專利名稱：一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2010年以來，我國部分地區(qū)飼養(yǎng)的蛋鴨和種鴨，發(fā)生了一種新型流行性疾病，該疾病以突發(fā)性產(chǎn)蛋下降為主要特點(diǎn)，主要導(dǎo)致卵泡變形、變性，卵泡膜充血、出血，輸卵管炎性病變，暫將該流行性疾病稱為鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0) 0我們在某大型鴨場的發(fā)病種鴨上分離到一株病毒，經(jīng)初步鑒定該病毒為有囊膜的RNA病毒， RT-PCR鑒定黃病毒陽性，暫將該病毒稱為鴨黃病毒(Duck Flavivirus)。由于對該新型流行疾病無特效治療方法，疫苗的研制開發(fā)是控制該疾病的首選措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用本發(fā)明人自行分離、鑒定、保存的一株鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為疫苗生產(chǎn)用病毒株，通過使用6 14日齡的雞胚或6 14日齡的鴨胚或Vero細(xì)胞或 CEF細(xì)胞或BHK細(xì)胞或H(15細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備，再經(jīng)過滅活、配苗等步驟， 制備出一種安全、有效的新型鴨病疫苗——鴨出血性卵巢炎滅活疫苗。1.疫苗生產(chǎn)用病毒株(1)病毒來源疫苗制造及檢驗(yàn)用毒種為鴨黃病毒(Duck FlaViVirus)WFG36株，由本發(fā)明人從山東地區(qū)某養(yǎng)殖場的種鴨體內(nèi)分離得到，并進(jìn)行鑒定、保管和供應(yīng)。該病毒株已于2011年4 月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為=CGMCC No. 4718。(2)病毒株特性1)病毒含量將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10_2、10_3、10_4 3個(gè)稀釋度分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡SPF雞胚5枚，0. Iml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，M小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)， M小時(shí)之后死亡雞胚隨時(shí)取出，置于4°C保存，觀察至168小時(shí)，根據(jù)雞胚死亡數(shù)計(jì)算ELD5tl， 每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500幻對雞胚的毒力將毒種用滅菌生理鹽水作100倍稀釋，卵黃囊接種7日齡易感雞胚10枚，0. Iml/ 胚，置37°C繼續(xù)孵育，雞胚應(yīng)于接種后M 168小時(shí)死亡8枚以上，死亡胎兒出現(xiàn)全身性出血。3)免疫原性將毒種經(jīng)卵黃囊接種7日齡易感雞胚，收獲感染胚液和胚體，胚體加生理鹽水研磨后，與胚液混合，經(jīng)甲醛溶液滅活后，按1 2(水相油相)的比例制成油乳劑滅活疫
田ο取10只7 10日齡健康易感雛鴨，平均分為兩組，5只作為試驗(yàn)組，5只作為空白對照組，試驗(yàn)組每只頸背皮下注射疫苗0. 5ml，接種后21天，用鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為攻毒毒株進(jìn)行攻毒，點(diǎn)眼、滴鼻0. 2ml/只，肌注0. 3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鴨的抗凝血，分離血漿，分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡易感雞胚5枚，0. 2ml/胚，接種后觀察7天，免疫組應(yīng)至少4只病毒分離陰性，對照組應(yīng)至少4只病毒分離陽性。4)純凈按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。5)特異性將毒種用滅菌生理鹽水稀釋100倍，與等量抗鴨黃病毒特異性血清混合后，37°C 中和1小時(shí)，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0. aiil/胚，觀察168小時(shí)，應(yīng)不引起特異性死亡或感染，非特異性死亡雞胚應(yīng)不超過1枚。2. 一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法，主要是使用鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為疫苗生產(chǎn)用種毒，使用6 14日齡的雞胚或6 14日齡的鴨胚或Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞或 BHK細(xì)胞或H(15細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備，每0. Iml抗原病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD50 ； 抗原經(jīng)甲醛溶液或β-丙內(nèi)酯或二乙烯亞胺滅活后按常規(guī)方法制取水相，與礦物油制成的油相混合而成滅活油佐劑疫苗。具體有以下制備步驟(1)選擇鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為疫苗生產(chǎn)用種毒；(2)選擇6 14日齡的對鴨黃病毒易感的雞胚或6 14日齡的對鴨黃病毒易感的鴨胚或Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞或BHK細(xì)胞或Η(15細(xì)胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料；(3)抗原的制備可通過以下6種途徑實(shí)現(xiàn)1)用6 14日齡的易感雞胚作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種易感雞胚將生產(chǎn)用種毒按每胚> IOl tlELD5tl的劑量接種到易感胚卵黃囊或尿囊腔，接種后用蠟燭封好針孔，置37°C孵育；孵育和觀察易感雞胚接種后每日照蛋1次，棄去M小時(shí)內(nèi)的死亡胚，之后每12 小時(shí)照蛋一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2 8°C保存。168小時(shí)孵育完成后，取出全部雞胚， 置于2 8°C冷卻；收獲病毒液將冷卻的雞胚取出，無菌收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合。2)用6 14日齡的易感鴨胚作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種易感鴨胚將生產(chǎn)用種毒按每胚> IOl tlELD5tl的劑量接種到易感胚卵黃囊或尿囊腔，接種后用蠟燭封好針孔，置37°C孵育；孵育和觀察易感鴨胚接種后每日照蛋1次，棄去M小時(shí)內(nèi)的死亡胚，之后每12 小時(shí)照蛋一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2 8°C保存。168小時(shí)孵育完成后，取出全部鴨胚， 置于2 8°C冷卻；收獲病毒液將冷卻的鴨胚取出，無菌收獲胚體、胚液和絨毛尿囊膜，研磨混合。3)用Vero細(xì)胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的Vero細(xì)胞上，并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至72_%h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 0C ο4)用CEF細(xì)胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層CEF細(xì)胞后，放置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，當(dāng)細(xì)胞典型病變時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)至72_%h，至細(xì)胞病變達(dá)到80%左右，收獲毒液，置于-20°C。