專利名稱：一種馬錢子堿免疫納米微粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種馬錢子堿免疫納米微粒，具體地，涉及一種肝癌特異性靶向治療藥物一抗人AFP McAb (即抗人甲胎蛋白單克隆抗體)-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒。
背景技術(shù)：
馬錢子堿(Brucine)是馬錢子主要成分之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下
該馬錢子堿是一種弱堿性生物堿，水溶性差，作為活血通絡(luò)和“以毒攻毒”代表藥物， 對T淋巴細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，對小鼠淋巴細(xì)胞功能有劑量依賴性的功能調(diào)節(jié)作用，具有明顯的抑瘤作用和很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，鄧旭坤等評價馬錢子堿對移植性腫瘤模型荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用和生存時間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬錢子堿在1.61-6.46 mg對實體瘤Ifeps模型小鼠和S180模型小鼠的抑瘤率均不低于30%，馬錢子堿還能提高小鼠的免疫器官的重量及其指數(shù)，但其對腹水瘤模型(EAC、H印s)荷瘤小鼠的生存時間無明顯延長作用，從而證實了馬錢子堿能一定程度地抑制實體瘤模型小鼠體內(nèi)腫瘤生長。短期應(yīng)用對動物的造血、免疫系統(tǒng)以及肝腎沒有明顯的毒性，還能刺激和促進(jìn)造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的功能，恢復(fù)小鼠因接種肝癌Heps瘤株而造成的肝腎功能的損傷，馬錢子堿可能成為新的有發(fā)展前景的抗腫瘤藥物。 已有技術(shù)研究(1)制備馬錢子堿脂質(zhì)體，與馬錢子堿溶液對比，用大白兔進(jìn)行藥代動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，馬錢子堿溶液給藥2小時后血中已經(jīng)測不出Brucine，慢分布半衰期 7. 5分鐘，而將馬錢子堿包封于脂質(zhì)體后，給藥12小時后血中仍然保持一定的濃度分布，消除半衰期比前者延長了 6. 6，但藥物釋放仍然過快，而且肝臟靶向性不強(qiáng)，難以在局部達(dá)到有效的藥物濃度；(2)馬錢子堿及其脂質(zhì)體對小鼠移植性肝癌(Heps)和小鼠移植性實體瘤肉瘤S180細(xì)胞的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但兩者對腹水瘤模型(EAC和H印s)荷瘤小鼠的生存時間無延長作用；(3)馬錢子堿聚乳酸納米粒(Bru-PLA-NPs)靜脈注射給藥用于家兔體內(nèi)的藥動學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單劑量靜脈注射Bru-PLA-NPs (4 mg/ kg)后馬錢子堿在兔體內(nèi)的藥動力學(xué)數(shù)據(jù)符合三室模型，單劑量靜注馬錢子堿溶液G mg/ kg)后符合二室模型，與馬錢子堿溶液相比，Bru-PLA-NPs給藥后，馬錢子堿的消除半衰期(tl/ 2β) 提高6. 6倍；生物利用度提高8. 7倍。與馬錢子堿溶液相比，Bru-PLA-Ws靜脈注射給藥后馬錢子堿在家兔體內(nèi)的藥動學(xué)行為發(fā)生了顯著變化，將馬錢子堿制成納米?？裳娱L藥物在動物體內(nèi)的循環(huán)和作用時間，提高生物利用度；(4)腹腔應(yīng)用馬錢子堿溶液、馬錢子堿普通脂質(zhì)體和馬錢子堿隱形脂質(zhì)體治療移植性肝癌H22小鼠，馬錢子堿劑量均為3. 23mg -kg-1, 連用8d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同劑量的馬錢子堿溶液、馬錢子堿普通脂質(zhì)體、馬錢子堿隱形脂質(zhì)體的抑瘤率分別為28. 64%,57. 96%和71. 36%，馬錢子堿普通脂質(zhì)體和隱形脂質(zhì)體對荷瘤小鼠均無免疫抑制作用，與普通脂質(zhì)體相比，隱形脂質(zhì)體作為馬錢子堿的載體能夠進(jìn)一步增強(qiáng)其抗腫瘤效果。我們近期研究發(fā)現(xiàn)馬錢子堿與馬錢子堿-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物納米微粒顯著抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞從S期進(jìn)入G2、M期，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，而且馬錢子堿納米微粒抑制腫瘤細(xì)胞增殖效果顯著優(yōu)于馬錢子堿單體，馬錢子堿能夠抑制人肝癌 SMMC-7721細(xì)胞的基質(zhì)黏附，隨著藥物劑量的增長，對基質(zhì)黏附抑制作用逐漸增強(qiáng)，馬錢子堿用量為32(^g/ml時觀察細(xì)胞運動遷徙率為17. 46%，侵襲率為2. 52%，與4(^g/ml相比遷徙率和侵襲率均存在顯著差異。表明馬錢子堿能夠有效抑制肝癌細(xì)胞粘附，阻止肝癌細(xì)胞運動和侵襲，為馬錢子堿用于靶向治療肝細(xì)胞肝癌的深入研究奠定了理論基礎(chǔ)。但馬錢子堿是劇毒中藥，其治療量與中毒量非常接近，全身用藥劑量大，毒副作用強(qiáng)。