專利名稱：杜仲木脂素在制備防治高血壓腎損害藥物上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中將杜仲木脂素應(yīng)用于制備防治高血壓腎損害的藥物。
背景技術(shù)：
腎臟是是高血壓損害最常累及靶器官。近年來，我國高血壓腎臟疾病患者的數(shù)量呈上升趨勢，高血壓腎臟疾病已成為危害國人健康的重要疾病。因此，防治高血壓腎損害是高血壓病防治的重要目標(biāo)。雖然高血壓是腎臟靶器官損害的始動因素，但高血壓發(fā)生后腎臟靶器官在損傷過程中的自身病理變化仍是有自身的特點的，它主要表現(xiàn)為腎小球硬化及間質(zhì)纖維化，其機制不僅與腎小球基底膜結(jié)構(gòu)損傷、舒血管物質(zhì)/縮血管物質(zhì)比例失衡導(dǎo)致的腎局部缺血缺氧性損傷有關(guān)，還與膠原生成增多、多種炎癥遞質(zhì)表達(dá)引起的腎間質(zhì)炎癥、成纖維細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞增殖有關(guān)。這些病理過程最終將導(dǎo)致高血壓腎纖維化和腎功能衰竭。在這一過程中，腎小球系膜細(xì)胞增殖與III型膠原表達(dá)發(fā)揮了重要的作用，其雖受高血壓因素誘導(dǎo)，但其病理改變趨勢在疾病發(fā)展過程中持續(xù)存在①腎小球系膜細(xì)胞增生是重要的病理形態(tài)學(xué)改變，腎小球系膜細(xì)胞增殖、激活，不斷促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和腎小球硬化的發(fā)生；②III型膠原主要由系膜細(xì)胞合成，持續(xù)在腎小球內(nèi)沉積，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蓄積，最終參與了腎小球硬化的發(fā)病機制。目前，國內(nèi)外廣泛應(yīng)用的第一線抗高血壓藥物包括利尿劑、鈣通道阻滯劑、β受體阻滯劑、ACEI與ARB等五大類藥物。在這些藥物中，僅有ACEI與ARB類藥物被研究證實具有可能的延緩腎臟疾病進(jìn)展的作用，而其他幾大類降壓藥物均無保護(hù)腎臟的功能，長期應(yīng)用利尿劑類藥物還可能加重電解質(zhì)紊亂、對腎臟產(chǎn)生不利影響。因此，尋找和開發(fā)具有保護(hù)腎臟、兼具降壓作用的新型藥物，是防治高血壓腎損害的有效途徑。杜仲(Eucommia ulmoides)，又名思仙、絲棉樹，是我國特有的單種科植物、國家二類珍稀保護(hù)植物，主要分布于甘、陜、豫、鄂、晉、湘、川、滇、黔、桂、閩等省。其皮、莖、葉均可入藥，其傳統(tǒng)藥理作用為“補肝腎、強筋骨、降血壓等”?，F(xiàn)代研究表明，杜仲含有多種活性成分，具有促進(jìn)機體功能、抗衰老、抗癌等效果，尤其是具有對高血壓的“雙向調(diào)節(jié)”作用。在我國，杜仲亦常被單獨或與其他藥物聯(lián)合，用以作為降血壓的藥物。而杜仲木脂素是從杜仲中分離出來的，木脂素化合物已知有觀種，分別屬于雙環(huán)氧木脂素類、單環(huán)氧木脂素類、環(huán)木脂素類、新木脂素類和倍半木脂素類等。PDG標(biāo)準(zhǔn)品常用于杜仲木脂素成分及含量的鑒定。 目前，國內(nèi)外針對杜仲木脂素的藥理作用研究較少。已有研究表明，杜仲木脂素具有較強的降壓作用，可以抗高血壓心血管重塑，并有效防治糖尿病并發(fā)癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種杜仲木脂素的在制備防治高血壓腎損害上的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明將杜仲木脂素用于制備防治高血壓腎損害的藥物，所述的杜仲木脂素是由杜仲提取制備而成。
所述的杜仲木脂素特別適用于制備抑制腎皮質(zhì)中III型膠原表達(dá)和/或腎小球系膜細(xì)胞增殖引起的抗高血壓腎損害的藥物。所述的杜仲木脂素可以以含有杜仲木脂素的杜仲提取物的形式使用，用于制備以上的藥物。發(fā)明人通過研究表明，杜仲木脂素可以較好地改善自發(fā)性高血壓對腎小球、腎小管的損害，抑制腎皮質(zhì)III型膠原表達(dá)和腎小球系膜細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗高血壓腎損害的作用，因而為將杜仲木脂素開發(fā)成一種具有防治高血壓腎損害的新型藥物提供了實驗依據(jù)。