專利名稱：阿魏酸在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從禾木科植物中提取的單體物質(zhì)阿魏酸的新用途，具體涉及阿魏酸在制備具有促進(jìn)皮膚傷口愈合作用藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人體自身的傷口愈合能力會(huì)由于種種外界條件受到限制，如傷口面積，年齡，或病患等因素。目前，臨床處理創(chuàng)傷的方法普遍仍停留在皮膚移植、縫合、清創(chuàng)、及抗感染等治療措施，尚缺乏有效加速傷口愈合的辦法和藥物。皮膚傷口愈合是一個(gè)特殊的生理學(xué)過程，該過程涉及到皮膚生長(zhǎng)和組織再生，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的，可溶調(diào)節(jié)物、血細(xì)胞、胞外基質(zhì)以及薄壁細(xì)胞互相作用的過程。皮膚傷口愈合分炎癥反應(yīng)，新組織形成，組織重建三個(gè)過程，其基礎(chǔ)是炎癥細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞的一系列活動(dòng)。表皮細(xì)胞的遷移能力對(duì)于傷口愈合至關(guān)重要。炎癥反應(yīng)過后，傷口邊緣的角質(zhì)細(xì)胞慢慢遷移增殖到傷口表面，形成一層保護(hù)膜。成纖維細(xì)胞開始合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)用于組織修復(fù)。如果成纖維細(xì)胞過多會(huì)導(dǎo)致形成過于肥厚的傷疤，而皮膚傷口不愈或愈合較慢都與皮膚的角質(zhì)細(xì)胞的遷移能力有密切的關(guān)系。皮膚中行使主要修復(fù)功能的細(xì)胞有表皮細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。研究表明細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子能夠促進(jìn)皮膚細(xì)胞增殖，促進(jìn)傷口愈合，但是這些物質(zhì)價(jià)格比較昂貴，而且由于生長(zhǎng)因子是一種分裂原，其在體內(nèi)使用是否會(huì)引發(fā)癌變也是一個(gè)值得探討的安全問題。從植物中提取的天然有效活性成分一般副作用較小，價(jià)格適中，安全性較高，質(zhì)量易于保證，具有一定的應(yīng)用前景和優(yōu)勢(shì)。實(shí)驗(yàn)研究表明阿魏酸具有廣泛的生物活性和藥理作用，如具有抗血小板聚集，鎮(zhèn)痛，緩解血管痙攣等作用，但對(duì)于阿魏酸在皮膚傷口愈合方面的研究和應(yīng)用，目前尚未見國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平開展阿魏酸在皮膚傷口愈合方面的作用研究具有非常重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明創(chuàng)新地提出了阿魏酸在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠明顯促進(jìn)人表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移，能明顯促進(jìn)小鼠皮膚的傷口愈合時(shí)間和傷口收縮效果。本發(fā)明在皮膚傷口愈合中的應(yīng)用，可以作為添加劑的形式使用，可以制成具有促傷口愈合的霜?jiǎng)?、乳劑、軟膏、氣霧劑、 溶液劑、等各類劑型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出了阿魏酸在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的應(yīng)用。其中，阿魏酸是促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的活性成分，其含量為0. 5%-10%質(zhì)量濃度。其中，所述促傷口愈合藥物可以是霜?jiǎng)⑷閯?、軟膏、氣霧劑、溶液劑。本發(fā)明中的阿魏酸可以是純品，或包含阿魏酸成分的任何組成物或混合物或復(fù)方。其中，所述阿魏酸的含量可以是起到有效作用的任何比例范圍。較佳的是，本發(fā)明中阿魏酸的含量為0. 5%-10%質(zhì)量濃度。
禾木科植物中提取的阿魏酸(Ferulic Acid)分子式為CltlHltlO4,分子量為194. 19， 其結(jié)構(gòu)式如式(I)所示。純化的阿魏酸(HPLC純度>99%)，為白色結(jié)晶，易溶于乙醇。目前未見有報(bào)道公開阿魏酸具有促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用。
