專利名稱：合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位提取工藝路線的優(yōu)化及中試放大的制作方法
合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位提取工藝路線的優(yōu)化及中
試放大
技術(shù)領(lǐng) 域通過利用乙醇加熱同流、水飽和正丁醇萃取從合歡皮中得到抗腫瘤新生血管有效部位。本發(fā)明涉及從中藥合歡皮中提取抗腫瘤新生血管有效組分、優(yōu)化最佳工藝路線以及中試放大。以正丁醇萃取后的干粉量和總皂苷含量為指標，采用L9(34)正交試驗，考察溶媒濃度、提取時間、提取次數(shù)和萃取次數(shù)因素對提取效率的影響，從而確定合歡皮中抗腫瘤新生血管有效組分最佳提取的工藝條件，并且將所得的工藝參數(shù)進行工藝放大實驗。
背景技術(shù)：
中藥回流提取法是根據(jù)中藥中有效成分溶于特定的溶媒，通過選擇溶媒將其提取出來。這種方法已越來越多地被運用到中藥提取中?；亓魈崛】梢詫⒅兴幹械挠行С煞趾芎玫靥崛〕鰜?，又可以盡量避免部分雜質(zhì)的溶出。通過選擇不同溶劑可以針對性的提取出所需組分，或者改變?nèi)軇┑臐舛雀嗟奶崛〕鲇行С煞?，減少雜質(zhì)的溶出。采用乙醇回流提取時，可以減少溶劑的添加量，也可以回收乙醇，減少成本。萃取是利用化合物在兩種互不相溶(或微溶)的溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從一種溶劑內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種溶劑中。經(jīng)過反復(fù)多次萃取，將絕大部分的化合物提取出來。利用萃取技術(shù)我們可以將中藥中的有效組分從雜志中分離出來，達到純化的目的。正交試驗設(shè)計(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點進行試驗，這些有代表性的點具備了“均勻分散，齊整可比”的特點，正交試驗設(shè)計是分式析因設(shè)計的主要方法。 是一種高效率、快速、經(jīng)濟的實驗設(shè)計方法，正交實驗設(shè)計在很多領(lǐng)域的研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。本研究采用了四因素三水平的正交實驗，以正丁醇萃取后的干粉量和合歡皮中有效組分總皂苷含量為考察指標，確定最優(yōu)的提取工藝路線，確定最佳的工藝參數(shù)。中藥、天然藥物的中試研究是指在實驗室完成系列工藝研究后，采用與生產(chǎn)基本相符的條件進行工藝放大研究的過程。中試研究是對實驗室工藝合理性的驗證與完善，是保證工藝達到生產(chǎn)穩(wěn)定性、可操作性的必經(jīng)環(huán)節(jié)，是藥物研究工作的重要內(nèi)容之一，直接關(guān)系到藥品的安全、有效和質(zhì)量可控[1、國家品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物中試研究的技術(shù)指導(dǎo)原則，2005]。確定工藝路線后，每步化學(xué)合成反應(yīng)或生物合成反應(yīng)不會因小試、中試放大和大型生產(chǎn)條件不同而有明顯變化，但各步最佳工藝條件，則隨試驗規(guī)模和設(shè)備等外部條件的不同而有可能需要調(diào)整。合歡皮是中國藥典一部收錄的一味常用中藥，為豆科植物合歡Albizia julibrissin Durazz.的干燥樹皮，具有解郁安神，活血消腫的功能，用于心神不安，憂郁失眠，肺癰瘡腫，跌撲傷痛等癥[2、國家藥典委員會.中國藥典第一部，中國醫(yī)藥科技出版社，北京，PP34.]。合歡屬植物樹皮、莖皮、葉、花、種子的主要的化學(xué)成分有三萜及其苷類化合物、黃酮及其苷類化合物、生物堿、有機酸、留醇類化合物、木脂素、鞣質(zhì)及揮發(fā)性成分等。在前期的實驗研究中，我們發(fā)現(xiàn)乙醇回流提取，正丁醇萃取得到的組分具有高效低毒的抑制血管的活性，并在進一步的實驗中表明了該組分對HMEC-I細胞的IC50為4. 18ug/ml, LDH濃度為40ug/ml [3、劉玲燕，杜芳芳，馮磊，邱麗穎.合歡皮不同提取組分對HEMC細胞和 3B11細胞的作用研究[J].時珍國醫(yī)國藥.2011,22(3)]。在此基礎(chǔ)上我們對此工藝進行了改進，以正丁醇萃取所得組分后的干粉量和總皂苷含量，采用L9(34)正交試驗，考察溶媒濃度、提取時間、提取次數(shù)和萃取次數(shù)因素對提取效率的影響，從而確定合歡皮中抗腫瘤新生血管有效組分最佳提取的工藝條件。為了驗證工藝的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，我們又做了三次實驗，每次取IOOg原料，按照最佳工藝路線操作，對正丁醇萃取部分進行稱量并進行總皂苷含量測定，同時對正丁醇萃取相進行活性檢測。結(jié)果表明了最佳工藝路線穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，且提取的有效組分具有很高的活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是選擇一條最佳的合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位提取工藝路線， 得到一系列的實驗參數(shù)，并根據(jù)所得參數(shù)，進行中試放大。