專利名稱：一種siRNA序列化學(xué)修飾的方法、產(chǎn)品及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種siRNA序列修飾的方法，特別涉及一種通過(guò)引入異核苷酸對(duì)其進(jìn)行化學(xué)修飾的方法，產(chǎn)品及其在疾病治療特別是腫瘤治療中的應(yīng)用，特別是通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的siRNA及其在黑色素瘤治療方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑色素瘤是一種常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤，其發(fā)病率比較低，一般為全部惡性腫瘤的1%~3%,但惡性度高，是一種臨床治療上頗為棘手的惡性腫瘤黑色素瘤，大多源于皮膚，也可以是眼和鼻腔等處。黑色素瘤病人的早期治療效果佳，如果瘤直徑< 2_時(shí)被診斷出，手術(shù)治愈率可達(dá)到90%。但是它生長(zhǎng)迅速，早期篩查效果確實(shí)率差，并且早期病發(fā)就會(huì)發(fā)生肝臟、肺、骨和腦等部位的轉(zhuǎn)移，惡化快速。目前惡性黑色素瘤的治愈率極低，五年的存活率 低于5%，大多病人會(huì)在診斷數(shù)月后死亡。各種常規(guī)的癌癥治療方法(如手術(shù)、放療、化療以及生物療法等)都無(wú)多大明顯的效果。其中，化學(xué)治療是惡性腫瘤綜合治療中必不可缺少的重要手段。但是惡性黑色素瘤對(duì)各種化學(xué)治療藥物不敏感，而且通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性。一些常規(guī)有效的化療藥物，如烷化劑類達(dá)卡巴嗪(DTIC)、替莫唑胺(TMZ);鉬類順鉬(DDP)、卡鉬；亞硝基類卡莫司汀、洛莫司??；微管蛋白抑制劑長(zhǎng)春堿類、紫杉醇類藥物等，無(wú)論是單藥治療還是聯(lián)合化療對(duì)提高腫瘤緩解以及延長(zhǎng)生存都沒(méi)有顯著的療效。白細(xì)胞介素2(InterleUkine-2)對(duì)惡性黑色素瘤病人有一定的療效，但是毒性大、費(fèi)用高，應(yīng)用受到限制。目前對(duì)于轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤的治療還沒(méi)有建立標(biāo)準(zhǔn)的治療手段，仍然是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題，迫切需要研發(fā)新的化療藥物、靶向藥物和其他治療手段。同其他腫瘤一樣，黑色素瘤的發(fā)生是環(huán)境因素(日光暴曬等)與遺傳基因相互作用的結(jié)果，這些因素相互關(guān)聯(lián)決定了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程。普遍適用的Clark模型將黑色素瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程分為良性痣、構(gòu)建不良痣、放射生長(zhǎng)期、垂直生長(zhǎng)期、和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤等5步。在各個(gè)惡性轉(zhuǎn)化階段，都出現(xiàn)了多種癌基因、抑癌基因、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、凋亡調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞黏附分子、生長(zhǎng)因子的異常變化，例如RAS、RAF、⑶K、p53、AKT、MITF,av^3> EGF、VEGF等等。這些變異的基因和蛋白可能成為黑色素瘤惡性化程度的指標(biāo)，更可能逐漸成為不同階段腫瘤進(jìn)行有效治療的藥物靶標(biāo)。從分子機(jī)制角度研究這些變化基因和蛋白對(duì)黑色素瘤細(xì)胞組織的惡性化程度和轉(zhuǎn)移率的影響，為揭示黑色素瘤潛在生物學(xué)病因，有效地進(jìn)行疾病治療，提供理論基礎(chǔ)。其中G蛋白R(shí)AS和RAF絲/蘇氨酸蛋白激酶是ERK (extracellularsignal-regulated kinase :細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中重要的成員，由于RAS和BRAF激酶的變異造成腫瘤細(xì)胞中ERK通道被異常激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖、存活、遷移和侵襲。但是大于90%的惡性黑色素瘤組織中發(fā)現(xiàn)N-RAS(RAS的一類亞型，占15% )或BRAF (RAF的一類亞型，占60-80% )的變異，導(dǎo)致ERK信號(hào)通路異常無(wú)控激活，是造成黑色素瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖和快速遷移的重要原因之一。