專利名稱:ApoA-Ⅰmilano基因藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種Ap0A- I milano基因藥物。
背景技術(shù):
隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,糖尿病發(fā)生率逐年上升,而冠心病是糖尿病的主要死因,幾乎 90%的糖尿病人死于動(dòng)脈粥樣硬化(尤其是冠脈)并發(fā)癥。已知HDL (高密度脂蛋白)是一種未來心血管事件的逆指標(biāo),提高血漿HDL水平可減輕動(dòng)脈粥樣硬化并逆轉(zhuǎn)病變。ApoA - I是HDL的主要載脂蛋白,HDL的一些功能主要是有ApoA - I執(zhí)行的。在人類中,胰島素抵抗和血液中高密度脂蛋白(HDL)及其主要成分載脂蛋白A(ApoA-I)含量的降低密切相關(guān)。最近研究表明ApoA-I基因敲除小鼠出現(xiàn)了高血糖及高胰島素癥,葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)也顯示ApoA-I基因敲除小鼠葡萄糖代謝受到的損害,出現(xiàn)了 II型糖尿病的早期病癥,ApoA-I通過與脂聯(lián)素受體的胞內(nèi)部分結(jié)合激活A(yù)MPK信號(hào)通路,改善體內(nèi)的血糖平衡,從而在II型糖尿病中發(fā)揮了保護(hù)作用。這一研究結(jié)果提示apoA-I與糖代謝及機(jī)體的胰島素敏感性直接相關(guān),提高機(jī)體中apoA-I的濃度對(duì)于緩解糖尿病的病理生理過程可能具有重要意義。ApoA - I milano是野生型ApoA - I的遺傳突變體,其中第173號(hào)絲氨酸被精氨酸取代,并形成同源二聚體和雜合子二聚體ApoA -II。攜有ApoA - I milano的HDL代謝更快,且研究發(fā)現(xiàn)ApoA - I milano具有抑制主動(dòng)脈粥樣硬化,減少內(nèi)膜增厚等作用,與磷酯結(jié)合可抑制血小板聚集,促進(jìn)纖溶,推遲動(dòng)脈血栓形成等。故ApoA - I milano可能成為非常適合治療糖尿病及其粥樣硬化的藥物。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種ApoA- I milano基因藥物,為治療糖尿病及其粥樣硬化的藥物提供新的藥物。為此,本發(fā)明公開了一種ApoA- I milano基因藥物,其特征在于其包含表達(dá)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒載體。在一實(shí)施例中,所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。在一實(shí)施例中,所述腺病毒載體為pShuttle CMV。本發(fā)明利用腺病毒載體感染效率高,宿主范圍廣及安全性較好等特點(diǎn),構(gòu)建含有 ApoA - I milano基因重組腺病毒載體,可為治療糖尿病及其粥樣硬化的藥物提供新的藥物,具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
圖 1 為 EcoR I 酶切鑒定 pShuttle CMV-A I milano 電泳圖; 圖2為Hind III酶切鑒定pAd CMV-A I milano電泳圖3為Not I和EcoR I酶切鑒定pShuttle CMV-GFP電泳圖;圖4為Hind III酶切鑒定pAd CMV-GFP電泳圖; 圖 5 為人 ApoA - I miIano Western blotting 圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義,文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。實(shí)施例1. ApoA-I miIano質(zhì)粒構(gòu)建
人血總RNA逆轉(zhuǎn)錄,采用RT-PCR擴(kuò)增人載脂蛋白A I (ApoA I) cDNA,測序證實(shí)后用 Stratagene QuikChange 定點(diǎn)突變?cè)噭┖袑?ApoA I-cDNA 突變成 ApoA I milano-cDNA。突變引物序列見下
上游5’ -CTGGGCGAGGAGATGTGCGACCGCGCGCGC-3’ 下游5’ -GCGCGCGCGGTCGCACATCTCCTCGCCCAG-3,
突變后cDNA雙酶切,連入pDNR-LIB-PA,轉(zhuǎn)化大腸桿菌、挑克隆、測序鑒定為 pDNR-LIB-ApoA-I miIano-PA 質(zhì)粒用于后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)施例2.含目的基因pShuttle質(zhì)粒的制備
2.1 含 ApoA - I milano 表達(dá)框的 pShuttle CMV-A I milano 質(zhì)粒的制備 pDNR-LIB-apoA I milano-PA質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Ml I和Hind III雙酶切后,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠回收試劑盒收集純化含ApoA I milano基因的片斷。pSmttle CMV 用限制性內(nèi)切酶Ml I和Hind III進(jìn)行雙酶切,回收質(zhì)粒載體片斷,與ApoA - I milano 片斷進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5ci感受態(tài)大腸桿菌中,轉(zhuǎn)化菌用卡那霉素篩選,并進(jìn)行EcoR I酶切鑒定。對(duì)酶切鑒定正確的菌種進(jìn)行保存,并大量制備pShuttle CMV-A I milano 質(zhì)粒。2. 2含綠色熒光蛋白表達(dá)框pShuttle CMV-GFP質(zhì)粒的制備 pAAV-EFla-GFP-PA質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Kpn I和)(ba I進(jìn)行雙酶切后,純化回收含綠
