專利名稱：一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種給藥系統(tǒng)，尤其是涉及一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)。本發(fā)明同時還涉及上述呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法。
背景技術(shù)：
RNA干擾(interfering RNAs, RNAi)是基因治療研究最具應(yīng)用前景的一個領(lǐng)域。 就生物普遍規(guī)律而言，RNAi可使任何一種基因沉默，同時，由于RNAi介導(dǎo)基因沉默的高特異、高效和簡易性，在一些由病原體入侵如病毒感染或基因突變引起的疾病治療方面具有顯見的臨床應(yīng)用前景。已有研究表明，用SARS冠狀病毒某些結(jié)構(gòu)蛋白基因的siRNA，可抑制感染SARS冠狀病毒恒河猴肺內(nèi)的病毒復(fù)制。另外，利用siRNA特異地抑制癌基因、癌相關(guān)基因或突變基因的過度表達(dá)，使這些基因保持在靜寂或休眠狀態(tài)，有望達(dá)到抗腫瘤作用。RNA 干擾也能應(yīng)用于氣道炎癥性疾病的治療，Shao等研究表明，用siRNA特異性抑制人氣道上皮胞1-!1292中的16 (1可以導(dǎo)致GFR表達(dá)的降低并減少氣道上皮黏液的分泌(ShaoMX， NakanagaT,NadelJA. Cigarette smoke induces MUC5ACmucin overproduction via tumor necrosis factor-α -converting enzyme in human airwayepithelial(NCI-H292)cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004, 287 (2) :L420_L427)。然而，siRNA 在體內(nèi)易被核酸酶降解，因而它的穩(wěn)定性差、且半衰期短、缺乏靶向性，需要結(jié)合載體系統(tǒng)進(jìn)行基因的遞送。目前常用的基因遞送方法主要分為兩類，即病毒載體和非病毒載體導(dǎo)入技術(shù)，其中，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，是目前體內(nèi)基因治療的主要工具。然而，盡管病毒載體具有很高的轉(zhuǎn)染效率，但其存在免疫原性和潛在致瘤性等安全性隱患。非病毒載體主要有脂質(zhì)體、陽離子高聚物等，但非病毒基因載體因缺少病毒載體天然的基因遞送機(jī)制，轉(zhuǎn)染效率低下，極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，如何將siRNA安全有效運(yùn)送到病變靶器官，進(jìn)入靶細(xì)胞充分有效發(fā)揮RNA干擾作用，成為目前臨床應(yīng)用siRNA治療的瓶頸問題。殼聚糖是近年來發(fā)展起來的一種新型非病毒基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，也是唯一的一種天然陽離子多糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，安全性好。然而，同其他非病毒載體一樣，殼聚糖自身跨越細(xì)胞膜屏障能力較低，需要對其進(jìn)行修飾，以提高其跨膜能力。細(xì)胞穿膜肽(cell penetrating ρ印tide，CPP)是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，具有穿膜能力的短肽。Wender等發(fā)現(xiàn)，精氨酸在細(xì)胞穿膜肽的跨膜中起到關(guān)鍵的作用，其特征基團(tuán)胍基是促進(jìn)跨膜的核心因素(Wender P. A, Mitchell D. J, Pattabiraman K, et al. Thedesign, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake peptoid moleculartransporters, Proc.Natl. Acad. Sci. USA,2000,97 13000-13008)。 * 發(fā)明發(fā)明人前期已成功合成了胍基化殼聚糖，且證實(shí)該修飾方法能明顯提高天然殼聚糖體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA核酸的能力。胍基修飾簡單無毒，經(jīng)胍基修飾后的殼聚糖生理PH環(huán)境下能充分溶解。為了進(jìn)一步提高胍基化殼聚糖向細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)核酸物質(zhì)的能力，依據(jù)配體與受體相結(jié)合的原理，發(fā)明人的中國專利申請CN 101781373A中公開了一種沙丁胺醇接枝胍基化殼聚糖及其制備方法，是將臨床藥用β 2腎上腺受體激動劑沙丁胺醇(氣道解痙抗炎制劑)接枝到胍基化殼聚糖分子上構(gòu)成沙丁胺醇接枝胍基化殼聚糖，并通過體外細(xì)胞研究證實(shí)該載體能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染效率。但是由于人體或動物體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，因此僅在體外直接轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞證明該載體有較好的基因轉(zhuǎn)染效率，并不意味著體內(nèi)應(yīng)用的可行性。載體粒徑是基因微粒分散遞送系統(tǒng)的重要參數(shù)，它的大小與物理特點(diǎn)除了會影響載體微粒在靶細(xì)胞表面的吸附和攝取以外，還會影響在細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物從內(nèi)涵體成功逃逸、 核酸物質(zhì)的釋放等過程。而納米粒徑的均勻度是納米載體的另一個重要參數(shù)，粒徑的分布寬，表示在任一局部范圍內(nèi)分布的納米粒均較少，所以無論最適粒徑是多少，即使該納米載體的最適轉(zhuǎn)染粒徑接近平均粒徑，但因在平均粒徑附近的納米粒的比例小，大部分顆粒的粒徑遠(yuǎn)離平均粒徑，或者太大，或者太少，所以能有效對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染的載體比例并不多。 從圖9的a中可見，先前的沙丁胺醇胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)的粒徑大小分布不均勻，且Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質(zhì)復(fù)合后的粒徑較小，約在20 60nm范圍之間，粒徑分布離散度大，說明有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染的最適合粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例少(圖 10)。而如何實(shí)現(xiàn)殼聚糖納米載體體內(nèi)運(yùn)送核酸物質(zhì)導(dǎo)入目標(biāo)器官組織和細(xì)胞，是siRNA介導(dǎo)基因沉默臨床應(yīng)用需要解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。采用吸入給藥方式是治療呼吸道疾病的臨床有效的給藥方式，可以實(shí)現(xiàn)靶向目標(biāo)器官。但吸入藥氣霧的顆粒大小只有在4 6um之間，才能使藥物霧滴在肺內(nèi)沉積從而發(fā)揮藥效。相對于臨床其它吸入方式，超聲霧化吸入更加簡單易行。該吸入方式通過采納一個超聲霧化裝置將水溶性藥液在高頻振蕩的作用下，形成由4 6um超微粒子構(gòu)成的氣霧吸入治療。但問題是高頻振蕩會對核酸物質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成破壞，因此在臨床難以采納吸入治療模式進(jìn)行呼吸系統(tǒng)疾病小分子RNA干擾治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于通過提供一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，該給藥系統(tǒng)可用于運(yùn)送干擾目標(biāo)致病基因的siRNA，以發(fā)揮RNA干擾作用，抑制致病基因復(fù)制，能夠在活體內(nèi)運(yùn)送小分子RNA(SiRNA)靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因?yàn)槟康陌l(fā)揮相應(yīng)藥效作用的非病毒運(yùn)送系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個目的是提供上述呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，該給藥系統(tǒng)以經(jīng)超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA制成。