本發(fā)明的杜仲木脂素的藥物制劑，是通過將杜仲原料經(jīng)過提取或其他方式加工， 制成藥物活性物質(zhì)單獨作用，或是與其它可配合使用的用于防治高血壓腎損害的活性成分共同作用，需要時加入藥物可接受的載體，按照制劑學(xué)的常規(guī)技術(shù)制成藥物制劑。所述的杜仲木脂素可以以提取物形式作為活性物質(zhì)制成藥物制劑。所述提取物可以是浸膏形式的物質(zhì)，可以是干浸膏也可以是流浸膏，可以是粉末狀物質(zhì)，根據(jù)制劑的不同需要制成不同的形態(tài)。本發(fā)明的杜仲木脂素經(jīng)過加工制備的可制成適合服用的任何單位劑量形式的藥物制劑，這些藥物制劑可以是以下劑型片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、 硬膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑或貼劑；需要時可以制成稀釋制劑、腸溶制劑。本發(fā)明的杜仲木脂素在制備成藥物制劑時可加入藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自抗氧劑、螯合劑表面活性劑填充劑崩解劑潤濕劑分散劑潤滑劑溶劑緩釋材料腸溶材料PH調(diào)節(jié)劑、矯味劑、色素等，常用的載體如甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、氧化鈉、硅衍生物、纖維素及纖維素衍生物、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、聚乙二醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。所述的杜仲木脂素可以通過通過杜仲采用現(xiàn)有的多種提取方案如選自粉碎、壓榨、煅燒、研磨、過篩、滲漉、萃取、水提、醇提、水沉、醇沉、酯提、酮提、層析、過濾等多種方法得到。本發(fā)明杜仲木脂素可以以提取物的形式制備得到，其中優(yōu)選制備方法包括以下步驟1.取中藥杜仲皮，用含水乙醇回流提取，提取液過濾，藥液濃縮；2.將濃縮的藥液通過大孔樹脂柱，依次用水、醇溶液洗脫。3.收集醇洗脫液，洗脫，干燥，得到提取物粉末。本發(fā)明的杜仲木脂素的提取物的較為優(yōu)選制備方法包括以上步驟1.中藥杜仲皮去外皮后，切成小段，用含水乙醇溶液加熱回流提取1-3次，每次 l_2h，提取液減壓濃縮至0. 5-1. 5倍藥材量體積；2.將濃縮的藥液通過大孔吸附樹脂柱進(jìn)行有效成分富集，依次用水，15-25%甲醇或乙醇，45-55%甲醇或乙醇溶液洗脫。3.收集45-55%甲醇或乙醇洗脫液，濃縮，干燥得提取物粉末。另外，收集水洗脫液，濃縮，干燥，粉碎，粉末用甲醇溶解，棄去不溶物，回收甲醇并干燥得環(huán)烯醚萜類部位。
在步驟1中的提取溶劑為含水乙醇，優(yōu)選為40-95%的乙醇。在步驟2中大孔吸附樹脂柱為HP系列、DlOl、AB-8等弱極性樹脂。在步驟3中的濃縮液采用的干燥技術(shù)可以是多種，如真空干燥、噴霧干燥、凍干， 優(yōu)選凍干技術(shù)。


圖1 =PDG的代表性色譜圖。注=PDG樣品保留時間為11. 8min。圖2 杜仲木脂素的代表色譜圖。注檢測峰分離度較好，5. 5mg/mL杜仲木脂素樣品溶液中PDG的質(zhì)量濃度為0. 265mg/mL,經(jīng)計算杜仲木脂素提取物中PDG的含量為4. 8%。圖3 杜仲木脂素對SHR大鼠腎小管損傷的影響。注*表示與正常對照組比較P
<0. 05 ；#表示與陰性對照組比較P < 0. 05。圖4 杜仲木脂素對SHR大鼠腎小球損傷的影響。注*表示與正常對照組比較P
<0. 05 ；#表示與陰性對照組比較P < 0. 05。圖5 杜仲木脂素對SHR大鼠腎皮質(zhì)III型膠原表達(dá)的影響。注*表示與正常對照組比較P < 0. 05 ；#表示與陰性對照組比較P < 0. 05。圖6 杜仲木脂素對Ang II誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞增殖的影響。注*表示與正常對照組比較P < 0. 05 ；#表示與陰性對照組比較P < 0. 05。
