專利名稱：一種組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法，尤其涉及一種用生物大分子調(diào)控組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)孔徑的方法，屬生物材料領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
皮膚及骨修復(fù)材料的研制開發(fā)一直是組織工程領(lǐng)域大批科學(xué)工作者努力的方向。 自體移植一直在臨床上占主導(dǎo)地位。但自體骨來源有限，而異體移植又有免疫排斥和感染疾病的危險。人們已經(jīng)開發(fā)各種材料用于皮膚及骨組織工程領(lǐng)域。但是這些材料各有不足， 不能完全達(dá)到臨床上的要求。由于皮膚和骨中的有機成分都主要是由I型膠原構(gòu)成，因此膠原基支架材料便成了研究熱點。但傳統(tǒng)的膠原來源為從鼠尾及牛、馬的肌腱中提取而來， 提取過程不僅破壞了膠原的天然結(jié)構(gòu)，降低了其生物相容性及機械性能，且提取成本高。組織工程支架材料原理提示一個具有和原組織相似的組成和結(jié)構(gòu)的材料將會有更優(yōu)異的生物學(xué)性能。豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)主要由I型膠原構(gòu)成，組成與天然骨及皮膚中有機組成十分相似。它的提取和純化方法較為成熟，美國已有部分產(chǎn)品被FDA認(rèn)證并應(yīng)用于臨床 (Permacol, Covedien) 0而且它在骨組織工程上的研究也開始引起研究學(xué)者們的注意。作為組織工程支架材料，其孔徑尺寸非常重要，它關(guān)系到細(xì)胞的遷移、組織的長入和代謝產(chǎn)物及營養(yǎng)物質(zhì)的運輸。傳統(tǒng)的控制PADM孔形貌及尺寸的方法主要有化學(xué)交聯(lián)劑交聯(lián)法、機械打孔法和激光造孔法。這些方法都在不同程度上對PADM有損傷或改變了其天然的結(jié)構(gòu)，因此，開發(fā)新的、更實用的組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有的PADM孔徑調(diào)控方法中存在的不足，本發(fā)明目的是提出一種用生物大分子調(diào)控組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)孔尺寸的方法。本發(fā)明所述的組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法，是將陰離子生物大分子或陽離子生物大分子加入充分潤濕的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)水溶液(PH = 7)中，通過調(diào)節(jié)膠原的動電電位即zeta電位實現(xiàn)；其特征在于所述陰離子生物大分子為聚天門冬氨酸鈉，所述陽離子生物大分子為水溶性殼聚糖；所述生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比例是1 5 1 25。其中所述聚天門冬氨酸鈉選分子量2000-3500道爾頓，密度1. lg/cm3(20°C )， pH(l% )為4-7的聚天門冬氨酸鈉；所述水溶性殼聚糖選脫乙酰度為85-87%，粘度(1% ) 為30-300mpa. s, pH(l% )為4-7的水溶性殼聚糖。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，進一步具體的實施步驟是(1)稱取一定量豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，然后按豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與超純水為 1 100 1 200的重量比例混合，然后在恒溫?fù)u床中以80-150轉(zhuǎn)/分的速度，將豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架充分潤濕12-24小時；
(2)按生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比為1 5 1 25的比例將陰離子生物大分子或陽離子生物大分子溶于上述含有支架的水中，繼續(xù)在恒溫?fù)u床中以80-150 轉(zhuǎn)/分的速度反應(yīng)12-24小時；(3)取出支架，以去離子水并用速度為80-130轉(zhuǎn)/分鐘的搖床對其洗滌3-5次，每次30-120分鐘；(4)對洗滌后的支架在零下70°C條件下進行冷凍，然后在零下50_60°C下冷凍干燥12-16小時，得孔徑為50-300微米、孔壁厚為5-10微米的片狀或松散膠原束結(jié)構(gòu)的豬脫
細(xì)胞真皮基質(zhì)支架。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法中豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)是采用中國專利031390633所述的方法制備的。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法中所述豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與超純水的重量比優(yōu)選1 120 1 170。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法中所述生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比優(yōu)選1 7 1 15。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法中所述陰離子生物大分子為聚天門冬氨酸鈉，所述陽離子生物大分子為水溶性殼聚糖。上述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法中所述洗滌時的搖床速度優(yōu)選 90-120轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌時間每次為45-90分鐘，此步驟即要保證去除殘留生物大分子，又要防止支架受到機械破壞。本發(fā)明經(jīng)過試驗篩選提出了一種組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法，通過選擇生物相容性好、帶不同電荷的生物大分子(如聚天門冬氨酸鈉或水溶性殼聚糖)來調(diào)節(jié)豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)膠原分子的動電電位，從而調(diào)節(jié)膠原束的收縮、溶脹來達(dá)到控制孔徑的目的，得到具有優(yōu)異結(jié)構(gòu)和組成的皮膚及骨組織用膠原支架，實驗證實 本發(fā)明所述豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架孔徑為50-300微米、孔壁厚為5-10微米的片狀或松散膠原束結(jié)構(gòu)，且所述支架孔徑、孔壁厚利用本方法可調(diào)，使PADM在組織工程上有更廣闊的應(yīng)用前景?？傊?，本發(fā)明的方法不但有效調(diào)節(jié)豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的孔徑尺寸，而且調(diào)整膠原束的結(jié)構(gòu)形貌，得到的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)保持了膠原的天然結(jié)構(gòu)，預(yù)示這類材料將在修復(fù)醫(yī)學(xué)中具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會效益。