沙丁胺醇胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)中具有β 2腎上腺能受體配體沙丁胺醇，即具有了歸巢裝置，對于呼吸道上皮細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞及肥大細(xì)胞等具有靶向效果。 而在超聲霧化處理前，Sal-胍基化殼聚糖的粒徑較小，粒徑分布離散度大，粒徑大小及分布都很不理想，且最適粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例少，致使人體內(nèi)靶器官的細(xì)胞的攝取量少，難以發(fā)揮有效的RNA干擾作用。經(jīng)過本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)無論是單獨(dú)的Ml-胍基化殼聚糖納米粒還是Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質(zhì)復(fù)合納米粒，經(jīng)過超聲霧化處理后，其粒徑都會出現(xiàn)相應(yīng)的增大。經(jīng)超聲霧化物理修飾后的Ml-胍基化殼聚糖納米粒的粒徑較超聲霧化前大，粒徑分布離散度小，且最適粒徑Ml-胍基化殼聚糖納米粒的比例多。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，SiRNA與經(jīng)超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖納米載體復(fù)合，形成在體內(nèi)可被靶器官細(xì)胞高效攝取的結(jié)構(gòu)形式(具體講就是能在體內(nèi)特異地被肺內(nèi)氣道上皮細(xì)胞攝取的結(jié)構(gòu)形式)，繼而能從內(nèi)涵體充分釋放出來，發(fā)揮RNA干擾治療作用?？梢姡?jīng)超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖與核酸物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合霧化納米能進(jìn)一步提高細(xì)胞對核酸物質(zhì)的攝取與基因轉(zhuǎn)染效率。本發(fā)明的所述的呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的粒徑在65 85nm范圍之間。本發(fā)明所述的干擾目標(biāo)致病基因的SiRNA即特異性干擾入侵病毒基因、或干擾導(dǎo)致炎癥或腫瘤病的基因的SiRNAjB SARS冠狀病毒某些結(jié)構(gòu)蛋白基因的siRNA、流感病毒A 型保守區(qū)域編碼基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA，以及腫瘤相關(guān)基因的siRNA或突變基因的siRNA等。干擾目標(biāo)致病基因的siRNA可根據(jù)具體目標(biāo)致病基因的結(jié)構(gòu)按常規(guī)方法設(shè)計(jì)篩選制備即可。本發(fā)明中的所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。本發(fā)明的第二個目的可以通過以下技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的一種上述呼吸道歸巢 siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其包括以下步驟(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液， 然后加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA混合復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液；(II)將所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液置于超聲霧化裝置中，進(jìn)行霧化成霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米粒，即本發(fā)明的給藥系統(tǒng)。當(dāng)所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液接觸到超聲霧化裝置的霧化片時，可瞬間霧化成霧滴，即所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液的超聲霧化處理在瞬間即完成，以避免長時間的高頻振蕩破壞沙丁胺醇胍基化殼聚糖的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述步驟(I)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的 siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。所述的步驟(II)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。作為本發(fā)明的另一種可行的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其具體操作是(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液， 然后進(jìn)行超聲霧化處理，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA進(jìn)行復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米粒，即得到本發(fā)明的給藥系統(tǒng)。所述步驟(1)中沙丁胺醇胍基化殼聚糖溶液的超聲霧化處理采用超聲霧化裝置，當(dāng)沙丁胺醇胍基化殼聚糖溶液接觸到超聲霧化裝置的霧化片時，可瞬間霧化成霧滴，即所述沙丁胺醇胍基化殼聚糖的超聲霧化處理在瞬間即完成，以避免長時間的高頻振蕩破壞沙丁胺醇胍基化殼聚糖的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述步驟(1)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的 siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。所述的步驟(1)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。以下結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行闡述本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果(1)本發(fā)明通過對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進(jìn)行超聲霧化處理，再與核酸物質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合霧化納米給藥系統(tǒng)，能進(jìn)一步提高細(xì)胞對核酸物質(zhì)的攝取與基因轉(zhuǎn)染效率。將沙丁胺醇胍基化修飾的殼聚糖納米按比例與siRNA復(fù)合，利用熒光染料Y0Y01 標(biāo)記核酸，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)沙丁胺醇胍基化修飾能增加細(xì)胞對殼聚糖核酸復(fù)合物的內(nèi)吞(圖2，圖3)，沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米按比例與靶向綠色熒光蛋白(GFP)的 siRNA復(fù)合后，經(jīng)與培養(yǎng)細(xì)胞共孵育，能夠迅速被細(xì)胞(一個穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞株)吞飲，并隨即從內(nèi)涵體釋放，有效介導(dǎo)該siRNA特異性的干擾作用，降低細(xì)胞GFP的表達(dá)水平(圖4，圖5)。