專利名稱：內(nèi)源性的非編碼小RNAs及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程領(lǐng)域，涉及一種內(nèi)源性的非編碼小RNAs及其應(yīng)用，具體涉及一種微小RNA(micix)RNA，miRNA)及其前體序列和它們在制備預(yù)防和/或治療惡性腫瘤疾病的試劑盒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
當(dāng)前惡性腫瘤是全世界死亡率較高的疾病，且惡性腫瘤的發(fā)病 率逐年增加，嚴(yán)重威脅著人類的健康。第三次全國死因調(diào)查結(jié)果表明，我國城鄉(xiāng)居民惡性腫瘤死亡率屬于世界較高水平，而且呈持續(xù)的增長趨勢，惡性腫瘤已成為我國城市居民首位死因(25%)。近年來有關(guān)腫瘤發(fā)病機理及腫瘤防治的研究取得很大進(jìn)展，但在全球范圍內(nèi)，惡性腫瘤的防治仍是當(dāng)今生命科學(xué)研究領(lǐng)域的一個難點。細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。許多參與凋亡調(diào)控的基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，這些基因可以作為腫瘤診斷及治療的作用靶點。因此，尋找腫瘤細(xì)胞中新的參與凋亡的蛋白因子、miRNA等及闡明其在腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用機理具有極其重要的應(yīng)用價值。microRNA(miRNA)是一類長度在22nt左右的內(nèi)源非編碼小RNA，廣泛存在于動物、植物、病毒等多種有機體中。它主要通過與靶基因的3' UTR的完全或不完全配對，降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調(diào)控機體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動，預(yù)測超過1/3的人類基因都是保守的miRNA靶基因。實驗證據(jù)表明，miRNA可通過調(diào)控其靶標(biāo)基因參與的信號通路，影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的功能。miRNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤發(fā)病機制的研究提供了新的思路，為腫瘤診斷和治療提供了新的策略。隨著科技的發(fā)展和腫瘤細(xì)胞信號傳導(dǎo)途經(jīng)研究的不斷深入，以生物靶分子為基礎(chǔ)的腫瘤生物治療成為研究抗腫瘤藥物的熱點。腫瘤的生物療法以分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分析免疫學(xué)為基礎(chǔ)，與手術(shù)放療化療三大常規(guī)療法作用相互補充，大幅提高腫瘤的治療療效。將生物技術(shù)與放療化療結(jié)合起來，引入促凋亡的分子可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性，增強腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的敏感性，從而避免了傳統(tǒng)的放療化療方法引起的耐藥性和毒副作用的缺點，達(dá)到治療腫瘤的效果。本領(lǐng)域迫切需要了解促腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子，將其作為藥物治療的靶分子應(yīng)用于臨床的治療中，因此尋找與促腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)的因子與放療化療結(jié)合治療腫瘤疾病，具有廣闊的前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的具有促腫瘤細(xì)胞凋亡功能的微小RNA即miR-644，該miRNA為生物體內(nèi)一段內(nèi)源的miRNA，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的功能，在腫瘤細(xì)胞模型和裸鼠荷瘤模型的實驗中均增強了阿霉素對腫瘤細(xì)胞的治療效果。針對上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一方面，本發(fā)明提供一種微小RNA在制備用于預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估惡性腫瘤的藥物或試劑盒中的用途，其中所述微小RNA為miR-644及其前體序列。優(yōu)選地，所述miRNA-644的序列為包含下述SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'。優(yōu)選地，所述miRNA-644前體的序列為包含下述SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體5' -UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGAA
腳UGCUC腳A⑶UUUCUUAUA⑶⑶GGCUUUCUUAGAGCAAAGAUGGUUCCCUA-3'。優(yōu)選地，所述miRNA-644的序列進(jìn)行了硫代修飾、甲氧修飾或膽固醇修飾。優(yōu)選地，所述miRNA-644或其前體的序列通過轉(zhuǎn)入已知表達(dá)載體構(gòu)建含有miRNA-644或其前體序列的表達(dá)載體，并將構(gòu)建的含有miRNA-644或其前體序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入病毒表達(dá)獲得。優(yōu)選地，所述已知表達(dá)載體為pSilencer Adeno CMV1. O穿梭載體(pSilencerAdeno CMVl.Oshuttle vector),所述病毒為腺病毒。另一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防和/或治療惡性腫瘤的藥物組合物，其包含治療有效量的上述miR-644及其前體序列和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :1序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5' -A⑶⑶GGCUUUCUUAGAGC-3'。