式(I)-本發(fā)明進(jìn)行了細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)和小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，也進(jìn)行了人體皮膚傷口愈合的效果評(píng)價(jià)試驗(yàn)，首次公開報(bào)道了阿魏酸具有明顯促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用。通過細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)和小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿魏酸具有顯著促進(jìn)皮膚細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的作用，能使皮膚傷口愈合速度明顯加快，人體實(shí)驗(yàn)效果評(píng)價(jià)良好，本發(fā)明首次公開了阿魏酸具有促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用效果。本發(fā)明應(yīng)用中所述的阿魏酸能促皮膚傷口愈合可以作為任何添加劑的形式使用。 含有本發(fā)明活性成分阿魏酸的皮膚外用組合物或混合物或復(fù)方，可以制成具有促皮膚傷口愈合的霜?jiǎng)?、乳劑、軟膏、氣霧劑、溶液劑等各類使用劑型。


圖1是阿魏酸對(duì)人表皮細(xì)胞增殖的影響示意圖。圖2是阿魏酸對(duì)人表皮細(xì)胞遷移的影響示意圖。圖3是阿魏酸對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響示意圖。圖4是阿魏酸對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞遷移的影響示意圖。圖5是阿魏酸對(duì)動(dòng)物傷口愈合的實(shí)際效果示意圖。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)材料與方法 1、實(shí)驗(yàn)材料
阿魏酸，純度> 90% (購(gòu)自鄭州荔諾生物科技有限公司)，IOmg溶解于500微升DMSO溶液中，配成濃度為20mg/ml的原液，置于4°C保存。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用時(shí)用DMEM培養(yǎng)液將原液稀釋成所需濃度即可。2、細(xì)胞培養(yǎng)
人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)，用含10%小牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。人皮膚成纖維細(xì)胞(2522細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)，用含10%小牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件37 °C，5%C02。
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3、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)小鼠30只(C57BL/6小鼠購(gòu)自上海斯萊克動(dòng)物有限公司，SPF級(jí))，體重25- 克， 實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性預(yù)飼養(yǎng)一周，鼠房12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗間隔，動(dòng)物給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和水，每天由實(shí)驗(yàn)人員觀察記錄。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組6只A 空白對(duì)照組；B 陽性藥物積雪苷霜軟膏對(duì)照組(上海現(xiàn)代制藥股份有限公司生產(chǎn))；C 0. 5%阿魏酸實(shí)驗(yàn)組；D 1%阿魏酸實(shí)驗(yàn)組；E: 10%阿魏酸實(shí)驗(yàn)組。小鼠經(jīng)剃發(fā)器剔去背部毛發(fā)后再用脫毛膏背部脫毛，隨后用自來水清洗，隔M小時(shí)后做皮膚切口。腹腔注射戊巴比妥麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，將其背部朝上平整躺臥于工作臺(tái)上，避免背部皮膚局部過度拉伸或皺縮。以小鼠無法舔舐碰觸的原則，在其背部用0.8cm直徑打孔器切除一圓形全層皮膚，形成機(jī)械損傷動(dòng)物模型。創(chuàng)面自然止血，并于固定的時(shí)間點(diǎn)對(duì)切口敷藥?？瞻讓?duì)照組每天在傷口處凃30%甘油IOOul —次，陽性藥物對(duì)照組按說明書要求直接在傷口處涂抹藥物，阿魏酸實(shí)驗(yàn)組每天在傷口處凃30%甘油中含0. 5%、1%、10%阿魏酸的溶劑lOOul，每次溶劑要覆蓋整個(gè)傷口面積，連續(xù)給藥6天。每隔兩天測(cè)量記錄傷口尺寸大小并拍照。測(cè)量每只小鼠的傷口直徑，按照平行脊椎、垂直脊椎、從左到右和從右到左，測(cè)量四次傷口大小數(shù)據(jù)，取其平均值作為該鼠傷口直徑的數(shù)據(jù)。4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差T 士S表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。實(shí)施例1、阿魏酸對(duì)人表皮細(xì)胞增殖的影響