如何進(jìn)一步改善馬錢子堿的靶向性和腫瘤局部藥物聚集、持續(xù)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，降低全身毒副反應(yīng)，是提高馬錢子堿抗肝癌效應(yīng)的關(guān)鍵所在。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝臟腫瘤免疫靶向納米藥物一抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒，用于肝臟腫瘤靶向治療，能增加馬錢子堿在肝癌細(xì)胞聚集，使藥物在局部緩慢釋放，延長藥物對腫瘤細(xì)胞的作用時間，提高局部藥物濃度，使其載藥更加“精確”地積聚在腫瘤組織，極大發(fā)揮馬錢子堿抗腫瘤作用，最大限度地降低馬錢子堿的毒性作用。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供了一種馬錢子堿免疫納米微粒，該馬錢子堿免疫納米微粒是以馬錢子堿為活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作為藥物包被輔料，外鏈接抗人AFP McAb (即抗人甲胎蛋白單克隆抗體)制成的免疫靶向納米微粒。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿納米微粒的粒徑為 274. 5 士64. 3 nm，其 Zeta 電位為-4. 73 士4. 73 mV。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒攜載馬錢子堿含量為5 7%，包封率為70 85%。
上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒攜載馬錢子堿含量 5. 6 士 0. 2%，包封率為 76. 0 士 2.3%。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式為PLA-PEG-CH2-CH2-C00H，其分子量的范圍為40_50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例為1 :1. 5^3的比例共聚形成的。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例為1. 5 2. 5的比例共聚形成的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作為藥物包被輔料。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，馬錢子堿與羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比為1 15 30。
上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，馬錢子堿與羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比為1:20。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，抗人AFP 單克隆抗體的濃度范圍為1(Γ20μβ抗體/mg納米微粒。上述的馬錢子堿免疫納米微粒，其中，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，抗人AFP 單克隆抗體的濃度是抗體/mg納米微粒。
本發(fā)明提供的馬錢子堿免疫納米微粒的制備方法包含以下具體步驟 步驟1，將羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物和馬錢子堿溶解于有機(jī)溶劑中，再與聚乙烯醇水溶液混合形成初乳；
步驟2，除去有機(jī)溶劑，離心除去聚集體，超濾除去游離馬錢子堿，制得納米微粒濃縮
液；
步驟3，加入羧基活化試劑碳二亞胺鹽，使得聚乙二醇羧基與抗人AFP McAb的氨基通過化學(xué)偶聯(lián)鏈接，超濾離心分離得到馬錢子堿免疫納米微粒濃縮液。本發(fā)明提供的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微?？捎糜谥苽淇鼓[瘤免疫靶向藥物，該藥物用于肝癌的治療具有很好的臨床應(yīng)用前景。本發(fā)明利用羧基化的聚乙二醇與聚乳酸形成嵌段共聚物，共聚物末端含有水溶性聚合物聚乙二醇鑲嵌，顯著提高體內(nèi)長循環(huán)時間，避免馬錢子堿免疫納米微粒體內(nèi)釋藥速度過快，難以在局部達(dá)到有效抗癌藥物濃度等缺陷。進(jìn)一步地，利用聚乙二醇外露羧基， 與抗人AFP McAb的氨基通過化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)成功鏈接，顯著提高了抗人AFP McAb與羧基化聚乙二醇/聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒的鏈接效率。本發(fā)明制備的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒，用于肝細(xì)胞癌治療，使其載藥更加“精確”地積聚在腫瘤組織，極大發(fā)揮馬錢子堿抗腫瘤作用，最大限度地降低馬錢子堿的毒性作用。