專利名稱：一種具有對外源致癌劑有解毒作用的生姜提取物的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有對外源致癌劑有解毒作用的生姜提取物的制備方法及其產(chǎn)品，屬于生姜深加工技術(shù)領(lǐng)域，可用于開發(fā)低毒高效的癌癥預(yù)防劑、功能食品等產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
隨著社會生產(chǎn)的發(fā)展和工業(yè)化進程的加快，人們在日常生活和生產(chǎn)中接觸各種化學(xué)毒物的機會越來越多。據(jù)統(tǒng)計，全世界已登記的化學(xué)物達3000多萬種，常用的有8-10萬種。這些外源化學(xué)物主要包括工業(yè)污染物、環(huán)境污染物、食品中有害成分(天然毒素及添加劑)、農(nóng)用化學(xué)物及放射性核素等，它們可以通過不同途徑(接觸、呼吸道、消化道等)進入機體，誘發(fā)癌癥等惡性疾病，嚴重威脅著人類健康。外源物質(zhì)對機體的損傷特別是DNA的損傷是誘發(fā)癌癥的關(guān)鍵因素。外源物質(zhì)在體內(nèi)的解毒(生物轉(zhuǎn)化)主要涉及I相代謝和II相代謝。I相代謝主要是在細胞色素P450 酶系的作用下，使外源物質(zhì)發(fā)生氧化、還原及水解反應(yīng)；II相代謝則是通過結(jié)合反應(yīng)將內(nèi)源極性小分子物質(zhì)與I相反應(yīng)的活化產(chǎn)物或外來物質(zhì)結(jié)合，增加其水溶性，使其易于排出體外。由于I相代謝過程往往會激活某些致癌物前體，而II相代謝則可使高活性的致癌物失活，起真正解毒作用。II相代謝是在一系列II相代謝酶的催化下進行的，如醌氧化還原酶OiR)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)、血紅素氧合酶(H0-1)等，它們可以清除體內(nèi)多種致癌物質(zhì)及親電子試劑，保護生物功能蛋白及DNA免受破壞，因此，又被稱為II相解毒酶。很明顯，誘導(dǎo)這些酶的表達，可以有效地抵御外來致癌劑對機體的傷害，這已被認為是許多植物化學(xué)成分發(fā)揮癌癥預(yù)防作用的重要機制。目前，很多植物化學(xué)成分如萊菔硫烷、茶多酚、睡茄交酯類化合物等已被證實均可以顯著誘導(dǎo)II相解毒酶的活性，這些發(fā)現(xiàn)為篩選和開發(fā)潛在有效的腫瘤化學(xué)預(yù)防劑提供了理論基礎(chǔ)和應(yīng)用前景。生姜是一種傳統(tǒng)的藥食兼用植物，我國生姜資源豐富，種植歷史悠久，然而由于我國生姜加工藝水平不高，尤其是生姜深加工技術(shù)比較落后，導(dǎo)致目前生姜加工品種少、技術(shù)附加值低、綜合利用率低。盡管生姜及其提取物顯示了抗炎、鎮(zhèn)吐、抗腫瘤和抗菌等廣泛的生物學(xué)活性，然而目前尚沒有公開與生姜通過調(diào)節(jié)II相代謝酶發(fā)揮癌癥預(yù)防作用相關(guān)的報道及專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種具有對外源致癌劑有解毒作用的生姜提取物的制備方法及其產(chǎn)品。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的①以新鮮生姜為原料，精選后，清洗去除泥土，冷凍干燥，然后粉碎，在60_8(TC下用60-95%的乙醇溶液對上述姜粉浸提3_6h，過濾后取浸提液真空旋轉(zhuǎn)濃縮；生姜醇提物溶于300-500mL水中，然后加入等體積乙酸乙酯分層，收集乙酸乙酯層并濃縮干燥制得生姜乙酸乙酯提取物；②生姜乙酸乙酯提取物與3倍質(zhì)量的硅膠混合，干法上樣，采用硅膠柱色譜法分離，以乙酸乙酯/正己烷(0-100%乙酸乙酯，ν/ν)體系為洗脫劑等梯度洗脫，收集 30%-70%乙酸乙酯洗脫液洗脫組分，真空旋轉(zhuǎn)濃縮，氮吹儀揮干殘留溶劑，包裝、密封即為本發(fā)明所制備的生姜提取物。