96孔板中培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，用不同濃度的阿魏酸(1 μ g/ml、10 μ g/ml、50 μ g/ml、 100μ g/ml、200l·! g/ml)處理HaCaT細(xì)胞24h后，采用MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)阿魏酸作用濃度為50 μ g/ml以下時(shí)，對(duì)HaCaT細(xì)胞有明顯的增殖作用，且呈劑量依賴關(guān)系，對(duì)角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用。結(jié)果如圖1所示。其中，藥物組與對(duì)照組比氺P < 0. 05,氺氺P < 0. 01。實(shí)施例2、阿魏酸對(duì)人表皮細(xì)胞遷移的影響
將HaCaT細(xì)胞接種到12孔板上，培養(yǎng)約M小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部時(shí)用200 μ 1 槍頭沿著垂直孔徑在底部細(xì)胞層上劃開一道劃痕，吸棄原培養(yǎng)液后再加入PBS每孔500 μ 1 沖洗漂浮的細(xì)胞碎片兩次。實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組加培養(yǎng)基，另一組加入含50 μ g/ml阿魏酸的培養(yǎng)基。在顯微鏡下拍攝初始狀態(tài)和1 后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 (a)、圖2 (b)、圖2 (C)、圖2 (d)所示，其中，圖2 (a)、圖2 (c) 是對(duì)照組，圖2 (b)、圖2 (d)是阿魏酸組50 μ g/ml濃度。圖2(a)、圖2 (b)是兩組細(xì)胞劃線后0小時(shí)的情況，圖2 (c)、圖2 (d)是兩組細(xì)胞12小時(shí)后的遷移情況。阿魏酸(50yg/ ml)作用人表皮細(xì)胞12小時(shí)后，阿魏酸組細(xì)胞遷移的速度明顯加快，促細(xì)胞傷口愈合的能力與對(duì)照組比較有明顯的差異，表明阿魏酸對(duì)人表皮細(xì)胞的遷移有明顯的促進(jìn)作用。實(shí)施例3、阿魏酸對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響
將人皮膚成纖維細(xì)胞2522接種到96孔板中培養(yǎng)，用不同濃度的阿魏酸(1 μ g/ml、 10 μ g/ml、50 μ g/ml、100 μ g/ml、200 μ g/ml)處理 2522 細(xì)胞 24h 后，采用 MTS 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)阿魏酸作用濃度為50 μ g/ml以下時(shí)，對(duì)2522細(xì)胞有明顯的增殖作用，且呈劑量依賴關(guān)系，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，說明阿魏酸對(duì)促進(jìn)皮膚的真皮層傷口愈合有一定的效果。見圖3。其中，藥物組與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P < 0. 01。實(shí)施例4、阿魏酸對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞遷移的影響
將人皮膚成纖維細(xì)胞2522接種到12孔板上，培養(yǎng)約48小時(shí)后待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿底部時(shí)用200 μ 1槍頭沿著水平孔徑在底部細(xì)胞層上劃開一道劃痕，吸棄原培養(yǎng)液后再加入 PBS每孔500 μ 1沖洗漂浮的細(xì)胞碎片兩次。實(shí)驗(yàn)分為兩組，一組加培養(yǎng)基，另一組加入含 50 μ g/ml阿魏酸的培養(yǎng)基。在顯微鏡下拍攝初始狀態(tài)和1 后細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4 (a)、圖4 (b)、圖4 (c)、圖4 (d)所示顯示，其中，4 (a)、圖4 (c)是對(duì)照組，圖4 (b)、圖4 (d)是阿魏酸組50 μ g/ml濃度。