ERK信號(hào)通道是被最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路。正常情況下，只有當(dāng)細(xì)胞膜受體與胞外配體(生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞黏附分子等)配位結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)膜的G蛋白R(shí)a s才會(huì)交換結(jié)合GTP被激活，經(jīng)過(guò)RAF、MEK1/2、和ERK1/2等激酶的逐級(jí)磷酸化激活，最后活化的ERK1/2蛋白激酶跨膜進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控例如細(xì)胞增殖、存活、遷移、惡化、以及血管生成等一系列的細(xì)胞生命過(guò)程。ERK通道是正常細(xì)胞維持其正常生命過(guò)程重要的必不可少的信號(hào)通道，但是通道的異常激活(配體非依賴性)也是導(dǎo)致細(xì)胞癌變的主要原因之一(占30%的人類腫瘤)。除黑色素瘤外，原發(fā)性肝腫瘤、結(jié)腸腫瘤、黑色素瘤、甲狀腺腫瘤、肺腫瘤、卵巢癌等，特別是侵襲、轉(zhuǎn)移、惡性腫瘤組織中均檢測(cè)到ERK信號(hào)通道的過(guò)度活化(圖I)。ERK通道上下游各種激酶一直是腫瘤靶向藥物設(shè)計(jì)的重要靶標(biāo)，特別是黑色素瘤的藥物設(shè)計(jì)。針對(duì)ERK信號(hào)傳導(dǎo)通道的小分子藥物，一直是黑色素瘤藥物研發(fā)的重點(diǎn)。臨床研究結(jié)果顯示，靶向突變N-RAS、MEK1/2同源蛋白的小分子藥物能有效抑制黑色素瘤進(jìn)程，卻有較大的毒副作用。60-80%黑色素瘤發(fā)現(xiàn)BRAF激酶600位的突變，BRAFvkicie是重要的藥物靶標(biāo)。目前最為有效的臨床研發(fā)藥物PLX4032選擇性抑制BRAFv6cicie的活性是天然蛋白激酶的3倍。2010年的III期臨床實(shí)驗(yàn)顯示此藥物對(duì)惡性黑色素瘤有非常好的療效，能夠抑 制大約80%的ERK通道活性，但同時(shí)也存在激活通道的藥物危害。靶向ERK通道的小分子藥物對(duì)惡性黑色素瘤的增殖抑制效果顯著，這足以證明突變NRAS、BRAF，和MEK1/2等靶標(biāo)對(duì)于抑制黑色素瘤的有效性。它們的毒性是由于對(duì)通道靶標(biāo)的專一丨I"生識(shí)別差造成的。RNA干擾(RNA interference,簡(jiǎn)稱RNAi)技術(shù)高選擇性地降解靶mRNA，沉默相應(yīng)蛋白的表達(dá)，已經(jīng)被普遍用于基因和蛋白功能的研究以及疾病的診斷治療研究。隨著RNA干擾技術(shù)的成熟發(fā)展，將siRNA技術(shù)運(yùn)用于腫瘤治療，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，最終達(dá)到治療腫瘤的目的己經(jīng)成為可能。siRNA干擾技術(shù)應(yīng)用于腫瘤治療與以前的腫瘤基因治療方法相比較，具有以下幾個(gè)獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)①特異性較高，siRNA引起的是轉(zhuǎn)錄后的特異的基因沉默，因而避免了其對(duì)機(jī)體正常系統(tǒng)的干擾。②高效率，RNA干擾抑制基因表達(dá)的效果與其它基因治療方法相比效果顯著，因此siRNA是一種極其有潛力的腫瘤治療策略。但是天然結(jié)構(gòu)的siRNAs不能夠完全滿足作為基因藥物的需要，必要的化學(xué)修飾能夠改善其體內(nèi)穩(wěn)定性、透膜性、生物利用度等特性，提高其沉默效應(yīng)。盡管siRNA體內(nèi)穩(wěn)定性差，但由于黑色素瘤屬于表皮腫瘤，獨(dú)立肢體灌注是主要的給藥途徑，可以有效避免siRNA的弱點(diǎn)，因此將siRNA作為黑色素瘤的治療工具是有價(jià)值的。在第一階段的研究過(guò)程中，我們采用特異性針對(duì)MEKl基因的siRNA阻斷其功能，考察MEKl基因被沉默后下游ERK蛋白及pERK蛋白的表達(dá)情況，從而確證了 MEKl基因在黑色素瘤細(xì)胞增殖中的重要作用。修飾的特異序列(SiMEKl)可能在制備有效的治療黑色素瘤的基因藥物中得到應(yīng)用。但是siRNA作用的分子生物學(xué)機(jī)制比較復(fù)雜，化學(xué)修飾在改善其理化性質(zhì)及生物活性方面的作用需要做進(jìn)一步的探討。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服天然的SiRNA在血清中穩(wěn)定性較差及非特異性的沉默活性作用(脫靶效應(yīng))，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用異核苷對(duì)siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性及降低脫靶效應(yīng)的方法。其特征在于在欲修飾的siRNA序列中摻入化學(xué)式(I)及(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，
