專利名稱：一種抗菌肽緩釋微球制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗菌肽微球制劑及其制備方法，尤其涉及一種用于非靜脈給藥的長效抗菌肽緩釋微球制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽是具有抗菌活性的一類短肽，廣泛存在于生物界，是先天免疫的重要防御成分，其殺細(xì)胞機(jī)制為在靶細(xì)胞膜上穿孔，靶細(xì)胞因滲透壓改變而死亡?？咕木哂袕V譜抗菌活性，并不易產(chǎn)生耐藥性，有良好的應(yīng)用前景。但是抗菌肽在體內(nèi)容易被蛋白酶降解，體內(nèi)循環(huán)半衰期短，患者需要頻繁給藥，不僅給患者帶來了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還給患者帶來了給藥痛苦。因此，研究抗菌肽長效緩釋制劑具有重要的意義。近年來，生物可降解的高分子材料廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)多肽類藥物長效緩釋微球的制備，其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)，由于其良好的生物相容性和可生物降解性，已被美國FDA批準(zhǔn)為藥用高分子輔料使用。以生物可降解材料作載體的緩釋微球注射制劑， 順應(yīng)了制劑學(xué)向長效、高效、低毒發(fā)展的方向，已成為三十年來藥劑學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。它具有以下優(yōu)點(diǎn)①與普通注射劑相比，長效注射微球顯著延長給藥間隔，大大提高了病人用藥的依從性。②可以持續(xù)維持最低有效濃度，因而可以減少總的給藥劑量，減輕某些副作用。③生物可降解微球注射劑不需手術(shù)植入，僅肌肉注射，釋藥后載體可生物降解，其降解物被機(jī)體吸收，克服了以往植入劑使用上的不便，為患者提供了一種很好的給藥方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含抗菌肽的可生物降解緩釋微球，同時(shí)還提供一種制備所述含抗菌肽的可生物降解長效緩釋微球的方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種抗菌肽緩釋微球制劑，包括載體聚乳酸-羥基乙酸共聚物，以及包封在所述載體中的抗菌肽。在本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述微球制劑的粒徑為 40-100Mm。在本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為5000-100000，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量百分比為25 :75-85 :15。優(yōu)選地，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量百分比為50 :50-85 15 ；更優(yōu)選地，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量百分比為40 60-60 :40。一種如上所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，用生物可降解高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物為載體材料，包封抗菌肽，通過超聲或高速攪拌進(jìn)行乳化，在低速攪拌下使有機(jī)溶劑揮發(fā)，形成聚合物緩釋微球，具體包括以下步驟
(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于有機(jī)溶劑中，制成中油相；
(2)將抗菌肽溶于pH為5-7的緩沖液中，制成內(nèi)水相；(3)將步驟(2)制成的內(nèi)水相溶液加入到步驟(1)制成的中油相中，其中內(nèi)水相與中油相的體積比為2-20%，勻化，形成初乳；
(4)將步驟(3)制成的初乳滴加到含有聚乙烯醇的外水相分散介質(zhì)中，其中初乳與外水相分散介質(zhì)的體積比為1%_10%，勻化，形成復(fù)乳，除去有機(jī)溶劑后洗滌干燥，得含有抗菌肽的緩釋微球。所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法可分為以下幾個(gè)階段 (一)初乳的制備(一次乳化)
將內(nèi)水相與中油相溶液混合，盛裝于適當(dāng)?shù)娜萜髦?，冰浴，乳化，形成初乳。可采用間歇式超聲(135W，40KHz)法進(jìn)行乳化，超聲的總時(shí)間為l-^iin。但不限于超聲乳化，也可以采用攪拌方式乳化。(二)復(fù)乳的制備(二次乳化)