同時，該干擾作用也在動物體內(nèi)得到驗(yàn)證(圖6)。Beta腎上腺素能受體，是G-蛋白質(zhì)偶合受體(GPCRs)超級家族之一，具有7個跨膜區(qū)，分為β ，β2和β 3三種亞型，其中β 2受體廣泛分布于平滑肌和肺組織內(nèi)。GPCRs 和相應(yīng)的配體結(jié)合以后，能誘發(fā)網(wǎng)格蛋白所介導(dǎo)的配體/受體復(fù)合物的內(nèi)化作用，擁有相應(yīng)受體的細(xì)胞會增加對接枝有β 2受體配體的載體特異性攝取。由于293細(xì)胞能表達(dá)一定水平的β 2受體，而16ΗΒΕ細(xì)胞不表達(dá)，通過對這兩種細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)比較證實(shí)在擁有 β 2受體的293細(xì)胞較之不表達(dá)β 2受體的16ΗΒΕ細(xì)胞，Sal-胍基化殼聚糖納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率要明顯高于單純胍基化殼聚糖載體(圖7)。沙丁胺醇胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合霧化納米粒經(jīng)氣道內(nèi)給藥以后，可見降低GFP轉(zhuǎn)基因小鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)細(xì)胞GFP的表達(dá)水平最為有效(圖8)。因此從體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)可以證明，沙丁胺醇胍基化殼聚糖核酸納米粒具有體內(nèi)靶向呼吸道上皮運(yùn)送核酸物質(zhì)，發(fā)揮干擾siRNA的治療能力。本發(fā)明通過采用超聲霧化對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進(jìn)行物理修飾后，使得沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米粒和沙丁胺醇胍基化殼聚糖與核酸復(fù)合納米粒的粒徑較超聲霧化處理前大，而且納米粒的粒徑分布離散度明顯減小，最適粒徑納米粒的比例增多，均勻性顯著增加(參見圖9和圖10)，證明超聲霧化效應(yīng)能夠進(jìn)一步優(yōu)化沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米載體。而經(jīng)超聲霧化處理后沙丁胺醇胍基化殼聚糖的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA的能力優(yōu)于未經(jīng)超聲霧化處理的沙丁胺醇胍基化殼聚糖(參見圖12和圖1 ，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明本發(fā)明的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形式為在體內(nèi)可被靶器官細(xì)胞高效攝取的結(jié)構(gòu)形式，并能從內(nèi)涵體充分釋放出來發(fā)揮RNA干擾治療作用。(2)本發(fā)明的超聲霧化作用主要針對載體本身，與超聲霧化處理及復(fù)合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的順序關(guān)聯(lián)不大，即先復(fù)合再超聲霧化處理同樣能提高細(xì)胞對核酸物質(zhì)的攝取與基因轉(zhuǎn)染效率。無論沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米先經(jīng)超聲霧化處理再與核酸物質(zhì)形成復(fù)合霧化納米粒，還是沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米和核酸物質(zhì)復(fù)合后再進(jìn)行超聲霧化，沙丁胺醇胍基化殼聚糖納米的包裹均能有效保護(hù)核酸物質(zhì)免受機(jī)械剪切力的降解破壞作用(圖11)， 沙丁胺醇胍基化殼聚糖只要經(jīng)超聲霧化處理，就能明顯增強(qiáng)對攜載核酸物質(zhì)的能力。 且其經(jīng)過超聲霧化的沙丁胺醇胍基化殼聚糖較之未經(jīng)修飾的殼聚糖等載體的運(yùn)送與轉(zhuǎn)染基因的效率更高(圖12，13)。因而，前述的兩種制備順序均能提高細(xì)胞對核酸物質(zhì)的攝取與基因轉(zhuǎn)染效率。(3)本發(fā)明采用先將沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的SiRNA復(fù)合再進(jìn)行超聲霧化處理的方式，更有利于簡化給藥系統(tǒng)的制備過程，更加適于臨床給藥操作，而且效果會更好。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，無論是先對沙丁胺醇胍基化殼聚糖進(jìn)行超聲霧化處理再與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA進(jìn)行復(fù)合，還是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合后再進(jìn)行超聲霧化處理，所得的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米都有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，說明了超聲霧化的作用只對沙丁胺醇胍基化殼聚糖發(fā)生作用，并沒有破壞siRNA的結(jié)構(gòu)。但是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA先混合復(fù)合再進(jìn)行超聲霧化處理，在進(jìn)行超聲霧化處理的同時霧化成可臨床使用的霧滴，使得本發(fā)明的給藥系統(tǒng)的制備過程更加簡單，更加適于臨床給藥操作，而且效果更好。


圖1是熒光染料Yoyol與載體結(jié)合情況。A :yoyol ；B :yoyol + Sal- M 基化殼聚 H ；C :yoyol + siRNA ；D yoyol+siRNA+lipofectamine ；E :yoyol+siRNA+殼聚糖；F :yoyol+siRNA+Sal-胍基化殼聚糖。單獨(dú)Yoyol㈧和Yoyol載體混合物⑶在未結(jié)合核酸的情況下，均不顯示熒光。當(dāng)和核酸物質(zhì)siRNA結(jié)合以后則發(fā)出強(qiáng)綠色熒光(C、D、E、F)圖2是各載體胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的情況。A =Lipofectamine ；B 殼聚糖；C =Sal-胍基化殼聚糖。圖2A顯示大部分細(xì)胞內(nèi)都可見綠色熒光，圖2B只見少量綠色熒光陽性細(xì)胞，圖2C顯示在Sal-胍基化殼聚糖載體組， 綠色熒光陽性細(xì)胞的比例低于對照組，但單個細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度高于對照組。圖3是各種載體在小鼠肺部當(dāng)中轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的情況。A，B, C =Lipofectamine ；D, E，F(xiàn) 殼聚糖；G H，I =Sal-胍基化殼聚糖A，D，G :yoyol 示蹤；B, E，H =DAPI 染色；C, F，I 綠色熒光(yoyol)與藍(lán)色熒光 (DAPI)復(fù)合。圖A和圖B顯示，小鼠肺部基本上未觀察到綠色熒光陽性的肺氣道細(xì)胞。在 Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合物組小鼠肺組織，其肺泡和氣道上皮處均可見綠色熒光陽性的細(xì)胞，如圖C。圖4是熒光顯微鏡顯示各種載體攜載小分子RNA在細(xì)胞內(nèi)干擾GFP表達(dá)的情況。A =Sal-胍基化殼聚糖與negative-control siRNA的復(fù)合物；B 天然殼聚糖與 GFPsiRNA的復(fù)合物；C =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復(fù)合物。圖B顯示細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度稍弱于圖A中陰性對照組中的細(xì)胞。Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復(fù)合物納米能夠顯著減弱被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，圖C所示其細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯低于圖A陰性對照組細(xì)胞。注該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GFP。圖5是流式細(xì)胞儀定量分析各種載體攜載SiRNA在細(xì)胞內(nèi)干擾GFP表達(dá)的情況。1 =Sal-胍基化殼聚糖與negative-control siRNA復(fù)合納米粒；2 天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比天然殼聚糖GFP siRNA = 5:1);3 天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比天然殼聚糖GFP siRNA = 3:1);4 天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比天然殼聚糖GFP siRNA = 1:1);5 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA = 5:1);6 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA = 3:1);7 jal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒(質(zhì)量比Sal-胍基化殼聚糖GFPsiRNA =1:1);注該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)GFP ；*P < 0. 05。圖6是熒光顯微鏡顯示Ml-胍基化殼聚糖在小鼠體內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾的情況。Neg 胍基化殼聚糖與negative-control siRNA復(fù)合納米粒；CS 天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒；Sal-Gua-CS =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒。其中，Neg和CS組小鼠肺組織切片可見氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)綠色熒光蛋白。與之相比，給予Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達(dá)水平顯著下降。注該小鼠為GFP轉(zhuǎn)基因小鼠。圖7是兩種載體分別在HEK293細(xì)胞和16HBE細(xì)胞中的效率的條形圖。A :HEK293細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測；B :16HBE細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)平均每個視野當(dāng)中表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量。*v. s. Chitosan P < 0. 01圖8是熒光顯微鏡顯示Ml-胍基化殼聚糖在小鼠體內(nèi)靶向介導(dǎo)RNA干擾的情況。CS 天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒；Gua-CS 胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒；Sal-Gua-CS =Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒。CS組小鼠肺組織切片可見氣道上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞均強(qiáng)表達(dá)綠色熒光蛋白。 與之相比，給予胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復(fù)合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達(dá)水平有所下降，而給予Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA的復(fù)合納米粒處理的小鼠肺組織，GFP表達(dá)水平下降更為明顯。圖9是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復(fù)合霧化納米給藥系統(tǒng)超聲霧化前和超聲霧化后透視電鏡圖；a =Sal-胍基化殼聚糖；b =Sal-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合納米粒；c 超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖；d 超聲霧化處理后的Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合霧化納米粒。圖10是沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復(fù)合霧化納米給藥系統(tǒng)超聲霧化處理前和超聲霧化處理后納米粒徑的分布圖。chi/DNA 超聲霧化處理前的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復(fù)合納米粒；A (chi/DNA)超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和DNA復(fù)合納米粒；超聲霧化處理前，Sal-胍基化殼聚糖及Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合納米粒的粒徑較小，分布范圍較寬；超聲霧化處理后其粒徑有所增大，粒徑分布范圍變窄，均勻度較前明顯改善。*P < 0. 01 ；其中的小方框代表粒徑分布。圖11是裸DNA以及DNA按不同形式與Ml-胍基化殼聚糖載體復(fù)合后的電泳圖；Lane 1和Lane 2 裸DNA ；Lane 3 =Sal-胍基化殼聚糖與DNA的復(fù)合物；Lane 4 超聲霧化后的裸DNA ；Lane 5 裸DNA超聲霧化后與Ml-胍基化殼聚糖的復(fù)合物；Lane 6 單獨(dú)超聲霧化后的裸DNA與單獨(dú)超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖的復(fù)合物；Lane 7 =DNA與Ml-胍基化殼聚糖的復(fù)合物經(jīng)超聲霧化的產(chǎn)物；Lane4, Lane5和Lane6均顯示裸DNA受超聲霧化明顯的機(jī)械剪切作用而被降解， 產(chǎn)物成帶狀分布；Lane7顯示載體包裹DNA后再進(jìn)行超聲霧化及霧化，復(fù)合物完整地滯留在加樣孔中。圖12是超聲霧化對各載體復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率的影響(HEK293細(xì)胞)。1. Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質(zhì)粒)復(fù)合納米粒組；2. Sal-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復(fù)合納米粒組；3.超聲霧化后Ml-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復(fù)合納米粒組 (Sal-胍基化殼聚糖和裸DNA分別超聲霧化后再復(fù)合)；4.超聲霧化Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖先進(jìn)行超聲霧化處理，再與DNA復(fù)合)；5. Ml-胍基化殼聚糖與DNA的復(fù)合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合后再超聲霧化處理收集的霧滴)。*v. s group 1，P < 0· 01.圖13是Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合物超聲霧化前后轉(zhuǎn)染效率的變化(16HBE 細(xì)胞)；Gua =Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質(zhì)粒)復(fù)合納米粒組；Aerosol =Sal-胍基化殼聚糖與DNA (pEGFP_N2質(zhì)粒)復(fù)合霧化納米粒組；*Ρ<0·01。