本發(fā)明的技術(shù)方案所述合歡皮抗腫瘤新生血管有效組分提取方法，取合歡皮，粉碎，加乙醇溶液，加熱回流，冷卻過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復(fù)溶，真空干燥，得干粉，加水溶解，等體積水飽和正丁醇萃取，旋干，加水復(fù)溶，真空干燥，萃取干粉。所述正交實驗因素和水平的選擇，考察溶媒濃度、提取次數(shù)、提取時間、萃取次數(shù)四個因素，每個因素選擇三個水平進行L9 (34)正交實驗。所述的最佳工藝路線，將所得9份樣品進行稱量和含量測定，并對結(jié)果進行方差分析，確定最佳的一條工藝路線。所述中試放大，按照實驗室所得工藝參數(shù)，進行中試放大，并且隨外部條件的不同而做一些相應(yīng)的調(diào)整，最終得出中試放大后一些結(jié)果。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以正丁醇萃取得到的干粉量和抗腫瘤新生血管有效組分中總皂苷的含量為指標，通過正交試驗篩選一條最佳的合歡皮中抗腫瘤新生血管有效組分提取工藝路線， 并在所得的一系列工藝參數(shù)的基礎(chǔ)上，進行中試放大，同時隨外部條件的不同而做一些相應(yīng)的調(diào)整，從而為正式生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)。
具體實施例方式實施例1 合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位的提取工藝50g合歡皮用500mL70%乙醇回流兩次，每次lh，冷卻后，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，去離子水復(fù)溶，真空干燥，得干粉，加水溶解，等體積水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇相。 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加水復(fù)溶，真空干燥，得干粉，備用。實施例2 合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位中總皂苷含量的測定取上述制得干粉樣品0. 2g于IOOmL圓底燒瓶中，加30mL 3mol/L硫酸，85°C水浴加熱4h，過濾，將沉淀水洗至中性，再于烘箱中80°C烘干。用50mL石油醚回流提取3次，每次提取池，合并回流液，旋干，加甲醇溶解旋干，最后用甲醇定容至10mL，用HPLC進行檢測，得出抗腫瘤新生血管有效組分中總皂苷含量。 在最佳提取工藝路線的基礎(chǔ)上做三批驗證實驗，并進行皂苷含量測定，三批次的含量為
權(quán)利要求
1.權(quán)利要求利用以乙醇回流、正丁醇萃取所得組分的干粉量和總皂苷含量為指標，通過正交試驗，篩選合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位的最佳的提取工藝路線。
2.權(quán)利要求權(quán)利要求1中得到的抗腫瘤新生血管有效部位最佳工藝路線為通過70% 濃度乙醇回流2次每次1小時、等體積水飽和正丁醇萃取。
3.權(quán)利要求以權(quán)利要求2獲得的最佳提取工藝路線及工藝參數(shù)為基礎(chǔ)，確定投藥量為 Mkg，進行工藝路線的中試放大，并測定所得抗腫瘤新生血管有效部位干物質(zhì)得率、總皂苷含量及活性穩(wěn)定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的提取工藝及工藝參數(shù)的改進和變動都屬于本權(quán)利要求范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1工藝路線所提取的有效組分用于其它與血管生成有關(guān)的疾病預(yù)防和治療，制成不同形成的產(chǎn)品都屬于本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求5的特征是所用于的疾病有癌癥和/或癌癥轉(zhuǎn)移，血管瘤，血管纖維瘤，新生血管性青光眼，糖尿病視網(wǎng)膜病變，早熟視網(wǎng)膜病及視網(wǎng)膜靜脈閉塞，視網(wǎng)膜變性，晶體后纖維組織增生，顆粒性結(jié)膜炎，血管生成引起的角膜疾病，更年期黃斑和黃斑變性，牛皮癬，老年盤狀斑變性及風濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病，毛細管擴張，膿性肉芽腫，傷口愈合中抑制斑痕形成，動脈粥樣硬化，脂溢性皮炎和痤瘡。其產(chǎn)品形式包括藥物制劑，營養(yǎng)品，保健品，化妝品。
全文摘要
本發(fā)明涉及合歡皮中抗腫瘤新生血管的有效部位的提取工藝，并通過L9(34)正交試驗，以抗腫瘤新生血管有效部位干粉量，總皂苷含量為指標，選擇一條最佳的工藝提取路線。最佳工藝路線為70％乙醇加熱回流提取2次，每次1小時，水飽和正丁醇萃取4次，得到合歡皮抗腫瘤新生血管有效部位。然后以此工藝路線為基礎(chǔ)，進行三批中試放大實驗，計算三批產(chǎn)物的干粉量，總皂苷含量，并做細胞活性檢測，結(jié)果顯示放大實驗重現(xiàn)性好，工藝穩(wěn)定，抗腫瘤新生血管有效組分活性穩(wěn)定。
文檔編號A61P27/06GK102178723SQ20111011604
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月6日
發(fā)明者馮磊, 施建軍, 邱麗穎, 金堅, 齊保華 申請人:江南大學(xué)