī)用黏合劑纖維蛋白膠，30秒左右纖維蛋白膠凝固，降低吻合部的溫度至37°C，完成神經(jīng)吻合術(shù)，術(shù)后肢體不固定?？p合組在手術(shù)顯微鏡下以神經(jīng)表面血管為解剖標(biāo)志進(jìn)行神經(jīng)斷端對(duì)位，采用11/0尼龍線外膜縫合4 針，術(shù)后肢體不固定。
再生神經(jīng)性能觀察術(shù)后8周各組取8只大鼠進(jìn)行電生理檢測(cè)結(jié)束后，在神經(jīng)吻合處取材，用3/0絲線縛住神經(jīng)兩端，拉直、固定于小木板上，置于10 %中性福爾馬林溶液內(nèi)固定，用石蠟包埋，吻合口近、遠(yuǎn)段各Icm處做橫切片，中段做縱切片，經(jīng)HE和Luxolfastblue染色進(jìn)行組織學(xué)觀察和圖像分析。其余每組2只大鼠迅速取吻合口遠(yuǎn)側(cè)坐骨神經(jīng)，立即投入-4°C 2. 5%的戊二醛中固定2小時(shí)，然后從其中切取Imm3小塊，用1%鋨酸后固定，逐級(jí)酒精脫水，Epon包埋，超薄切片經(jīng)鋁鈾雙染，透射電鏡觀察再生神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。 此外，術(shù)后8周各組取8只大鼠再次腹腔麻醉，顯露雙側(cè)坐骨神經(jīng)，用智能型生物信號(hào)顯示與處理系統(tǒng)進(jìn)行電生理檢測(cè)，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物兩側(cè)坐骨神經(jīng)的潛伏期及誘發(fā)電位的波幅，計(jì)算實(shí)驗(yàn)側(cè)坐骨神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)潛伏期延遲比。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果再生神經(jīng)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑的粘合組軸突扭曲較輕，瘢痕形成較少，而對(duì)照縫合組軸突扭曲較明顯，呈盤(pán)旋狀，瘢痕形成較多。透射電鏡觀察表明，應(yīng)用水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑的粘合組再生神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維排列整齊，髓鞘結(jié)構(gòu)基本正常，軸突內(nèi)神經(jīng)微絲和微管及線粒體結(jié)構(gòu)重新出現(xiàn)，對(duì)照縫合組再生神經(jīng)中有髓神經(jīng)纖維較疏散，髓鞘厚薄不一致，軸突內(nèi)神經(jīng)微絲、微管結(jié)構(gòu)模糊，可見(jiàn)空泡樣變性。 坐骨神經(jīng)電生理檢查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照縫合組應(yīng)用水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑的粘合組神經(jīng)傳導(dǎo)速度快，潛伏時(shí)值小，運(yùn)動(dòng)神經(jīng)潛伏 期延遲有較明顯的改善。
在上述實(shí)施例中，僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示范性描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本專利申請(qǐng)后可以在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于該水凝膠中泊洛沙姆或其衍生物濃度為10% (ff/V)-30% (W/V)，生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分的濃度為0.1 % (ff/V)-5%(W/V)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的泊洛沙姆為聚氧乙烯聚氧丙烯醚，即a-氫羥聚(氧乙烯)a-聚(氧丙烯)b_聚(氧乙烯)c嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為HO (CH2CH2O)a(0CHCH3CH2)b(CH2CH20)。，在共聚物中a和c為2 150，b為15 67。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的生物可降解大分子包括蛋白、多糖、可溶性淀粉及其衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的營(yíng)養(yǎng)成分是指醫(yī)學(xué)公知的具有營(yíng)養(yǎng)或刺激神經(jīng)生長(zhǎng)作用的成分，包括激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、刺激因子、趨化因子、白細(xì)胞介素、維生素、氨基酸、干擾素、單糖、雙糖、低聚糖、有機(jī)弱酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的有機(jī)弱酸包括檸檬酸、酒石酸、富馬酸、硼酸、醋酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的水凝膠中泊洛沙姆濃度為15% (ff/V)-25% (W/V)，生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分濃度為0.25% (ff/V)-l% (W/V)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，其特征在于所述的水凝膠在37°C以下呈流動(dòng)的高分子膠液狀，在37°C _45°C之間凝固成固態(tài)凝膠。
8.一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠的制備方法，其特征在于在無(wú)菌操作環(huán)境下，將泊洛沙姆或其衍生物分散于注射用水中，溶解，加入生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分，振搖至完全溶解，形成水凝膠，水凝膠中泊洛沙姆或其衍生物濃度為10% (ff/V)-30% (ff/V),生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分的濃度為0. 1% (ff/V)-5% (ff/V)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠的制備方法，其特征在于所制備的水凝膠可以進(jìn)一步冷凍干燥形成凍干粉，密封于西林瓶中保存，臨用前注入注射用水，輕微振搖恢復(fù)形成水凝膠。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種應(yīng)用于神經(jīng)吻合術(shù)的水凝膠，該水凝膠中泊洛沙姆或其衍生物濃度為10％(W/V)-30％(W/V)，生物可降解大分子和/或營(yíng)養(yǎng)成分的濃度為0.1％(W/V)-5％(W/V)，本發(fā)明的水凝膠聯(lián)合醫(yī)用黏合劑應(yīng)用于小間室神經(jīng)吻合法，增加吻合口的密閉性能，促進(jìn)神經(jīng)定向生長(zhǎng)，降低了神經(jīng)功能束的錯(cuò)對(duì)、卷曲等問(wèn)題。
文檔編號(hào)A61L24/04GK102989034SQ20111028073
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月10日
發(fā)明者魯翠濤, 趙應(yīng)征, 彭磊, 張露, 孫昌正, 呂海峰, 厲星, 戴單單, 陳麗娟, 林敏 , 萬(wàn)常偉 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院