具體實(shí)施例方式以下通過實(shí)施例進(jìn)行說明本發(fā)明提供的呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備與應(yīng)用，實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明的目的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)例一 Sal_胍基化殼聚糖納米體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸的能力主要實(shí)驗(yàn)材料天然殼聚糖納米粒美國Sigma公司Sal-胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用》(申請?zhí)?200910245193. 6)中所述方法制備
MEM培養(yǎng)基美國Gibico公司胎牛血清杭州四季青公司質(zhì)粒抽提試劑盒美國Promega公司Lipofectamin 2000 (核酸轉(zhuǎn)染試劑)美國 hvitrogen 公司siRNA 美國 AMBION 公司Yoyol (熒光染料，用于標(biāo)記核酸物質(zhì))美國hvitrogen公司實(shí)驗(yàn)方法1. Ml-胍基化殼聚糖納米向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸1. 1取Iug的siRNA和^yol熒光染料避光復(fù)合，2小時以后分別與天然殼聚糖、 Ml-胍基化殼聚糖和LipOfectamine2000(對照品)按1 3 (siRNA 載體)的質(zhì)量比進(jìn)行復(fù)合，所述的復(fù)合是指天然殼聚糖、Ml-胍基化殼聚糖和LipofectamindOOO等載體包裹siRNA的過程，而天然殼聚糖和Ml-胍基化殼聚糖都帶正電荷，而siRNA帶負(fù)電荷，混合后天然殼聚糖和Ml-胍基化殼聚糖會對siRNA進(jìn)行包裹。半小時以后在激光共聚焦顯微鏡觀察各復(fù)合物^yol的熒光強(qiáng)度。1. 2取HEK293細(xì)胞以2X IO5Cell/孔濃度接種于M孔板，常規(guī)培養(yǎng)于37°C、5% CO2孵箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到60 70%時分別用上述制備的各種載體與核酸物質(zhì)的復(fù)合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染(siRNAlug/孔)。M小時以后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光指示劑^yol在細(xì)胞內(nèi)分布的情況。2. Sal-胍基化殼聚糖納米在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸2. 1取siRNA和^yol熒光染料避光復(fù)合，2小時以后分別與天然殼聚糖、Sal-胍基化殼聚糖和Lipofectamine 2000(對照品)按1 3 (siRNA 載體)的質(zhì)量比進(jìn)行復(fù)合半小時。經(jīng)氣管將各種載體/核酸物質(zhì)復(fù)合物注射入小鼠肺部(siRNA 2ug/每只小鼠)， 6小時以后處死小鼠，分離肺臟冷凍包埋進(jìn)行組織冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察綠色熒光染料yoyol在肺內(nèi)細(xì)胞的分布情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.單獨(dú)的^yolJoyol與載體混合物在未結(jié)合核酸物質(zhì)siRNA的情況下，基本看不到熒光。當(dāng)^yol和核酸物質(zhì)siRNA結(jié)合以后，馬上發(fā)出強(qiáng)的綠色熒光，但大部分呈絲絮樣分布。加入載體以后，大部分熒光物質(zhì)呈顆粒狀分布，小部分聚集成團(tuán)，參見圖1。激光共聚焦顯微鏡觀察三種載體向細(xì)胞導(dǎo)入siRNA的能力，顯示在LipOfectamin2000組(對照品組脂質(zhì)體)，幾乎所有細(xì)胞內(nèi)都可見綠色熒光(見圖2A)，在Ml-胍基化殼聚糖載體組， 綠色熒光陽性細(xì)胞的比例雖然低于對照脂質(zhì)體組，但單個細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度高于對照組(見圖2C)，提示單個細(xì)胞攝取的siRNA量較對照組增多。在天然殼聚糖載體組只可見少量綠色熒光陽性細(xì)胞(見圖2B)。2.在各實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織，激光共聚焦顯微鏡顯示給予Lipofectamin 2000與 siRNA復(fù)合納米粒的小鼠肺基本上未觀察到綠色熒光陽性的肺氣道細(xì)胞，提示轉(zhuǎn)染離體細(xì)胞的核酸轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin脂質(zhì)體并不能有效地把siRNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)入小鼠肺部細(xì)胞(見圖3A、D和G)。未經(jīng)過修飾的天然殼聚糖納米載體同樣不能有效在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)核酸物質(zhì)siRNA(見圖3B、E和H)。相反，在Ml-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合物組的小鼠肺組織，其肺泡和氣道上皮處均可見綠色熒光陽性的細(xì)胞(見圖3C、F和I)。表明經(jīng)氣管給予Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合納米粒能在體內(nèi)被小鼠肺的細(xì)胞有效攝取。結(jié)論Sal_胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合納米粒能有效將siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，并能在活體狀態(tài)下經(jīng)氣道在體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)siRNA至肺內(nèi)細(xì)胞。

實(shí)驗(yàn)例二 Sal-胍基化殼聚糖與SiRNA復(fù)合納米粒在活體內(nèi)發(fā)揮RNA干擾作用主要實(shí)驗(yàn)材料Sal-胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用》(申請?zhí)?00910245193. 6)中所述方法制備天然殼聚糖納米粒美國Sigma公司綠色熒光蛋白(GFP)siRNA 美國AMBION公司Negative Control siRNA 美國 AMBION 公司GFP穩(wěn)定表達(dá)HEK293細(xì)胞株本實(shí)驗(yàn)室篩選和培養(yǎng)EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠賽業(yè)生物技術(shù)有限公司。EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠為C57BL/6背景，表達(dá)方式為全身表達(dá)。EGFP基因構(gòu)建在pCAGGS載體上，該載體具有雞β -actin啟動子、CMV 增強(qiáng)子。超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)美國 Aerogen 公司微量霧化器美國Penn-Century公司實(shí)驗(yàn)方法l.Sal-胍基化殼聚糖介導(dǎo)RNA干擾的作用(體外培養(yǎng)的細(xì)胞)Sal-胍基化殼聚糖按與Negative Control siRNA 3 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時；天然殼聚糖與GFP siRNA按5 1,3 1和1 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時；Sal-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA按5 1，3 1和1 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時。