5)用BHK細(xì)胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的BHK細(xì)胞上，并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至72_%h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 0C ο6)用H(15細(xì)胞作為病毒繁殖及抗原制備用材料種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的H(15細(xì)胞上，并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至72_%h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 "C ο(4)制備的抗原(收獲的病毒液)，應(yīng)按《中國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2006，本發(fā)明簡稱《中國獸藥典》) 附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣1份測定病毒含量(ELD5tl)，應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)彡 103°ELD5。。(5)病毒液滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液(或β -丙內(nèi)酯或二乙烯亞胺)，搖勻后置于37°C進(jìn)行滅活；無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。滅活檢驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/胚，置36 37°C孵育，24小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚，逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(6)油乳劑滅活疫苗制備將配苗用的油相(注射用白油94份、加司本-806份、 硬脂酸鋁2份)和水相(滅活抗原96份、吐溫-80 4份)制備完成后，按油相與水相2 1 份的配比比例置于乳化罐中進(jìn)行乳化，乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。乳化完成后進(jìn)行無菌分裝，即可得到成品疫苗。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用微生物保藏號是CGMCC No. 4718的一株鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，通過使用6 14日齡的雞胚或6 14日齡的鴨胚或Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞或BHK細(xì)胞或H(15細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備，再經(jīng)過滅活、配苗等步驟，制備出一種安全、有效的預(yù)防和控制鴨出血性卵巢炎的疫苗。具體實(shí)施方法實(shí)施例以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。實(shí)施例1生產(chǎn)用毒種制備(1)毒種繁殖將毒種用滅菌生理鹽水稀釋100倍，卵黃囊接種6 14日齡SPF雞胚)，0. Iml/ 胚，棄去M小時(shí)內(nèi)死亡胚，之后每12小時(shí)照胚一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2 8°C保存，接種后168小時(shí)，所有活胚置2 8°C冷卻過夜，收獲所有雞胚的胚液，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌的胚液定量分裝，冷凍保存，注明收獲日期，毒種代次等。(2)毒種鑒定病毒含量將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-2、10_3、10-4 3個(gè)稀釋度分別經(jīng)卵黃囊接種6 14日齡日齡SPF雞胚5枚，0. Iml/胚，置37°C繼續(xù)孵育，M小時(shí)之內(nèi)死亡胚棄去不計(jì)，24小時(shí)之后死亡雞胚隨時(shí)取出，置于4°C保存，觀察至168小時(shí)，根據(jù)雞胚死亡數(shù)計(jì)算ELD5tl，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500純凈按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進(jìn)行，應(yīng)無細(xì)菌、霉菌、支原體和外源病毒污染。按照以上說明進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。符合以上標(biāo)準(zhǔn)的毒種作為生產(chǎn)用毒種。(3)毒種保存濕毒在-15°C以下，暫定為12個(gè)月；凍干毒在-70°C以下，暫定為M個(gè)月。(4)毒種繼代應(yīng)不超過3代。實(shí)施例2鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備(1)制苗用毒液的繁殖1)接種取生產(chǎn)用種毒，用滅菌生理鹽水稀釋100倍，卵黃囊接種6 14日齡日齡易感雞胚(或健康鴨胚)，0. Iml/胚，接種后用蠟燭封好針孔，置37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。2)孵育和觀察雞胚接種后每日照蛋1次，棄去對小時(shí)內(nèi)死亡胚，之后每12小時(shí)照蛋一次，隨時(shí)取出死亡胚，置于2 8°C保存，至168小時(shí)，取出全部雞胚，置于2 8°C冷卻過夜?；檬斋@將冷卻的雞胚取出，無菌收獲胚體和胚液，對每枚雞胚在吸取胚液前應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者，棄去不用。收獲的胚體、胚液、絨毛尿囊膜加滅菌生理鹽水研磨后，與胚液混合，取樣進(jìn)行檢驗(yàn)。_15°C以下保存?zhèn)溆谩?)檢驗(yàn)收獲的病毒液，應(yīng)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣一份測定病毒含量(ELD5tl),應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500(2)滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液至終濃度為0.1%，隨即充分搖勻，升溫至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅活48小時(shí)，滅活完畢后，分別取樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活的病毒液置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日。(3)半成品檢驗(yàn)