具體實施例方式以下實施例旨在說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限定。實施例1杜仲木脂素抗高血壓腎損害的實驗研究樣品來源對由杜仲提取制備的杜仲木脂素樣品的木脂素成分含量鑒定采用的是紫外分光光度法；條件檢測波長277nm ；Icm光徑；對照品松脂醇二糖苷(PDG)。對照品及樣品用 50%甲醇溶解，空白管用50%甲醇。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取5. 68mg PDG,置于25mL容量瓶，用50%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到227yg/mL PDG儲備液，置于4°C冰箱保存。將儲備液用50%甲醇按梯度稀釋成 227、113. 5,56. 75,28. 38、14. 19μ g/mL。樣品溶液的制備精密稱取134. 4mg杜仲木脂素樣品，置于IOmL容量瓶，用50% 甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到13. %ig/mL杜仲木脂素儲備液，然后用50%甲醇稀釋至 60 μ g/mL。紫外測定結(jié)果60. 0μ g/mL的杜仲木脂素樣品，經(jīng)紫外檢測OD值為0. 553，木脂素類成分濃度為54. 7μ g/mL，含量為91. 2%。2.對PDG的含量的鑒定采用的是高效液相色譜法。色譜條件固定相BDSHypersil (18柱 Q50mmX4. 6mm, 10 μ m)；流動相甲醇 水=25 75 ；檢測波長:277nm ；溫度:25°C ；流速1. Oml/min ；進(jìn)樣量5μ 1。標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備精密稱取5. OOmg PDG,置于IOmL容量瓶，加25mL甲醇水= 1 1溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到200μ g/mL PDG儲備液，置于4°C冰箱保存。將儲備液用 50% 甲醇按梯度稀釋成 100、50、25、12. 5,6. 25μ g/mL。樣品溶液的制備精密稱取觀1. 5mg杜仲木脂素樣品，置于25mL容量瓶，用50% 甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，顛倒及震蕩搖勻，得到11. 26mg/mL杜仲木脂素儲備液。取2mL 儲備液于2000ppm離心lOmin，上清液用50%甲醇稀釋至5. 5mg/mL。HPLC測定結(jié)果圖1為PDG的代表性色譜圖，PDG樣品保留時間為11. 8min,圖2 為杜仲木脂素樣品的色譜圖，從中可以看出檢測峰分離度較好，5. 5mg/mL杜仲木脂素樣品溶液中PDG的質(zhì)量濃度為0. ^5mg/mL，經(jīng)計算杜仲木脂素樣品中PDG的含量為4. 8%。1.整體實驗1. 1實驗方法高血壓(SHR)大鼠，及WKY大鼠直接購買。分組8周齡WKY正常大鼠7只作為正常對照，SHR28只隨機分為4組，每組7只 蒸餾水(陰性對照)、卡托普利(IOOmg · kg-1 · cT1)、依帕司他(60mg · kg-1 · cf1)、杜仲木脂素(300mg · kg—1 · cf1)給藥方法灌胃給藥，1天1次，連續(xù)16周。25周齡大鼠尿樣(新鮮、24h)腎功能生化指標(biāo)的測定NAG、ALB、UCR(按照試劑盒說明操作)。NAG酶是反映腎小管功能的指標(biāo)，評價杜仲木脂素對SHR大鼠腎小管功能改變的影響；1 尿液中比值K = ALB/UCR是反映腎小球功能的指標(biāo)，評價杜仲木脂素對SHR大鼠腎小球功能改變的影響。26周齡大鼠腎臟損害指標(biāo)的測定111型膠原。III型膠原是反映腎臟損害嚴(yán)重程度的指標(biāo)；采用天狼星紅染色，檢測皮質(zhì)部細(xì)胞外基質(zhì)主要成分III型膠原的表達(dá)量，以膠原容積分?jǐn)?shù)(％)表示。1. 2實驗結(jié)果1. 2. 1杜仲木脂素對腎功能生化指標(biāo)的影響①SHR組大鼠的NAG酶活性較WKY大鼠(正常組)明顯增加Γ P < 0. 05)；卡托普利、依帕司他可顯著降低NAG酶活性CP < 0. 05)；給予杜仲木脂素可使NAG酶活性較正常對照組降低(#Ρ < 0. 05)。(見圖1)②SHR組大鼠K值較WKY大鼠(正常組)明顯增高Γ P < 0. 05)，卡托普利、依帕司他可顯著降低κ值CP < ο. 05)；給予杜仲木脂素可使κ值較正常對照組降低Cp < ο. 05)。 (見圖2)1. 2. 2杜仲木脂素對腎皮質(zhì)III型膠原表達(dá)的影響SHR組大鼠腎皮質(zhì)微血管外III型膠原表達(dá)較WKY大鼠(正常組)明顯增加(* P < 0.05)；卡托普利、依帕司他可顯著降低III型膠原表達(dá)Cp < ο. 05)；給予杜仲木脂素可使III型膠原表達(dá)較正常對照組降低CP < 0.05)。(見圖3)2.