取適量(體積范圍為初乳體積的10-100倍)的4°C預(yù)冷的外水相分散溶液，置于機(jī)械攪拌器上，在攪拌條件下加入初乳，進(jìn)行第二次乳化(即復(fù)乳化)，攪拌速度為1000-4000rpm， 攪拌時(shí)間為1-5分鐘。(三)溶劑的揮發(fā)
調(diào)整攪拌速度為400-600rpm，攪拌法揮發(fā)有機(jī)溶劑，溫度為室溫，溶劑揮發(fā)時(shí)間為3_4 小時(shí)，得到硬化的微球。(四)微球的洗滌及收集
采用離心法收集微球，用注射用水洗滌三次，用少量水懸浮后凍干，收集微球，于干燥器中保。微球長期不用時(shí)，需放置于4°C低溫環(huán)境下保存。本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(1) 中的有機(jī)溶劑為二氯甲烷或二氯甲烷與乙酸乙酯的混合液，所述二氯甲烷與乙酸乙酯的體積比為 60 :40-100 =Oo本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟 (2)中的微球內(nèi)水相為含抗菌肽的緩沖液(ΡΗ5-7)，所述緩沖液中，以質(zhì)量濃度計(jì)，加 Λ 0. 5%-10%的甘氨酸、0. 1%-10%的聚乙烯醇、0. 1%-10%的海藻糖、0. 5%-10%的碳酸鋅、 0. 001%-1. 0%的吐溫20中的至少一種，以增加抗菌肽在包封和釋放時(shí)的穩(wěn)定性。本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(4) 中外水相分散介質(zhì)中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為0. 1%-0. 5%，所述外水相分散介質(zhì)中可加入質(zhì)量濃度為0%-10%的無機(jī)鹽，以增加抗菌肽的包封率。所述外水相分散介質(zhì)的PH值與內(nèi)水相相同。本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(3) 中采用超聲進(jìn)行勻化，超聲時(shí)間為1-4分鐘。本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，所述步驟(4) 中采用高速攪拌進(jìn)行勻化，所述高速攪拌的速度為1000-4000rpm，攪拌時(shí)間為1_5分鐘。本發(fā)明所述抗菌肽是用基因工程方法制備或人工合成方法制備。本發(fā)明所述抗菌肽緩釋微球的制備方法所制備的微球表面光滑，外觀均勻，顆粒規(guī)則無粘連，平均粒徑為40-100μπι，載藥量、包封率高，緩釋期為30天左右，可生物降解，生物相容性好，可用于皮下、肌肉等非靜脈形式給藥。


圖1為本發(fā)明抗菌肽緩釋微球制劑一種實(shí)施例的制備工藝流程圖。圖2為載有抗菌肽的PLGA微球的電鏡照片。
具體實(shí)施例方式為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例1
本發(fā)明一種實(shí)施例抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，包括以下步驟
(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷溶液中，制備4.Oml濃度為100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液，得中油相；
(2)將抗菌肽溶于0.02M磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)中，制備0. 4ml濃度為8. 25 mg/ml的抗菌肽溶液，得內(nèi)水相；
(3 )將步驟(2 )制得的內(nèi)水相加到步驟(1)制得的中油相中，將得到的混合液在冰浴條件下超聲(135W，40KHz)乳化2min，得到W/0乳液；
(4)將步驟(3)得到的乳液滴加到IOOml含0. 5%PVA的0. 02M磷酸鹽緩沖液(PH6. 5) 中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌!Min制得W/0/W乳狀液，然后將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至600rpm，室溫下攪拌 3-4h，除去有機(jī)溶劑，微球固化后離心收集，雙蒸水洗滌三次，冷凍干燥，即得含有抗菌肽的緩釋微球。本實(shí)施例所得微球平均粒徑為72Mm，包封率為72. 9%，載藥量為0. 52%。實(shí)施例2
本發(fā)明一種實(shí)施例抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，包括以下步驟