優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的載體或輔料選自質(zhì)粒表達(dá)載體、病毒、殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等。優(yōu)選地，所述藥物組合物的給藥方式為口服給藥或注射給藥；更優(yōu)選地，所述注射給藥方式選自靜脈注射、肌肉注射、直接腫瘤瘤內(nèi)注射等。又一方面，本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)后評估惡性腫瘤的試劑盒，所述試劑盒包含用于特異性檢測上述miR-644的探針或引物。優(yōu)選地，所述試劑盒中包含的探針或引物具有下述SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列5' -GCTCTAAGAAAGCCACACT-3'。綜上所述，本發(fā)明人通過大量的實驗證明，miRNA-644 (5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3')通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，在腫瘤預(yù)防、治療及預(yù)后評估中具有重要的應(yīng)用價值。經(jīng)化療藥物阿霉素處理，腫瘤細(xì)胞中miRNA-644表達(dá)顯著上調(diào)，miRNA-644的上調(diào)可能參與了腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-644可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。將miRNA-644與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合形成藥物，導(dǎo)入腫瘤部位或體內(nèi)，對惡性腫瘤患者將具有預(yù)防及治療作用。發(fā)明人通過構(gòu)建能夠過表達(dá)miRNA-644的腺病毒感染胃腺癌SGC-7901細(xì)胞系及宮頸癌Hela細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)miRNA-644可以誘導(dǎo)兩種腫瘤細(xì)胞系凋亡，在細(xì)胞水平證明了 miRNA-644通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療腫瘤的潛在作用。通過miRNA-644反義寡核苷酸抑制miRNA-644的表達(dá)，可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡。裸鼠皮下接種腫瘤細(xì)胞，接種部位同時注射miRNA-644模擬物，可顯著抑制裸鼠皮下腫瘤生長。在整體動物水平也證明了 miRNA-644的潛在預(yù)防、治療作用。腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-644，使用較低劑量的阿霉素即可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，提高了腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，在腫瘤治療中可以克服化療藥物的毒副作用及耐藥性的形成。因此，本發(fā)明提供了將miRNA-644及其前體與適當(dāng)載體或輔料如真核基因表達(dá)載體、腺病毒、殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體、納米顆粒等包裝形成藥物，通過口服、靜脈注射、肌肉注射、或直接腫瘤部位注射的方式，用于預(yù)防和/或治療惡性腫瘤。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為阿霉素處理誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過程中miRNA-644表達(dá)水平的變化的實驗結(jié)果示意圖；其中圖IA為SGC-7901腫瘤細(xì)胞中miRNA-644表達(dá)水平實驗結(jié)果示意圖；圖IB為Hela腫瘤細(xì)胞中miRNA-644表達(dá)水平實驗結(jié)果示意圖；圖2為miRNA-644過表達(dá)腺病毒構(gòu)建載體后轉(zhuǎn)入病毒后miRNA-644表達(dá)的實驗結(jié)果示意圖；其中圖2A為含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMVI. O穿梭載體的示意圖；圖2B為PCR驗證獲得含有miRNA-644的pSilencer Adeno CMV1. O穿梭載體的陽性克隆的電泳圖，圖中1為DNA標(biāo)記(DNA Marker)，2為擴增獲得6 1Obp的miRNA-644片段；圖2(為miRNA-644腺病毒感染SGC-7901腫瘤細(xì)胞miRNA-644表達(dá)水平檢測實驗結(jié)果示意圖；圖2D為miRNA-644腺病毒感染Hela腫瘤細(xì)胞miRNA-644表達(dá)水平檢測實驗結(jié)果示意圖；圖3為通過腺病毒過表達(dá)miRNA-644可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果示意圖；其中圖3A為SGC-7901腫瘤細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果示意圖；圖3B為Hela腫瘤細(xì)胞中凋亡的實驗結(jié)果不意圖；圖4為通過轉(zhuǎn)染人工合成的miRNA-644模擬物過表達(dá)miRNA-644可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果示意圖；其中圖4A、4B為SGC-7901腫瘤細(xì)胞及Hela腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-644模擬物24小時后，實時熒光定量PCR方法檢測miR-644表達(dá)水平的結(jié)果示意圖；圖4C、4D為SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-644模擬物后腫瘤細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果示意圖；圖5為裸鼠皮下接種腫瘤部位注射miRNA模擬物腫塊形成的生長曲線；圖6為通過miRNA-644反義寡核苷酸抑制腫瘤細(xì)胞中miRNA-644表達(dá)，腫瘤細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