1)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。2)滅活檢驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0. 2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚， 逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(4)油乳劑滅活疫苗制備1)油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。幻水相制備取滅活抗原96份，加入滅菌的吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢?，使吐?80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，開動(dòng)電機(jī)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相1份，加完后轉(zhuǎn)入乳化罐中，以3000r/min乳化60分鐘即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。(5)分裝在無菌條件下，定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例3鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備(1)制苗用毒液的繁殖——用Vero細(xì)胞制備抗原1)種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的Vero細(xì)胞上， 并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；2)觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至72h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 0C ο3)檢驗(yàn)收獲的病毒液，應(yīng)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣一份測定病毒含量(ELD5tl),應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500(2)滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液至終濃度為0.1%，隨即充分搖勻，升溫至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅活48小時(shí)，滅活完畢后，分別取樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活的病毒液置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日。(3)半成品檢驗(yàn)
1)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長。2)滅活檢驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0. 2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚， 逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(4)油乳劑滅活疫苗制備1)油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。2)水相制備取滅活抗原96份，加入滅菌的吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢?，使吐溫_80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，開動(dòng)電機(jī)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相1份，加完后轉(zhuǎn)入乳化罐中，以3000r/min乳化60分鐘即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。(5)分裝在無菌條件下，定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例4(1)鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備——用CEF細(xì)胞制備抗原1)種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層CEF細(xì)胞后，放置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；2)觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)典型病變時(shí)，繼續(xù)培養(yǎng)至 72h,至細(xì)胞病變達(dá)到80%左右，收獲毒液，置于-20°C。3)檢驗(yàn)收獲的病毒液，應(yīng)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣一份測定病毒含量(ELD5tl),應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500(2)滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液至終濃度為0.1%，隨即充分搖勻，升溫至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅活48小時(shí)，滅活完畢后，分別取樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活的病毒液置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日。(3)半成品檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長?；脺缁顧z驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚， 逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(4)油乳劑滅活疫苗制備1)油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用?；盟嘀苽淙缁羁乖?6份，加入滅菌的吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢瑁雇聹?80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，開動(dòng)電機(jī)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相1份，加完后轉(zhuǎn)入乳化罐中，以3000r/min乳化60分鐘即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。(5)分裝在無菌條件下，定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例5(1)鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備——用BHK細(xì)胞制備抗原1)種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的BHK細(xì)胞上， 并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；2)觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至96h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 0C ο3)檢驗(yàn)收獲的病毒液，應(yīng)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣一份測定病毒含量(ELD5tl),應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500