權(quán)利要求
1.一種siRNA序列化學(xué)修飾的方法，其特征在于在欲修飾的siRNA序列的合成中摻入化學(xué)式(I)及(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，
2.如權(quán)利要求I所述的siRNA序列化學(xué)修飾的方法，其特征在于使用固相合成，采用亞磷酰胺法，在DNA合成儀上，將一個(gè)或幾個(gè)權(quán)利要求I所述的異核苷亞磷酰胺單體摻入到所合成的序列中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征在于偶聯(lián)一個(gè)核苷為一個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括四個(gè)反應(yīng)脫DMT、偶聯(lián)、封閉、氧化。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的合成方法，其特征在于在摻入位使用異核苷亞磷酰胺單體代替天然核苷亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的合成方法，其特征在于合成寡核苷酸鏈的條件是采用增加異核苷亞磷?；瘑误w的進(jìn)樣次數(shù)至3次；每次進(jìn)樣后的偶聯(lián)時(shí)間為300秒/次；合成siRNA的條件是每個(gè)循環(huán)偶聯(lián)時(shí)間增加至45分鐘，900秒/次X 3次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的化學(xué)修飾的方法所合成的siRNA在制備疾病治療藥物方面的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法合成針對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞中MEK-I基因的異核苷摻入的siRNA序列，修飾前的siRNA序列為 正義鏈5’ -GCAACUCAUGGUUCAUGCUdtdt-3’ 反義鏈3，_dtdtCGUUGAGUACCAAGUACGA-5’。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的siRNA序列，其特征在于合成時(shí)，在siRNA序列的正義鏈的I位、8位、9位、11位或12位其中一位或者多位上摻入化學(xué)式(I)或(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，代替天然核苷亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的siRNA序列，其特征在于在合成時(shí)，在siRNA序列的正義鏈的8位上摻入化學(xué)式(I)或(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，代替天然核苷亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的siRNA序列，其特征在于合成時(shí)，在siRNA序列的正義鏈的8位上摻入化學(xué)式(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，代替天然核苷亞磷酰胺單體在相應(yīng)位置進(jìn)行偶聯(lián)。
11.根據(jù)權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)所述的siRNA序列在制備治療人黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種siRNA序列化學(xué)修飾的方法，還涉及該合成的siRNA序列及其在制備治療疾病特別是黑色素瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的合成方法，其特征在于在siRNA序列合成過(guò)程中摻入了化學(xué)式(I)及(II)所示的異核苷亞磷酰胺單體，從而得到一種異核苷修飾的siRNA，其具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、合成效率高等特點(diǎn)，具有比天然siRNA更好的生物活性。通過(guò)該方法修飾的人黑色素瘤細(xì)胞MEK-1基因的siRNA序列，相較天然未修飾的siRNA序列，具有更好的穩(wěn)定性及沉默活性，具有潛在的制備特異性治療黑色素瘤藥物的開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102757961SQ20111010526
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月26日
發(fā)明者張 浩, 張禮和, 楊振軍, 武蕓, 郭羽佳, 陳卓 申請(qǐng)人:北京大學(xué)