本發(fā)明的有益效果生姜及其提取物具有廣泛的藥理學(xué)活性，這些在專利《生姜提取物制劑及在防治膽石癥中的作用-200510023861. 2》、《生姜天然抗氧化劑的生產(chǎn)方法-200610042238. 6》、 《生姜中單萜苷類化合物及其抗菌用途和藥物組合物-200710067009. 4》等被報道。然而， 目前尚沒有與生姜通過調(diào)節(jié)II相解毒酶發(fā)揮癌癥預(yù)防作用相關(guān)的報道及專利。本發(fā)明制備的生姜提取物具有良好的II相解毒酶誘導(dǎo)能力，以廣泛采用的II相解毒酶細胞評價體系-HepalClC7為模型(體外實驗)，該提取物能顯著誘導(dǎo)醌氧化還原酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等典型II相解毒酶的表達；同時，體內(nèi)實驗結(jié)果表明該提取物可明顯提高苯并芘染毒大鼠肝臟中醌氧化還原酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的表達，起到明顯的解毒作用。該發(fā)明制備工藝簡單、適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，相比傳統(tǒng)生姜加工利用方法，產(chǎn)品附加值，可用于開發(fā)低毒高效的癌癥預(yù)防劑、功能食品等。
四

圖1是生姜提取物對H印alclc7細胞的相對QR誘導(dǎo)活性及細胞毒性
五具體實施例方式實施例1 生姜提取物的制備2. 21kg 新鮮生姜(Zingiber officinale Rose.)于 2009 年 4 月購于當(dāng)?shù)爻小?精選后，清洗去泥，冷凍干燥，然后粉碎，在70°C下用95%的乙醇溶液(1 10，m/v)對上述姜粉浸提4h，過濾后取浸提液真空旋轉(zhuǎn)濃縮。生姜醇提物溶于500mL水中，然后加入等體積乙酸乙酯，靜置分層，收集乙酸乙酯層，反復(fù)萃取5-6次，合并萃取液并濃縮干燥；取IOg生姜乙酸乙酯提取物與3倍質(zhì)量的硅膠混合，用5. 5cmX60cm的玻璃柱進行硅膠柱層析分離， 以乙酸乙酯/正己烷(0-100%乙酸乙酯，ν/ν)體系進行等梯度洗脫，收集30%-70%乙酸乙酯洗脫液洗脫組分，真空旋轉(zhuǎn)濃縮，氮吹儀揮干殘留溶劑，包裝、密封，得3. 87g本所明所述生姜提取物產(chǎn)品。實施例2 生姜提取物誘導(dǎo)II相酶活性測定2. 1原理醌氧化還原酶OlR)是一種重要的II相解毒酶。它具有易與其它II相酶協(xié)同作用、對誘導(dǎo)子響應(yīng)性好以及測量方便等優(yōu)點，被廣泛用作測定II相酶的生物標(biāo)記物；而鼠肝癌ifepa lclc7細胞株中QR表達穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，使得該細胞株逐漸成為一種快速可靠的QR酶活性測定模型。2. 2細胞株小鼠肝癌h印alclc7細胞，購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。2. 3測定方法將融合度達80%的H印alclc7細胞以5000/孔接種于96孔板， 37°C,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh。然后每孔添加200 μ L含生姜提取物的新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入50μ L的0.08% (w/v)的洋皂黃地苷和2mMEDTA溶液，振蕩30min。然后每孔加入200 μ L反應(yīng)溶液。反應(yīng)液配方為0. Ig牛血清，3. 75mL的IM Tri-HCl, ImLl. 5% 吐溫-20，ImL 0. 75mM 的 FAD，ImL 150mM 葡萄糖 6-磷酸，90 μ L 50mM NADP，300U 6-磷酸葡萄糖脫氫酶，45mg MTT，用去離子水定容至140mL。最后，每孔加入0. 