(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷溶液中，制備4.Oml濃度為100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液，得中油相；
(2)將抗菌肽溶于0.02M磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)中，制備0. 4ml濃度為8. 25 mg/ml的抗菌肽溶液，得內(nèi)水相；
(3 )將步驟(2 )制得的內(nèi)水相加到步驟(1)制得的中油相中，將得到的混合液在冰浴條件下超聲(135W，40KHz)乳化2min，得到W/0乳液；
(4)將步驟(3)得到的乳液滴加到IOOml含0. 5%PVA和5%NaCL的0. 02M磷酸鹽緩沖液 (pH6. 5)中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌^iin制得W/0/W乳狀液，然后將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至600rpm，室溫下攪拌3-4h，除去有機(jī)溶劑，微球固化后離心收集，雙蒸水洗滌三次，冷凍干燥，即得含有抗菌肽的緩釋微球。本實(shí)施例所得微球平均粒徑為56Mm，包封率為85. 4%，載藥量為0. 63%。實(shí)施例3
本發(fā)明一種實(shí)施例抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，包括以下步驟
(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷溶液中，制備4.Oml濃度為100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液，得中油相；
(2)將抗菌肽溶于0.02M磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)中，制備0. 4ml濃度為8. 25 mg/ml的抗菌肽溶液，得內(nèi)水相；
(3 )將步驟(2 )制得的內(nèi)水相加到步驟(1)制得的中油相中，將得到的混合液在冰浴條件下超聲(135W，40KHz)乳化2min，得到W/0乳液；
(4)將步驟(3)得到的乳液滴加到IOOml含0. 5%PVA的0. 02M磷酸鹽緩沖液(pH6. 5) 中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌!Min制得W/0/W乳狀液，然后將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至600rpm，室溫下攪拌 3-4h，除去有機(jī)溶劑，微球固化后離心收集，雙蒸水洗滌三次，冷凍干燥，即得含有抗菌肽的緩釋微球。本實(shí)施例所得微球平均粒徑為80. 3μπι,包封率為87. 5%，載藥量為0. 67%。實(shí)施例4
本發(fā)明一種實(shí)施例抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，包括以下步驟
(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于二氯甲烷溶液中，制備4.Oml濃度為100mg/ml PLGA的二氯甲烷溶液，得中油相；
(2)將抗菌肽溶于含3%甘氨酸的0.02M磷酸鹽緩沖液(PH6. 5)中，制備0. 4ml濃度為 8. 25 mg/ml的抗菌肽溶液，得內(nèi)水相；
(3 )將步驟(2 )制得的內(nèi)水相加到步驟(1)制得的中油相中，將得到的混合液在冰浴條件下超聲(135W，40KHz)乳化2min，得到W/0乳液；
(4)將步驟(3)得到的乳液滴加到IOOml含0. 5%PVA和5%NaCL的0. 02M磷酸鹽緩沖液 (pH6. 5)中，以2000rpm的轉(zhuǎn)速攪拌^iin制得W/0/W乳狀液，然后將轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至600rpm，室溫下攪拌3-4h，除去有機(jī)溶劑，微球固化后離心收集，雙蒸水洗滌三次，冷凍干燥，即得含有抗菌肽的緩釋微球。本實(shí)施例所得微球平均粒徑為58. 4μπι,包封率為78. 1%，載藥量為0. 59%。實(shí)施例5
對實(shí)施例1至4所得抗菌肽微球制劑進(jìn)行體外釋放度考察和外觀形狀測定，試驗(yàn)過程及結(jié)果如下