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(2)滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液至終濃度為0.1%，隨即充分搖勻，升溫至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅活48小時(shí)，滅活完畢后，分別取樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活的病毒液置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日。(3)半成品檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長?；脺缁顧z驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚， 逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(4)油乳劑滅活疫苗制備1)油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用?；盟嘀苽淙缁羁乖?6份，加入滅菌的吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢?，使吐?80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，開動(dòng)電機(jī)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相1份，加完后轉(zhuǎn)入乳化罐中，以3000r/min乳化60分鐘即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。(5)分裝在無菌條件下，定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例6(1)鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備——用PK15細(xì)胞制備抗原1)種毒接種細(xì)胞將生產(chǎn)用種毒用生理鹽水稀釋后，接種到單層的H(15細(xì)胞上， 并將細(xì)胞瓶置于轉(zhuǎn)瓶機(jī)上培養(yǎng)；2)觀察與收獲接毒后每1 觀察一次，培養(yǎng)至96h，收獲毒液，將接毒細(xì)胞置于-20 0C ο3)檢驗(yàn)收獲的病毒液，應(yīng)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄逐瓶作無菌檢驗(yàn)，并抽樣一份測定病毒含量(ELD5tl),應(yīng)無菌生長，每0. Iml病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD500(2)滅活向檢驗(yàn)合格的病毒液中加入甲醛溶液至終濃度為0.1%，隨即充分搖勻，升溫至37°C時(shí)開始計(jì)時(shí)，滅活48小時(shí)，滅活完畢后，分別取樣，進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，滅活的病毒液置2 8°C保存，應(yīng)不超過30日。(3)半成品檢驗(yàn)1)無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄，對滅活病毒液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長?；脺缁顧z驗(yàn)取滅活后病毒液，卵黃囊接種7日齡SPF雞胚10枚，0.2ml/胚，置 36 37°C孵育，M小時(shí)內(nèi)死亡胚棄去，觀察至168小時(shí)，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1枚， 逐個(gè)檢查胎兒，均應(yīng)不出現(xiàn)肝臟、腎臟出血等病痕。(4)油乳劑滅活疫苗制備1)油相制備取注射用白油94份，加司本-80 6份，混合后，加硬脂酸鋁2份，隨加隨攪拌至透明為止，高壓滅菌備用。
幻水相制備取滅活抗原96份，加入滅菌的吐溫-80 4份，充分?jǐn)嚢?，使吐?80
完全溶解。3)乳化取油相2份置于油相罐中，開動(dòng)電機(jī)攪拌，同時(shí)緩慢加入水相1份，加完后轉(zhuǎn)入乳化罐中，以3000r/min乳化60分鐘即可。在乳化中止前加入1 %硫柳汞溶液，使其終濃度為0. 01%。乳化后，取8 IOml以3000r/min離心15分鐘，應(yīng)不出現(xiàn)分層。(5)分裝在無菌條件下，定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例7鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的檢驗(yàn)性狀外觀乳白色乳劑。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不多于0. 5ml。黏度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1. 2mm，上口內(nèi)徑為2. 7mm)吸取25°C左右的疫苗 1. Oml，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需時(shí)間，應(yīng)在8秒以內(nèi)。無菌檢驗(yàn)按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)無菌生長。安全檢驗(yàn)取1 2周齡SPF鴨10只，分別頸背皮下或肌肉注射疫苗1ml，觀察 14天，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗注射引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。效力檢驗(yàn)取10只7 10日齡SPF雛鴨，平均分為兩組，5只作為試驗(yàn)組，5只作為空白對照組，試驗(yàn)組每只頸背皮下注射疫苗0. :3ml，接種后21天，用鴨黃病毒強(qiáng)毒攻毒， 點(diǎn)眼、滴鼻0. 2ml/只，肌注0. 3ml/只。攻毒后第7天，采集每只鴨的抗凝血，分離血漿，分別經(jīng)卵黃囊接種7日齡易感雞胚5枚，0. 2ml/胚，接種后觀察7天，試驗(yàn)組應(yīng)至少4只病毒分離陰性，對照組應(yīng)至少4只病毒分離陽性。甲醛、汞類防腐劑殘留量測定分別按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行，應(yīng)符合獸用生物制品通則的規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗，其特征在于本發(fā)明所涉及的疫苗含有一株鴨黃病毒 (Duck FlaViVirus)WFG36株，該病毒株已于2011年4月12日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏， 編號為CGMCC No. 4718。
2.一種制造權(quán)利要求1所述鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于使用鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為疫苗生產(chǎn)用種毒；使用6 14日齡的雞胚或6 14日齡的鴨胚進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備；每0. Iml抗原病毒含量應(yīng)> IO3 0ELD50 ；抗原經(jīng)過甲醛溶液或 β-丙內(nèi)酯或二乙烯亞胺滅活后按常規(guī)方法制取水相，與礦物油制成的油相混合而成滅活油佐劑疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述的鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法，其特征在于可用Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞或BHK細(xì)胞或Η(15細(xì)胞替代6 14日齡的雞胚或6 14日齡的鴨胚進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗及其制備方法。本發(fā)明利用微生物保藏號是CGMCC No.4718的一株鴨黃病毒W(wǎng)FG36株作為生產(chǎn)疫苗的病毒株，使用6～14日齡的雞胚或6～14日齡的鴨胚或Vero細(xì)胞或CEF細(xì)胞或BHK細(xì)胞或PK15細(xì)胞進(jìn)行病毒的繁殖及抗原的制備，再經(jīng)過滅活、配苗等步驟，制備出一種安全、有效的預(yù)防和控制鴨出血性卵巢炎的疫苗。
文檔編號A61P31/14GK102302772SQ20111025451
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者劉喬然, 孫芬芬, 張青嬋, 徐龍濤, 李曉靜, 王蕾, 薛原, 鮑海忠 申請人:齊魯動(dòng)物保健品有限公司