的凋亡敏感性增強的實驗結(jié)果示意圖，其中圖6A為Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-644反義寡核苷酸后，miRNA-644的表達(dá)情況的實驗結(jié)果示意圖；圖6B為抑制內(nèi)源性miRNA-644后，低劑量阿霉素作用下Hela細(xì)胞的凋亡情況的實驗結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1阿霉素處理誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡過稈中miRNA-644表汰水平的變化該實驗分別用2uM阿霉素處理SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞(均購自于中科院上海細(xì)胞庫)3h，6h，12h，24h后收集細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，采用實時熒光定量PCR的方法對miR-644的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，觀察在阿霉素處理腫瘤細(xì)胞的過程中miR-644的表達(dá)變化。如圖I所示，隨著阿霉素處理SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞時間的增加，miR-644的表達(dá)水平在兩種腫瘤細(xì)胞中均呈現(xiàn)明顯上升的趨勢。實施例2miRNA_644腺病毒的構(gòu)律米用Ambion公司的pSilencer Adeno I. O-CMV載體系統(tǒng)構(gòu)建miRNA-644過表達(dá)載體或腺病毒。按照公司說明書構(gòu)建相應(yīng)載體及腺病毒。以大鼠基因組為模板，PCR擴增miRNA-644及其上下游兩端各將近300個bp的序列，擴增得到片斷約600bp(SEQ ID NO :2，如下所示)，擴增引物如下F5/ -CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTG-3' (SEQ ID NO :7);R5/ -GGTAATGATGTGGTGTAAGTCCTG-3' (SEQ ID NO :8)?！U增片段序列如下CTAGTGTTTCCTATCCCTGTTGTGGAGTGTTTTATCATGAAAGTGTATTAAATTTTGTAAAATCCTTTTTTGGTATCAATTGAGATGATCATGTGATTTTTTTCCCCCCCTCATTCTGTTAATGTGGTATATTATGTTGATTTTTCATAGGTTGAACCTTTTTTGCATTCCAGGAATAAATCCTACTTAGTCAAAAGGATTAAAGTGTGCTTTTAATATGCTGCTGAGATTTTTTTGCTGATTTTTTTTTAGTATTTTTCCATCAGTGTTCATAAGGAATGTTGCTCTGTAGTTTTCTTATAGTGTGGCTTTCTTAGAGCAAAGATGGTTCCCTATTACTTTCTAATTTTATACTTCTACACATTAACAACTTTTATATTTAAAGCAGAAACTGGAAA
ATCAGGCCAATTTGGTATTAATGAAATTACAGAGGTAATTTAGATATGGGAATAAATTACCGATAATATTATTCTATCATTCATTTTAGTTACAATAAGTTTGGGTGCATATAATAGAAAACACTAAAATAATAGTGGTTTATGTAAGATAGAAGTGTATTTGTCCCCATTATTTAAAAATAGTCCAGCAGGACTTACACCACATCATTACC擴增獲得的片斷克隆入T載體，亞克隆入pSilencer Adeno CMV1.0穿梭載體(pSilencer Adeno CMVl.Oshuttle vector),獲得含 miRNA-644 的載體(如圖 2A)。通過PCR及測序驗證獲得含miRNA-644載體的克隆，PCR結(jié)果見圖2B。Pac I酶切線性化該載體及腺病毒骨架(Adenovirus LacZ Backbone)，共轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞(購自于美國ATCC)，包裝腺病毒，擴增收集病毒，測定病毒滴度。實時定量PCR(Real-time PCR)鑒定miRNA-644的表達(dá)。miRNA-644 突變體病毒構(gòu)建將 miR_644pSilencer Adeno CMV1. O 穿梭載體通過基因定點突變的方法突變miRNA-644序列的四個堿基(通過QuikChange定點突變試劑盒(Stratagene公司)進(jìn)行基因定點突變，具體方法參照試劑盒說明操作)，突變引物如下，突變的喊基劃橫線標(biāo)出5' ~GCTCTGTAGTTTTCTTATAGTTGACCTTTCTTAGAGCAAAGATGG~3/ (SEQ ID NO 5)5' ~CCATCTTTGCTCTAAGAAAGGTCAACTATAAGAAAACTACAGAGC~3/ (SEQ ID NO :6)。得到突變后的miR_644pSilencer Adeno CMVL O穿梭載體按照上述相同的方法構(gòu)建miRNA-644突變體腺病毒。病毒均溶于無血清培養(yǎng)基，-80°C儲存?zhèn)溆?。將miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞，24小時后，收集細(xì)胞，提取RNA，Real-time PCR檢測miRNA-644表達(dá)水平，結(jié)果顯示感染miRNA-644腺病毒的細(xì)胞miRNA-644表達(dá)量明顯升高，而感染miRNA-644突變體病毒的細(xì)胞miRNA-644表達(dá)沒有變化，(如圖2C，2D)。實施例3腺病毒i寸表汰miRNA-644可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)朐凋亡將miRNA-644腺病毒感染SGC-7901及HeIa腫瘤細(xì)胞，腺病毒感染12、24、36、48小時后，通過原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡情況。如圖3所示，過表達(dá)miRNA-644后SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞隨著時間的延長均有細(xì)胞凋亡發(fā)生。