色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)基因目的片斷。將pShuttle CMV用限制性內(nèi)切酶Kpn I和)(ba I進(jìn)行雙酶切后,純化回收質(zhì)粒載體片段,與GFP片段進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)DH5 α大腸桿菌中,轉(zhuǎn)化菌用卡那霉素篩選單克隆菌落,小量培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶Hind III進(jìn)行酶切鑒定。對(duì)酶切鑒定正確的菌種進(jìn)行保存,并大量制備pShuttle CMV-GFP質(zhì)粒。實(shí)施例3.含目的基因pAd質(zhì)粒的制備
pShuttle 質(zhì)粒(pShuttle CMV-A I milano 和 pShuttle CMV-GFP)經(jīng) Rne I 酶切線性化后和pAdeasy-Ι質(zhì)粒在感受態(tài)BJ5183大腸桿菌中進(jìn)行重組,得到對(duì)應(yīng)的pAd質(zhì)粒(pAd CMV-A I milano和pAd CMV-GFP)0將酶切鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5 α細(xì)菌進(jìn)行大量制備和儲(chǔ)存。實(shí)施例4.含目的基因腺病毒毒種的制備
含目的基因的PAd質(zhì)粒(pAd CMV-A I milano和pAd CMV-GFP)經(jīng)I^ac I酶切線性化后,轉(zhuǎn)染入低代次的HEK293細(xì)胞中,培養(yǎng)8-12天后,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)后收集細(xì)胞及其上清,得到對(duì)應(yīng)含目的基因的腺病毒毒種(AdV-A I miIano和AdV-GFP)。實(shí)施例5.含ApoA I milano基因的腺病毒載體的鑒定
從pDNR-LIB-apoA I milano-PA質(zhì)粒獲得含有載脂蛋白A I milano編碼基因,插入 pSiuttle CMV 穿梭質(zhì)粒,獲得 pSiuttle CMV- A I milano。該質(zhì)粒與 pAdeasy-1 質(zhì)粒重組得到pAd CMV-A I milano。利用質(zhì)粒序列作圖,構(gòu)建的pShuttle CMV- A I milano 經(jīng)EcoR I酶切后獲得4921bp和;3486bp兩個(gè)目的片斷段(圖1中1為EcoR I酶切 pShuttIeCMV-A I milano ;2 為 DNA marker), pAd CMV- A I milano 酶切后獲得 8010bp、 5913bp、5322bp、4597bp、3010bp、2985bp、2945bp、2081bp 和 75bp 目的片段(圖 2 中 1 為 Hind III 酶切 pAd CMV-A I milano ;2 為 DNA marker)。實(shí)施例6.含綠色熒光蛋白基因的腺病毒載體的鑒定
從pAAV-EFla-GFP-PA質(zhì)粒獲得含有GFP編碼基因,插入pShuttle CMV穿梭質(zhì)粒,獲得 pShuttle CMV-GFP,該質(zhì)粒與pAdeasy-Ι質(zhì)粒重組得到pAd CMV-GFP。利用質(zhì)粒序列作圖, pShuttle CMV-GFP酶切后獲得1864bp和747bp兩個(gè)目的片段,pAd CMV-GFP酶切后獲得 8010bp、5322bp、4932bp、4597bp、3010bp、2980bp、2945bp、2081bp 和 1964bp 目的片段(圖 3 中 1 為 Not I 禾口 EcoR I 雙酶切 pShuttle CMV-GFP ;2 為 DNA marker、圖 4 中 1 為 Hind III 酶切鑒定 pAd CMV-GFP ;2 為 DNA marker)。實(shí)施例7.重組病毒的鑒定
構(gòu)建成功的重組病毒質(zhì)粒pAd CMV- A I milano和pAd CMV-GFP分別用I^ac I酶切水解,得到線性化雙鏈核酸,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞即可包裝成為腺病毒AdV-A I milano和 AdV-GFP0轉(zhuǎn)染成功的HEK293細(xì)胞可出現(xiàn)CPE,證明病毒已在細(xì)胞內(nèi)包裝成功。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后,收集病毒裂解液離心獲得純化的重組腺病毒。將純化后腺病毒AdV-A I病毒注入小鼠體內(nèi)1天后,通過Western blotting監(jiān)測在血清中能檢測到人載脂蛋白A I milano (圖 5中1為空載病毒質(zhì)粒;2為ApoA - I milano腺病毒)。本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制,所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子,本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上,除了本文所述的內(nèi)容外,本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種ApoA- I milano基因藥物,其特征在于其包含表達(dá)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ApoA-I milano基因藥物,其特征在于所述核苷酸序列如 SEQ ID NO. 2 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ApoA-I milano基因藥物,其特征在于所述腺病毒載體為 pAd CMV0
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種ApoA-Ⅰmilano基因藥物。本發(fā)明公開了一種ApoA-Ⅰmilano基因藥物,其特征在于其包含表達(dá)如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列的腺病毒載體。本發(fā)明利用腺病毒載體感染效率高,宿主范圍廣及安全性較好等特點(diǎn),構(gòu)建含有ApoA-Ⅰmilano基因重組腺病毒載體,可為治療糖尿病及其粥樣硬化的藥物提供新的藥物,具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102240405SQ201110118669
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月9日
發(fā)明者吳新天, 崔世濤, 莊育剛, 張慧君, 彭文輝, 彭滬, 曹佳, 王明松 申請(qǐng)人:上海市第十人民醫(yī)院