接種HEK293細(xì)胞(穩(wěn)定表達(dá) GFP))以2X105cell/孔濃度于24孔板，將Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA 復(fù)合納米粒、天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒以及Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒分別添加至接種細(xì)胞的孔內(nèi)(lug的siRNA/孔)。24小時以后激光共聚焦顯微鏡觀察各處理組細(xì)胞GFP表達(dá)的改變，同時用流式細(xì)胞儀定量檢測各組細(xì)胞GFP的平均熒光強(qiáng)度。2. Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合納米粒在小鼠體內(nèi)介導(dǎo)RNA干擾的作用Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA按3 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時，得到Sal-胍基化殼聚糖與Negative Control siRNA復(fù)合納米粒；天然殼聚糖與GFP siRNA 按3 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時，得到天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒；Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA按3 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時，得到Sal-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒；再應(yīng)用超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)分別對三種復(fù)合納米粒進(jìn)行超聲霧化，然后用IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)。實(shí)驗(yàn)采納穩(wěn)定表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠(體內(nèi)各臟器組織均表達(dá)綠色熒光蛋白)，利用Perm-Century公司的微量霧化裝置將收集的各種復(fù)合物納米通過氣道內(nèi)霧化的方式分別給予GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，每天一次，每次IOOul (含2ug的 siRNA)，連續(xù)3天，第4天處死小鼠，冷凍包埋進(jìn)行冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各處理因素對小鼠肺組織GFP表達(dá)的影響。結(jié)果
1.激光共聚焦顯微鏡與流式細(xì)胞儀檢測示天然殼聚糖與GFPsiRNA復(fù)合納米粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的穩(wěn)定表達(dá)GFP的HEK293細(xì)胞，可以輕度下調(diào)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；相比之下，超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復(fù)合納米粒能夠顯著減弱被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，表明超聲霧化后的Ml-胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒能將GFP siRNA有效轉(zhuǎn)運(yùn)帶入細(xì)胞內(nèi)，并發(fā)揮RNA干擾的作用，降低細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)水平。(見圖 4和圖5)。2.激光共聚焦顯微鏡觀察肺組織切片顯示給予Ml-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA 復(fù)合納米粒的小鼠肺組織GFP的表達(dá)水平較之陰性對照或天然殼聚糖與GFPsiRNA復(fù)合納米粒處理顯著下降(見圖6)。結(jié)論經(jīng)超聲霧化處理的Ml-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合納米粒能在活體狀態(tài)下經(jīng)氣道在肺內(nèi)發(fā)揮有效的RNA干擾作用。實(shí)驗(yàn)例三Aal-胍基化殼聚糖與核酸的復(fù)合納米?；铙w狀態(tài)下靶向性轉(zhuǎn)運(yùn)核酸進(jìn)行RNA干擾的能力材料及方法主要實(shí)驗(yàn)材料胍基化殼聚糖按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用》(中國專利申請，申請?zhí)?200910245193. 6)中所述方法制備。沙丁胺醇(Sal)美國Sigma公司。Sal-胍基化殼聚糖納米載體按照《沙丁肢醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用》(中國專利申請，申請?zhí)?200910245193. 6)中所述方法制備。16HBE細(xì)胞(人支氣管上皮細(xì)胞株)英國南安普頓(Southampton)大學(xué)Meven. Holgate教授惠贈。pEGFP-N2 質(zhì)粒美國 Clontech 公司。綠色熒光蛋白(GFP)siRNA 美國AMBION公司。GFP轉(zhuǎn)基因小鼠同實(shí)驗(yàn)例二。超聲霧化頭(Aeroneb LabNebulizer)美國 Aerogen 公司。微量霧化器美國Penn-Century公司。方法1、由于HEK293細(xì)胞能夠表達(dá)β 2受體，而16ΗΒΕ細(xì)胞不表達(dá)β 2受體，首先在體外培養(yǎng)細(xì)胞比較了未接枝β 2受體激動劑沙丁胺醇的胍基化殼聚糖與接枝沙丁胺醇的胍基化殼聚糖(Ml-胍基化殼聚糖)在向上述兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)染核酸的不同能力。取HEK293細(xì)胞以2 X IO5Cell/孔濃度接種于M孔板，常規(guī)培養(yǎng)于37°C、5% CO2孵箱中，待細(xì)胞密度達(dá)到60 % -70 %的時候進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分兩組，單純胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染組和Ml-胍基化殼聚糖轉(zhuǎn)染組，分別以5 1的質(zhì)量比與PEGFP-N2質(zhì)粒復(fù)合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染(lug 的質(zhì)粒/孔)。24小時換液一次，轉(zhuǎn)染后72小時，流式細(xì)胞儀計(jì)算并比較胍基化殼聚糖與 PEGFP-N2質(zhì)粒復(fù)合納米粒和Ml-胍基化殼聚糖與PEGFP-N2質(zhì)粒復(fù)合納米粒在HEK293細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染PEGFP-N2質(zhì)粒的陽性細(xì)胞比例。與此同時，比較了熒光顯微鏡下胍基化殼聚糖與Ml-胍基化殼聚糖在不表達(dá)β 2受體的16ΗΒΕ細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEGFP-N2效率的不同(按照表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞數(shù)/平均每個視野細(xì)胞數(shù)測算)。