實施例4miRNA-644樽擬物i寸表汰miRNA-644可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)朐凋亡·將SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染人工合成的miRNA-644模擬物(模擬物于上海吉瑪公司合成，為2'-甲氧修飾的寡核苷酸序列，其序列為SEQ ID N0:1)，轉(zhuǎn)染后12、24、48小時,通過原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡情況。如圖4所示，過表達(dá)miRNA-644后SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞隨著時間的延長均有細(xì)胞凋亡發(fā)生。實施例5裸鼠皮下接種腫瘤部位注射miRNA模擬物腫塊形成生長曲線培養(yǎng)Hela腫瘤細(xì)胞，胰酶消化收集細(xì)胞，接種I X IO7細(xì)胞于無胸腺的BALB/c裸鼠(購自于北京維通利華動物動物實驗有限公司)背部皮下。接種細(xì)胞3天后，于接種部位注射miRNA-644模擬物(與實施例4中的miRNA-644模擬物同)(模擬物于上海吉瑪公司合成)，注射miRNA模擬物陰性對照作為對照組。每組6只BALB/c裸鼠進(jìn)行實驗，接種腫瘤細(xì)胞后每隔3天測量瘤塊的大小，連續(xù)觀察4周，按公式長X寬2/2計算腫塊體積，繪制腫瘤生長曲線，觀察miR-644在裸鼠水平上對腫瘤形成的影響。如圖5所示，注射miRNA-644的裸鼠腫瘤生長較對照組慢，成瘤體積較小。實施例6腫瘤細(xì)胞中過表汰miRNA-644,腫瘤細(xì)胞對阿霉素誘導(dǎo)的凋亡敏感件增強SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞感染miRNA-644腺病毒及其突變體病毒，感染24小時后，使用低劑量的阿霉素(O. 2μΜ)處理細(xì)胞，24小時后通過原位末端缺口標(biāo)記法(TUNEL)檢測細(xì)胞凋亡情況。如圖6所示，使用低劑量的阿霉素(O. 2 μ Μ)處理SGC-7901及Hela腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞凋亡不太明顯。過表達(dá)miRNA-644后，則用此劑量的阿霉素可以明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生，也就是過表達(dá)miRNA-644可以增加阿霉素誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡的敏感性。
權(quán)利要求
1.一種人源rniRNA-644及其前體在制備用于診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估惡性腫瘤的藥物組合物或試劑盒中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644為包含下述SEQID NO I所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644前體的序列為包含下述SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體5' -UUUUUUUUUAGUAUUUUUCCAUCAGUGUUCAUAAGGA AU⑶UGCUC腳 A⑶UUUCUUAUA⑶⑶GGCUUUCUUAGAGCAA AGAUG⑶UCCCUA-3,。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3任一項所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644的序列進(jìn)行了硫代修飾、甲氧修飾或膽固醇修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4任一項所述的用途，其特征在于，所述miRNA-644或其前體通過轉(zhuǎn)入已知表達(dá)載體構(gòu)建含有miRNA-644或其前體的表達(dá)載體，并將構(gòu)建的含有miRNA-644或其前體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入病毒表達(dá)獲得。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途,其特征在于,所述已知表達(dá)載體為pSilencerAdenoCMV1. O穿梭載體，所述病毒為腺病毒。
7.一種用于預(yù)防和/或治療惡性腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的人源miRNA-644及其前體和藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料，其中所述微小RNA為包含以下SEQ ID NO :I序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3'； 優(yōu)選地，所述藥學(xué)上可接受的病毒、載體或輔料均選自腺病毒、慢病毒、質(zhì)粒表達(dá)載體、殼聚糖、膽固醇、脂質(zhì)體和納米顆粒。
8.一種用于診斷和/或預(yù)后評估心臟疾病的試劑盒，所述試劑盒包含用于特異性檢測人源miRNA-644的探針或引物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包含的探針或引物具有下述SEQ ID NO 4所示的核苷酸序列.5' -GCTCTAAGAAAGCCACACT-3'。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA即miR-644及其前體序列在診斷、預(yù)防、治療和/或預(yù)后評估惡性腫瘤中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含SEQ ID NO1所示的核苷酸序列的核酸或者其生物活性功能片段或變體5′-AGUGUGGCUUUCUUAGAGC-3′，所述微小RNA的前體為包含SEQ ID NO3所示的核苷酸序列的核苷酸或者其生物活性功能的片段或變體。該微小RNA可以作為一種新型的藥物組合物用于惡性腫瘤的預(yù)防和/或治療，此外，該微小RNA還可以作為一種新的生物標(biāo)志物應(yīng)用于惡性腫瘤的診斷和/或預(yù)后評估。
文檔編號A61K48/00GK102978278SQ201110263730
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月7日
發(fā)明者李培峰, 王建勛, 李倩 申請人:中國科學(xué)院動物研究所