抗菌肽緩釋微球體外釋放度試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)試劑、樣品與儀器ρΗ7. 4的磷酸鹽緩沖液；根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2、3、4所述方法制備的抗菌肽緩釋微球；恒溫水浴振蕩器、離心機(jī)、高效液相色譜儀。實(shí)驗(yàn)方法精密稱取試驗(yàn)樣品約50mg，置于容積為5ml聚丙烯管中，加入pH7. 4的磷酸鹽緩沖液anl，置于恒溫水浴震蕩器中，在37°c和75rpm的條件下恒溫震蕩，于O、1、2、 3、5、7、10、14、18、21、25、28、35天定期取樣。取樣時(shí)將聚丙烯管取出，5000rpm離心IOmin, 取上清液Iml作為供試液，棄去上清液，沉淀部分再添加新鮮的釋放介質(zhì)1ml，再將聚丙烯管放入恒溫水浴振蕩器繼續(xù)振蕩。用HPLC測定釋放液的濃度，計(jì)算微球的累積釋放度。試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1抗菌肽緩釋微球體外釋放度試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗菌肽緩釋微球制劑，其特征在于，包括載體聚乳酸-羥基乙酸共聚物，以及包封在所述載體中的抗菌肽。
2.如權(quán)利要求1所述的抗菌肽緩釋微球制劑，其特征在于，所述微球制劑的粒徑為 40-100Mm。
3.如權(quán)利要求1所述的抗菌肽緩釋微球制劑，其特征在于所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物的分子量為5000-100000，所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量百分比為25 75-85 :15ο
4.如權(quán)利要求3所述的抗菌肽緩釋微球制劑，其特征在于所述聚乳酸-羥基乙酸共聚物中，聚乳酸與聚羥基乙酸的質(zhì)量百分比為50 :50-85 :15。
5.一種如權(quán)利要求1所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)將聚乳酸-羥基乙酸共聚物溶于有機(jī)溶劑中，制成中油相；(2)將抗菌肽溶于pH為5-7的緩沖液中，制成內(nèi)水相；(3)將步驟(2)制成的內(nèi)水相溶液加入到步驟(1)制成的中油相中，其中內(nèi)水相與中油相的體積比為2-20%，勻化，形成初乳；(4)將步驟(3)制成的初乳滴加到含有聚乙烯醇的外水相分散介質(zhì)中，其中初乳與外水相分散介質(zhì)的體積比為1%_10%，勻化，形成復(fù)乳，除去有機(jī)溶劑后洗滌干燥，得含有抗菌肽的緩釋微球。
6.如權(quán)利要求5所述的抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(1)中的有機(jī)溶劑為二氯甲烷或二氯甲烷與乙酸乙酯的混合液，所述二氯甲烷與乙酸乙酯的體積比為 60 :40-100 :0ο
7.如權(quán)利要求5所述的抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中的緩沖液中，以質(zhì)量濃度計(jì)，加入0. 5%-10%的甘氨酸、0. 1%_10%的聚乙烯醇、0. 1%-10%的海藻糖、0. 5%-10%的碳酸鋅、0. 001%-1. 0%的吐溫20中的至少一種。
8.如權(quán)利要求5所述的抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中外水相分散介質(zhì)中聚乙烯醇的質(zhì)量濃度為0. 1%-0. 5%，所述外水相分散介質(zhì)中還含有質(zhì)量濃度為0%-10%的無機(jī)鹽。
9.如權(quán)利要求5所述的抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中采用超聲進(jìn)行勻化，超聲時(shí)間為1-4分鐘。
10.如權(quán)利要求5所述的抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中采用高速攪拌進(jìn)行勻化，所述高速攪拌的速度為1000-4000rpm，攪拌時(shí)間為1_5分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開一種抗菌肽緩釋微球制劑及其制備方法，所述抗菌肽緩釋微球制劑包括載體聚乳酸-羥基乙酸共聚物，以及包封在所述載體中的抗菌肽。所述抗菌肽緩釋微球制劑的制備方法，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，通過超聲或高速攪拌進(jìn)行乳化，在低速攪拌下使有機(jī)溶劑揮發(fā)，采用生物可降解高分子材料聚乳酸-羥基乙酸共聚物為載體材料包封抗菌肽，形成聚合物緩釋微球。采用本發(fā)明所述方法制備所得的抗菌肽緩釋微球制劑，緩釋期為30天左右，可生物降解，生物相容性好，可用于皮下、肌肉等非靜脈形式給藥。
文檔編號A61K38/00GK102274485SQ201110256689
公開日2011年12月14日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者嚴(yán)卓添, 林艷晶, 汪猜, 皮燦輝, 肖小平 申請人:廣州和仕康生物技術(shù)有限公司