圖1殼聚糖調(diào)節(jié)孔徑100-150微米的PADM多孔支架。圖2殼聚糖調(diào)節(jié)孔徑150-300微米的PAMD多孔支架。圖3聚天門冬氨酸鈉調(diào)節(jié)孔徑50-100微米的PADM多孔支架。圖4聚天門冬氨酸鈉調(diào)節(jié)孔徑100-250微米的PADM多孔支架。
具體實施例方式實施例1 孔徑在100-150微米的PADM天然支架的制備。(1)稱取一定量PADM，然后將其浸入其重量120倍的超純水中，在恒溫?fù)u床中以80 轉(zhuǎn)/分的速度，將支架充分潤濕15小時。
(2)準(zhǔn)確稱量其重量7%的殼聚糖溶于含有支架的水中，繼續(xù)在恒溫?fù)u床中以120 轉(zhuǎn)/分的速度，反應(yīng)12小時。(3)取出支架，用去離子水洗滌3次，60分鐘/次，洗滌時搖床速度為80轉(zhuǎn)/分鐘。(4)零下70°C下進行冷凍，最后在零下60°C冷凍干燥16小時。經(jīng)上述步驟后得到的PADM孔徑在100-150微米，孔壁厚為5_10微米纖維束組成的組織工程用PADM。實施例2 孔徑在150-300微米的PADM天然支架的制備。同實施例1，步驟O)中水溶性殼聚糖的質(zhì)量為PADM重量的20% ；步驟(3)中洗滌時間5次。經(jīng)上述步驟后得到的PADM孔徑在150-300微米，孔壁由5_10微米松散膠原片組成的組織工程用PADM。實施例3 孔徑在50-100微米的PADM天然支架的制備。同實施例1，將水溶性殼聚糖改為聚天門冬氨酸鈉；步驟O)中聚天門冬氨酸鈉的質(zhì)量為PADM重量的8% ；經(jīng)上述步驟后得到的PADM孔徑在50-100微米，孔壁由厚為30_50微米的片狀膠原組成的組織工程用PADM支架。實施例4 孔徑在100-250微米的PADM天然支架的制備。同實施例1，將水溶性殼聚糖改為聚天門冬氨酸鈉；步驟O)中聚天門冬氨酸鈉的質(zhì)量為PADM重量的20% ；步驟(3)中洗滌時間5次。經(jīng)上述步驟后得到的PADM孔徑在100-250微米，孔壁為10_30微米松散膠原纖維束組成的組織工程用PADM。
權(quán)利要求
1.一種組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法，是將陰離子生物大分子或陽離子生物大分子加入充分潤濕的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)水溶液中，通過調(diào)節(jié)膠原的動電電位即zeta電位實現(xiàn)；其特征在于所述陰離子生物大分子為聚天門冬氨酸鈉，所述陽離子生物大分子為水溶性殼聚糖；所述生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比例是1 5 1
2.如權(quán)利要求1所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述聚天門冬氨酸鈉選分子量2000-3500道爾頓，密度1. lg/cm3(20°C )，pH(l% )為4-7的聚天門冬氨酸鈉。
3.如權(quán)利要求1所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述水溶性殼聚糖選脫乙酰度為85-87%，粘度(1% )為30-300mpa. s,pH(l% )為4-7的水溶性殼聚糖。
4.如權(quán)利要求1所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其步驟是(1)稱取一定量豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，然后按豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與超純水為1 100 1 200的重量比例混合，然后在恒溫?fù)u床中以80-150轉(zhuǎn)/分的速度，將豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架充分潤濕12- 小時；(2)按生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比為1 5 1 25的比例將陰離子生物大分子或陽離子生物大分子溶于上述含有支架的水中，繼續(xù)在恒溫?fù)u床中以80-150轉(zhuǎn)/ 分的速度反應(yīng)12-24小時；(3)取出支架，以去離子水并用速度為80-130轉(zhuǎn)/分鐘的搖床對其洗滌3-5次，每次 30-120 分鐘；(4)對洗滌后的支架在零下70°C條件下進行冷凍，然后在零下50-60°C下冷凍干燥 12-16小時，得孔徑為50-300微米、孔壁厚為5-10微米的片狀或松散膠原束結(jié)構(gòu)的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架。
5.如權(quán)利要求4所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)與超純水的重量比選1 120 1 170。
6.如權(quán)利要求4所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比為1 7 1 15。
7.如權(quán)利要求4所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述陰離子生物大分子為聚天門冬氨酸鈉，所述陽離子生物大分子為水溶性殼聚糖。
8.如權(quán)利要求4所述組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的調(diào)孔方法，其特征在于所述洗滌時的搖床速度選90-120轉(zhuǎn)/分鐘，洗滌時間每次為45-90分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種組織工程用豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(PADM)的調(diào)孔方法，是將陰離子生物大分子或陽離子生物大分子加入充分潤濕的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)水溶液中，通過調(diào)節(jié)膠原的動電電位即zeta電位實現(xiàn)；其中所述陰離子生物大分子為聚天門冬氨酸鈉，所述陽離子生物大分子為水溶性殼聚糖；所述生物大分子與豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的重量比例是1∶5～1∶25。本發(fā)明的方法不但有效調(diào)節(jié)豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)的孔徑尺寸，而且調(diào)整膠原束的結(jié)構(gòu)形貌，得到的豬脫細(xì)胞真皮基質(zhì)保持了膠原的天然結(jié)構(gòu)，預(yù)示這類材料將在修復(fù)醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A61L27/36GK102258807SQ20111019931
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者任娜, 劉宏, 劉鐸, 李建華, 梁小萌, 江懷東, 王冠聰, 王繼揚, 趙洪石, 陳麗梅, 陶緒堂 申請人:山東大學(xué)