2、驗(yàn)證Sal-胍基化殼聚糖與pEGFP_N2質(zhì)粒復(fù)合納米粒在活體狀態(tài)下通過歸巢裝置靶向氣道細(xì)胞對siRNA干擾能力的影響。天然殼聚糖、胍基化殼聚糖和Sal-胍基化殼聚糖分別與GFP siRNA按3 1的質(zhì)量比復(fù)合半小時，再應(yīng)用超聲霧化頭(Aer0neb Lab Nebulizer)進(jìn)行超聲霧化，然后用 IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)。實(shí)驗(yàn)采納穩(wěn)定表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因小鼠(體內(nèi)各臟器組織均表達(dá)綠色熒光蛋白)，利用Perm-Century公司的微量霧化裝置將收集的三種復(fù)合物納米通過氣道內(nèi)霧化的方式分別給予GFP轉(zhuǎn)基因小鼠，每天一次，每次IOOul (含2ug的siRNA)，連續(xù)3 天，第4天處死小鼠，冷凍包埋進(jìn)行冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡觀察各處理因素對小鼠肺組織GFP表達(dá)的影響。
結(jié)果1、熒光顯微鏡與流式細(xì)胞儀檢測表明在離體培養(yǎng)表達(dá)β 2受體的ΗΕΚ293細(xì)胞， Sal-胍基化殼聚糖納米載體轉(zhuǎn)染PEGFP-N2質(zhì)粒的效率顯著高于未接枝Sal的胍基化殼聚糖納米載體，表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例顯著增加(見圖7Α)。而在不表達(dá)β 2受體的16ΗΒΕ細(xì)胞，有無Sal-歸巢裝置對載體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的效率沒有明顯影響。(見圖7Β)。這一結(jié)果可以證明胍基化殼聚糖接枝Sal的歸巢修飾具有靶向性，可以提高具有β 2受體的 ΗΕΚ293細(xì)胞對核酸的攝取能力。2、激光共聚焦顯微鏡顯示活體給予天然殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒、胍基化殼聚糖與GFP siRNA復(fù)合納米粒和Sal-胍基化殼聚糖GFP siRNA的復(fù)合納米粒后，從各組小鼠肺組織切片可以看到較之天然殼聚糖與GFPsiRN A復(fù)合納米粒組或胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復(fù)合納米粒組，給予Sal-胍基化殼聚糖與GFPsiRNA復(fù)合納米粒的小鼠肺組織熒光表達(dá)下降的程度最明顯，表明siRNA干擾的效率最好。(見圖8)。結(jié)論經(jīng)過超聲霧化處理的Sal-胍基化殼聚糖與siRNA復(fù)合納米粒在活體狀態(tài)下經(jīng)鼻給予小鼠，具有靶向氣道細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)小分子RNA，實(shí)現(xiàn)并提高了 RNA干擾的能力。實(shí)驗(yàn)例四呼吸道歸巢核酸霧化納米粒的制備及其對核酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)效應(yīng)材料及方法主要材料與裝置Sal-胍基化殼聚糖載體按照《沙丁胺醇修飾胍基化殼聚糖與制備方法和應(yīng)用》 (中國專利申請，申請?zhí)?200910245193. 6)中所述方法制備pEGFP-N2 質(zhì)粒美國 Clontech 公司超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer)美國 Aerogen 公司實(shí)驗(yàn)方法利用了頻率為128KHz士 10%的超聲霧化頭(Aeroneb Lab Nebulizer,由原裝交流電源驅(qū)動改接成便攜干電池驅(qū)動)對復(fù)合物納米進(jìn)行超聲霧化。先將Sal-胍基化殼聚糖和pEGFP-N2質(zhì)粒按質(zhì)量比為5 1的比例復(fù)合，再應(yīng)用Aeroneb霧化頭在128KHz 士 10% 的頻率下進(jìn)行超聲霧化，然后用IOml玻璃離心管連接霧化頭的霧化液出口，收集霧滴(形成的氣霧滴直徑分布約4 6微米，適合臨床霧化治療)，得到霧化納米粒。1、將收集的霧化納米粒制備電鏡標(biāo)本進(jìn)行透射電鏡觀察納米粒徑大小與分布的變化。
2、凝膠電泳進(jìn)行DNA-凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)觀察霧化納米中DNA的完整性以及殼聚糖納米粒對核酸的包裹作用。電泳條件瓊脂糖凝膠60V電泳半小時，分為7個泳道，Lanel 和Lane2為裸DNA，Lane3為Ml-胍基化殼聚糖與DNA的復(fù)合物，Lane4為單獨(dú)霧化后的裸 DNA, Lane5為單獨(dú)霧化后的裸DNA與Ml-胍基化殼聚糖的復(fù)合物，Lane6為單獨(dú)霧化后的裸DNA與單獨(dú)霧化后的Ml-胍基化殼聚糖的復(fù)合物，Lane7為Ml-胍基化殼聚糖與裸DNA 的復(fù)合物超聲霧化的產(chǎn)物。3、用收集的復(fù)合物霧化納米粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)觀察其包裹的核酸物質(zhì)，即 PEGFP-N2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。HEK293細(xì)胞以8X IO5/孔濃度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)于37°C,5% CO2孵箱，待細(xì)胞密度達(dá)到60-70 %時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60 % -70 %的時候進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染 HEK293細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分五個組1. Ml-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質(zhì)粒)復(fù)合納米粒組； 2. Sal-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA復(fù)合納米粒組；3.超聲霧化后Ml-胍基化殼聚糖與超聲霧化后的裸DNA的復(fù)合納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖和裸DNA分別超聲霧化后再復(fù)合)；4.超聲霧化Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖先進(jìn)行超聲霧化處理，再與DNA復(fù)合)；5. Sal-胍基化殼聚糖與DNA的復(fù)合霧化納米粒組(Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合后再超聲霧化處理收集的霧滴)。收集各組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀計(jì)算綠色熒光蛋白表達(dá)陽性細(xì)胞比例。轉(zhuǎn)染16HBE的實(shí)驗(yàn)分兩組，分別為Ml-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質(zhì)粒)復(fù)合納米粒組和胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP_N2質(zhì)粒)復(fù)合霧化納米粒組。熒光顯微鏡下計(jì)算平均每個視野中表達(dá)綠色熒光蛋白的16HBE細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果1.透射電鏡示超聲霧化處理后，載體Ml-胍基化殼聚糖納米粒徑和Ml-胍基化殼聚糖與DNA復(fù)合納米粒的粒徑較前增大，約在65 85nm范圍之間，粒徑分布范圍變窄，而且Ml-胍基化殼聚糖納米粒的粒徑分布離散度明顯減小，最適粒徑納米粒的比例增多，均勻性顯著增加(參見圖9和圖10)，證明超聲霧化效應(yīng)能夠進(jìn)一步優(yōu)化Ml-胍基化殼聚糖納米載體。2.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示超聲霧化對裸DNA產(chǎn)生明顯的機(jī)械剪切作用，裸DNA被降解(圖11泳道4、5、6)，裸DNA霧化產(chǎn)物經(jīng)電泳以后在泳道成帶狀分布。載體Ml-胍基化殼聚糖包裹DNA后再進(jìn)行霧化，電泳顯示復(fù)合物完整地滯留在加樣孔中(圖11泳道7)，提示Ml-胍基化殼聚糖納米載體能有效保護(hù)DNA免受超聲霧化對核酸物質(zhì)的破壞作用。