本發(fā)明以馬錢子堿為活性成分，以生物降解材料羧基化聚乙二醇(carboxylation polyethylene glycol，CPEG)和聚乳酸(polylactic acid，PLA)作為藥物輔料，通過化學(xué)改性技術(shù)研制羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物，采用超聲乳化-化學(xué)交聯(lián)法制備工藝技術(shù)，制備馬錢子堿-羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物納米微粒(Brucine /CPEG/ PLA Nanoparticles, BCPNS)，通過化學(xué)偶聯(lián)法將抗人AFP McAb與羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿納米微粒鏈接，成功研制抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒(Anti-hAFP McAb-Brucine /CPEG/PLA Nanoparticles, AHMBCPNS)。粒徑 274. 5 士 64. 3 nm，Zeta 電位為-4. 73 士 4. 73 mV，載藥率5. 6 士 0. 2%，包封率76 士 2. 3%，攜載馬錢子堿濃度為800μ g/ml，抗人AFP McAb在馬錢子堿納米微粒上的濃度是抗體/mg納米微粒。體外藥物釋放結(jié)果馬錢子堿M小時累積釋放超過80%，48 小時釋放完全。本發(fā)明抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒體內(nèi)代謝、組織分布與抗腫瘤作用
大鼠體內(nèi)馬錢子堿在馬錢子堿組、馬錢子堿納米微粒組與馬錢子堿免疫納米微粒組的半衰期(t1/2)分別為6. 98士0.65 h、16. 88士5. 67 h與15. 69士3. 76 h。馬錢子堿納米微粒組與馬錢子堿免疫納米微粒組半衰期明顯長于馬錢子堿組，且兩者在體內(nèi)代謝過程相接近，即初始是一個快速代謝的過程，到后期消除緩慢，表現(xiàn)出明顯的緩釋性。而馬錢子堿體內(nèi)呈現(xiàn)一個快速代謝過程。 給藥3d后馬錢子堿組荷瘤裸鼠體內(nèi)各組織中均未測出馬錢子堿，馬錢子堿納米微粒組在脾、肺、腎、肌肉、肝癌和癌旁肝組織中馬錢子堿濃度分別為341. 00 ng/ mg、9.09 ng/mg、7. 90 ng/ mg、14. 41 ng/ mg、24. 00 ng/ mg 和 246. 50 ng/ mg，其余組織未測出；馬錢子堿免疫納米微粒組僅在脾、肝癌和癌旁肝組織中馬錢子堿濃度分別為341. 50 ng/ mg、 57. 13 ng/ mg和135. 93 ng/ mg。馬錢子堿免疫納米微粒組馬錢子堿在肝癌組織中的藥物濃度高于馬錢子堿納米微粒組，癌旁肝組織中馬錢子堿藥物濃度明顯低于馬錢子堿納米微粒組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(廬445. 85，/X0. 05)。 馬錢子堿免疫納米微粒組給藥7d、14d、21d與30d時抑瘤率分別為36. 73%、 54. 77%,69. 48%,75. 96%,顯著高于其他陽性給藥組。5_Fu(5_氟尿嘧啶)組、馬錢子堿組、馬錢子堿納米微粒組和馬錢子堿免疫納米微粒組荷瘤動物生存期(d)分別為63. 60士 16. 26、 50. 10士 11. 19%,60. 50士 12. 54,81. 50士 14. 25，尤以馬錢子堿免疫納米微粒組生存時間最長，與其他實驗組相比差異顯著(廠=9. 010，P<Q. 05) ；5-Fu組、馬錢子堿組、馬錢子堿納米微粒組和馬錢子堿免疫納米微粒組生命延長率分別為25. 20%、-1. 38%、19. 09%和60. 43%，其中馬錢子堿免疫納米微粒組荷瘤動物生存時間明顯延長。本發(fā)明提供的抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒，具有以下突出的優(yōu)點
1.制備工藝簡便，包封率高，藥物釋放穩(wěn)定，成球性好，所制備的免疫靶向納米藥物微粒在理化性質(zhì)等方面符合腫瘤靶向治療的需要。2.利用羧基化聚乙二醇和聚乳酸的釋藥性質(zhì)，以馬錢子堿、羧基化聚乙二醇和聚乳酸嵌段交聯(lián)為骨架結(jié)構(gòu)制備納米微粒，避免了單獨用聚乙二醇釋藥速度過快，體內(nèi)滯留時間短，難以在腫瘤局部達(dá)到有效抗癌藥物濃度等缺陷。3.成功用羧基化聚乙二醇和聚乳酸形成嵌段共聚物與抗人AFP McAb鏈接，顯著提高了鏈接效率，不僅能夠控制納米藥物在體內(nèi)釋放和降解速度，而且達(dá)到精準(zhǔn)靶向，提高藥物療效，極大降低了馬錢子堿藥物毒性。4.免疫靶向納米藥物材料選擇生物相容性好、可降解的聚合物聚乳酸作為骨架載體，聚合物末端由含有水溶性聚合物PEG鑲嵌，達(dá)到體內(nèi)長循環(huán)的控釋效果。


圖1是羧基化聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物(PLA-PEG-CH2-CH2-C00H) 的1H -NMR測定圖譜。圖加是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒透射電鏡圖，透射電鏡X10，000。圖2b是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒掃描電鏡圖，掃描電鏡X 50，000。圖3是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒粒徑分布圖。圖4是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒體外藥物釋放。圖5是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒靶向性測定。圖6是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒對人肝癌細(xì)胞生長抑制作用。圖7是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒藥代動力學(xué)。圖8是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒在荷瘤裸鼠體內(nèi)組織分布。圖9是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒抗腫