細(xì)胞實驗2. 1實驗方法用Ang II誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞后，給予低、中、高濃度的杜仲木脂素。應(yīng)用 MTT法測定Ang II誘導(dǎo)大鼠腎小球細(xì)胞的增殖情況，在Mh、48h、7a!進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，并以 OD值表示。實驗分為7組(1)正常對照組；(2) AngII模型組(陰性對照組)(10_7mol/L)； (3)AngII(l(Tmol/L) +洛沙坦(lymol/L) ； (4)AngII (l(Tmol/L)+依帕司他(1 μ mol/L)；(5)AngII (KTmol/L)+杜仲木脂素(30mg/L) ； (6)AngII (10_7mOl/L)+杜仲木脂素(60mg/ L) ； (7)AngII(10-7mol/L) +杜仲木脂素(120mg/L)。2. 2實驗結(jié)果與正常對照組比較，Ang II模型組的系膜細(xì)胞增殖呈現(xiàn)顯著增高趨勢ΓΡ <0.05)；洛沙坦、依帕司他在48h、7a!可顯著降低Ang II誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖(#P <0.05)；給予杜仲木脂素可使Ang II誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖在48Κ7 !呈現(xiàn)顯著下降(#P <0.05)。(見圖 4)3.結(jié)論由以上實驗可得出結(jié)論杜仲木脂素具有抑制腎皮質(zhì)中III型膠原表達(dá)和腎小球系膜細(xì)胞增殖的藥理作用，并且可以通過這些作用抗高血壓腎損害。實施例2取杜仲樹皮(去外皮)2Kg，用8L 65%乙醇回流提取兩次，每次lh，過濾，合并兩次提取液濃縮至800ml。用DlOl大孔樹脂拌樣上樣(大孔樹脂柱體積3L)，水洗3倍柱體積，氨水繼續(xù)洗3倍柱體積，再水洗至中性。用20%乙醇洗脫2倍柱體積，用45%乙醇洗2. 5倍柱體積。45%乙醇洗脫液濃縮至600ml。洗脫液濃縮后干燥成粉末。用松脂醇二葡萄糖苷作為對照，提取物經(jīng)紫外檢測木脂素成分含量為85%，經(jīng)HPLC檢測松脂醇二葡萄糖苷含量為12.5% ；將該提取物作為活性成分制備抗高血壓腎損害的藥物。實施例3杜仲樹皮(去外皮)切碎后，用65%的乙醇回流提取lh，過濾，提取液濃縮。經(jīng)過 HPD100大孔樹脂吸附后，水洗3倍柱體積，20%乙醇洗2倍柱體積，45%乙醇洗2倍柱體積， 45%乙醇洗脫液收集并濃縮，凍干，得到提取物粉末。取粉末60g，加入微晶纖維素230g， PVPlOg,混勻，加入乙醇適量制軟材，制粒，烘干，整粒，加少量硬脂酸鎂，壓片，制成1000 片；作為制備抗高血壓腎損害的藥物。
權(quán)利要求
1.杜仲木脂素在制備防治高血壓腎損害藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述的杜仲木脂素是以杜仲為原料提取制備得到，用于制備抗高血壓腎損害的藥物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的杜仲木脂素以含有杜仲木指素的杜仲提取物的形式使用，用于制備抗高血壓腎損害的藥物。
3.杜仲木脂素在制備防治高血壓腎損害藥物上的應(yīng)用，其特征在于所述的杜仲木脂素是以杜仲為原料提取制備而成，用于制備抑制腎皮質(zhì)中III型膠原表達(dá)和/或腎小球系膜細(xì)胞增殖引起的抗高血壓腎損害的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的杜仲木脂素以含有杜仲木指素的杜仲提取物的形式使用，用于制備抗高血壓腎損害的藥物。
全文摘要
杜仲木脂素在制備防治高血壓腎損害藥物上的應(yīng)用，杜仲木脂素是以杜仲為原料提取制備而成，用于制備防治高血壓腎損害的藥物。能較好地改善自發(fā)性高血壓對腎小球、腎小管的損害，具有抑制III型膠原表達(dá)和系膜細(xì)胞增殖的藥理作用，有效地防治高血壓腎損害。
文檔編號A61K36/46GK102225088SQ20111016989
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月22日
發(fā)明者嚴(yán)謹(jǐn), 吳衛(wèi)華, 周應(yīng)軍, 李慧, 李玲, 歐陽冬生, 王俊杰, 王珍珊, 胡凱, 谷娟, 鄧曉蘭 申請人:歐陽冬生