圖4 (a)、圖4 (b)是兩組細(xì)胞劃線后0小時(shí)的情況，圖4(c)、圖4(d)是兩組細(xì)胞12小時(shí)后的遷移情況。阿魏酸(50 μ g/ml) 作用人皮膚成纖維細(xì)胞12小時(shí)后，阿魏酸組細(xì)胞遷移的速度與對(duì)照組相比沒有明顯差異， 表明阿魏酸對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞的遷移基本不存在促進(jìn)作用，表明阿魏酸在皮膚的傷口愈合過程中能對(duì)抑制疤痕的產(chǎn)生能起到很好的作用效果。表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增長(zhǎng)在皮膚傷口愈合的過程中起著非常重要的作用，表皮細(xì)胞的遷移和再上皮化對(duì)皮膚傷口愈合收縮起著重要作用，表皮細(xì)胞的遷移速度快于成纖維細(xì)胞則皮膚傷口的修復(fù)會(huì)比較平整，如果成纖維細(xì)胞的遷移速度快于表皮細(xì)胞則容易形成皮膚疤痕，因此，本發(fā)明中阿魏酸對(duì)皮膚傷口愈合的修復(fù)修用主要表現(xiàn)在促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖和遷移，加快傷口收縮，是一種比較理想的傷口愈合添加劑。實(shí)施例5、阿魏酸對(duì)動(dòng)物皮膚傷口愈合的實(shí)際效果
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明陽性藥物組和不同濃度的阿魏酸各組與對(duì)照組比較均有明顯收縮皮膚傷口的作用，從第4天開始陽性藥物組和0. 5%阿魏酸組與對(duì)照組比較均有顯著的差異(P < 0. 05)，而1%和10%阿魏酸組與對(duì)照組比較均有非常顯著的差異(P < 0.01)，傷口愈合作用效果明顯，見表1。至實(shí)驗(yàn)第6天、第10天實(shí)驗(yàn)各組與對(duì)照組的差異更加明顯，均與對(duì)照組有非常顯著的差異(P < 0. 01)，如表1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，不同濃度的阿魏酸組對(duì)小鼠皮膚傷口的愈合均有明顯的促進(jìn)作用，且呈明顯的量效關(guān)系。其中1%和10%阿魏酸濃度組的效果比陽性藥物積雪苷霜軟膏對(duì)照組的作用效果更為明顯，實(shí)驗(yàn)表明相同時(shí)間阿魏酸能明顯加快小鼠傷口的收縮，有顯著促進(jìn)小鼠皮膚傷口愈合的作用。阿魏酸對(duì)小鼠皮膚傷口愈合的實(shí)驗(yàn)效果如圖5顯示，其中圖5(a)三個(gè)小鼠為對(duì)照組，每天在傷口處凃30%甘油IOOul，分別作用時(shí)間為1天、4天、6天。圖5(b)為陽性藥物積雪苷霜軟膏對(duì)照組，每天在傷口處涂抹積雪苷霜軟膏，分別作用時(shí)間為1天、4天、6天。圖 5(c) (d) (e)中三組分別為涂抹質(zhì)量濃度0.5%、1%、10%阿魏酸的甘油溶劑組，每天在傷口處凃含不同濃度的阿魏酸溶劑lOOul，分別作用時(shí)間為1天、4天、6天。表1各組小鼠皮膚傷口平均直徑的測(cè)量結(jié)果(cm)
權(quán)利要求
1.阿魏酸在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述阿魏酸是促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的活性成分。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述阿魏酸的用量為0.5%-10%。
4.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述促進(jìn)傷口愈合藥物是霜?jiǎng)?、乳劑、軟膏?氣霧劑、溶液劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了阿魏酸在制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的作用，阿魏酸是促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物中的活性成分，其用量為0.5%-10%。本發(fā)明在細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠明顯促進(jìn)人表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移，能明顯促進(jìn)小鼠皮膚的傷口愈合時(shí)間和傷口收縮效果。本發(fā)明在皮膚傷口愈合中的應(yīng)用，可以作為添加劑的形式使用，可以制成具有促傷口愈合的霜?jiǎng)?、乳劑、軟膏、氣霧劑、溶液劑、等各類劑型。
文檔編號(hào)A61K31/192GK102342926SQ20111021211
公開日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者劉明耀, 劉連喜, 葉希韻, 李貽娟, 程蔚 申請(qǐng)人:華東師范大學(xué)