瘤作用。圖10是抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒對荷瘤動物生存期影響。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的具體實施方式
。實施例1
抗人AFP McAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物馬錢子堿免疫納米微粒的制備方法原料配方如下
權(quán)利要求
1.一種馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，該馬錢子堿免疫納米微粒是以馬錢子堿為活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作為藥物包被輔料，外鏈接抗人AFP 單克隆抗體制成的免疫靶向納米微粒。
2.如權(quán)利要求1所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿納米微粒的粒徑為 274. 5士64. 3 nm，其 Zeta 電位為-4. 73士4. 73 mV。
3.如權(quán)利要求1或2所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒攜載馬錢子堿含量為5 7%，包封率為70、5%。
4.如權(quán)利要求3所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒攜載馬錢子堿含量5. 6 士0. ，包封率為76.0 士 2.3%。
5.如權(quán)利要求1或2或4中任意一項所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的通式為PLA-PEG-CH2-CH2-C00H，其分子量的范圍為40-50kD，是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例為1 :1. 5^3的比例共聚形成的。
6.如權(quán)利要求5所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物是羧基化聚乙二醇和聚乳酸以重量比例為1. 5 2. 5的比例共聚形成的。
7.如權(quán)利要求1或2或4或6所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，馬錢子堿與羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比為 1:15 30。
8.如權(quán)利要求7所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，馬錢子堿與羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的重量比為1:20。
9.如權(quán)利要求1或2或4或6或8所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，抗人AFP單克隆抗體的濃度范圍為1(Γ20μβ抗體/mg納米微粒。
10.如權(quán)利要求9所述的馬錢子堿免疫納米微粒，其特征在于，所述的馬錢子堿免疫納米微粒中，抗人AFP單克隆抗體的濃度是抗體/mg納米微粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬錢子堿免疫納米微粒，該馬錢子堿免疫納米微粒是以馬錢子堿為活性成分，以羧基化的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物作為藥物包被輔料，外鏈接抗人AFP單克隆抗體制成的免疫靶向納米微粒。本發(fā)明提供的馬錢子堿免疫納米微粒，制備工藝簡便，包封率高，藥物釋放穩(wěn)定，成球性好，可用于制備抗腫瘤免疫靶向藥物，該藥物能用于抗肝癌治療，通過外周靜脈給藥后，抗人AFPMcAb-聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物納米載體能夠增加馬錢子堿在肝癌細(xì)胞聚集，使藥物在局部緩慢釋放，延長藥物對腫瘤細(xì)胞的作用時間，提高局部藥物濃度，降低馬錢子堿全身毒性；具有精準(zhǔn)靶向腫瘤組織細(xì)胞藥物聚集、藥物釋放穩(wěn)定，抗癌效果好，安全等優(yōu)勢。
文檔編號A61K31/475GK102293749SQ20111021013
公開日2011年12月28日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者張敏, 撒忠秋, 李琦, 楊林, 殷佩浩, 沈鶴柏, 盛霞, 秦建民, 陳慶華, 馬經(jīng)緯, 高科攀, 黃濤 申請人:上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院, 上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 上海師范大學(xué)