2 μ L甲萘醌 (50mM溶于乙醇)，立即測定490nm處10分鐘內(nèi)吸光值的動力學(xué)曲線。同時，取相同96孔重復(fù)板，采用MTT法測定在eiOnm處吸光值，計算細胞存活率。2. 4醌還原酶活性的計算公式QR 誘導(dǎo)活性=(樣品 OD490-空白 OD490) / (對照 OD490-空白 OD490)；相對QR誘導(dǎo)活性=樣品QR誘導(dǎo)活性/對照組QR誘導(dǎo)活性；細胞存活率=(樣品OD610-空白 OD610)/(對照 OD610-空白 OD610) X 100% ；樣品的QR誘導(dǎo)活性用CD值來衡量，其定義為使相對QR誘導(dǎo)活性值為2時對應(yīng)的樣品濃度；細胞存活率> 50%且相對QR誘導(dǎo)活性> 2時樣品具有誘導(dǎo)活性。2. 5實驗結(jié)論該生姜提取物具有顯著的誘導(dǎo)醌氧化還原酶OiR)能力，其兩倍誘導(dǎo)濃度(CD值) 為7. 8士0. 3μ g/mL(圖1)，表明該化合物具有較強的II相解毒酶誘導(dǎo)潛力。
權(quán)利要求
1.一種具有對外源致癌劑有解毒作用的生姜提取物，其特征在于該生姜提取物中起解毒作用的活性成份主要包括6-姜酚、1-脫氫-[6]-姜二酮、6-姜烯酚、1-脫氫-[10]-姜二酮、6-脫氫姜烯酚和六氫姜黃素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述之提取物，主要來源于生姜鮮品或干品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生姜提取物的制備方法其特征在于由以下步驟組成①以新鮮生姜為原料，精選后，清洗去除泥土，冷凍干燥，然后粉碎，在60-80°C下用 60-95%的乙醇溶液對上述姜粉浸提3-6h，過濾后取浸提液真空旋轉(zhuǎn)濃縮；生姜醇提物溶于300-500mL水中，然后加入等體積乙酸乙酯分層，收集乙酸乙酯層并濃縮干燥制得生姜乙酸乙酯提取物；②生姜乙酸乙酯提取物與3倍質(zhì)量的硅膠混合，干法上樣，采用硅膠柱色譜法分離，以乙酸乙酯/正己烷(0-100%乙酸乙酯，ν/ν)體系為洗脫劑等梯度洗脫，收集30%-70%乙酸乙酯洗脫液洗脫組分，真空旋轉(zhuǎn)濃縮，氮吹儀揮干殘留溶劑，包裝、密封即為本發(fā)明所制備的生姜提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生姜提取物緩解外源致癌劑毒性的用途，其特征在于該生姜提取物具有顯著的誘導(dǎo)II相解毒酶的能力，以醌氧化還原酶OiR)為生物標(biāo)志物，其兩倍誘導(dǎo)濃度值(⑶值)小于10 μ g/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生姜提取物緩解外源致癌劑毒性的用途，其特征在于所述 II相解毒酶對于外源性致癌劑具有解毒功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有對外源致癌劑有解毒作用的生姜提取物的制備方法及其產(chǎn)品，屬于生姜深加工技術(shù)領(lǐng)域。它是以新鮮生姜為原料，精選、清洗后，冷凍干燥，然后粉碎，首先進行乙醇溶液浸提、濃縮制得生姜醇提物；然后再經(jīng)乙酸乙酯/水相分離，收集乙酸乙酯層并濃縮干燥制得乙酸乙酯提取物；最后以硅膠柱色譜法分離，以乙酸乙酯/正己烷體系等梯度洗脫，收集30％-70％乙酸乙酯洗脫液洗脫組分，真空濃縮，氮吹儀揮干殘留溶劑，包裝、密封即為本發(fā)明所制備的生姜提取物。該提取物可顯著誘導(dǎo)鼠肝癌Hepa1c1c7細胞中醌氧化還原酶(QR)的活性，顯示了良好的上調(diào)II相解毒酶的潛力，可用于開發(fā)低毒高效的癌癥預(yù)防劑、功能食品等產(chǎn)品。
文檔編號A61P39/02GK102266547SQ201110253459
公開日2011年12月7日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者安辛欣, 方勇, 李鋒, 楊方美, 胡秋輝, 辛志宏, 馬寧 申請人:南京財經(jīng)大學(xué)