3.細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明無論在HEK293細(xì)胞還是16HBE細(xì)胞，經(jīng)超聲霧化處理后的 Sal-胍基化殼聚糖與DNA(pEGFP-N2質(zhì)粒)復(fù)合霧化納米粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均較前顯著提高。另外，先對載體Ml-胍基化殼聚糖進(jìn)行超聲霧化修飾，再與核酸物質(zhì)復(fù)合，同樣可使細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率得到相似水平的提高(見圖12和圖13)。結(jié)論Aal-胍基化殼聚糖納米載體或Ml-胍基化殼聚糖與核酸復(fù)合納米粒經(jīng)一定頻率的超聲霧化進(jìn)行物理修飾，顯著改善了其作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)核酸物質(zhì)的性能，與此同時能夠形成臨床霧化吸入治療適宜的氣霧滴，提供了經(jīng)呼吸道給予治療用核酸藥的新系統(tǒng)。實(shí)施例一(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進(jìn)行超聲霧化成4um 6um霧滴，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標(biāo)致病基因的SiRNA進(jìn)行復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA之間的質(zhì)量比為1 1，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的 siRNA復(fù)合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)。收集霧滴制成電鏡標(biāo)本， 經(jīng)透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的粒徑在65 85nm之間。實(shí)施例二(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA進(jìn)行混合復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液，其中沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA為質(zhì)量比3 1。(II)沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進(jìn)行超聲霧化成4um 6um霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)。 收集霧滴制成電鏡標(biāo)本，經(jīng)透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的粒徑在65 85nm之間。實(shí)施例三(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA進(jìn)行混合復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液，其中沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA為質(zhì)量比5 1。(II)沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液置于超聲霧化裝置中在128KHz頻率下進(jìn)行超聲霧化成4um 6um霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米粒，即呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)。 收集霧滴制成電鏡標(biāo)本，經(jīng)透射電鏡觀察到所得呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的粒徑在65 85nm之間。以上實(shí)施例中的干擾目標(biāo)致病基因的SiRNA是指導(dǎo)致炎癥或腫瘤病的病毒基因的siRNA、腫瘤基因的siRNA、腫瘤相關(guān)基因的siRNA或突變基因的siRNA等，如SARS冠狀病毒某些結(jié)構(gòu)蛋白基因的siRNA、流感病毒A型保守基因的siRNA、肝炎病毒的siRNA等。以上干擾目標(biāo)致病基因的siRNA根據(jù)具體目標(biāo)致病基因的結(jié)構(gòu)按常規(guī)方法制備即可。本發(fā)明可用其他的不違背本發(fā)明的精神或主要特征的具體形式來概述。本發(fā)明的上述實(shí)施方案都只能認(rèn)為是對本發(fā)明的說明而不是限制，因此凡是依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種呼吸道歸巢SiRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，該給藥系統(tǒng)以經(jīng)超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標(biāo)致病基因的SiRNA制成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的粒徑在65 85nm范圍之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。
4.一種權(quán)利要求1 3任一權(quán)利要求所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(I)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA混合復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液；(II)將所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA的復(fù)合物溶液置于超聲霧化裝置中，進(jìn)行霧化成霧滴，得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的 siRNA復(fù)合霧化納米粒，即本發(fā)明的給藥系統(tǒng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述步驟(I)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟(II)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。
7.一種權(quán)利要求1 3任一權(quán)利要求所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)取沙丁胺醇胍基化殼聚糖加水溶解，配制得到沙丁胺醇胍基化殼聚糖水溶液，然后進(jìn)行超聲霧化處理，收集超聲霧化所得的霧滴；(2)在步驟(1)中收集的霧滴中加入干擾目標(biāo)致病基因的siRNA進(jìn)行復(fù)合，沙丁胺醇胍基化殼聚糖包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA形成沙丁胺醇胍基化殼聚糖與干擾目標(biāo)致病基因的siRNA復(fù)合霧化納米粒，即得到本發(fā)明的給藥系統(tǒng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中所述的沙丁胺醇胍基化殼聚糖和干擾目標(biāo)致病基因的siRNA之間的質(zhì)量比為1 5 1。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法，其特征在于，所述的步驟(1)中超聲霧化處理的功率115KHz 140KHz范圍之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)，該給藥系統(tǒng)以經(jīng)超聲霧化處理后的沙丁胺醇胍基化殼聚糖為載體材料，包裹干擾目標(biāo)致病基因的siRNA制成。本發(fā)明還公開了上述呼吸道歸巢siRNA霧化納米給藥系統(tǒng)的制備方法。本發(fā)明公開的給藥系統(tǒng)可用于運(yùn)送干擾目標(biāo)致病基因的siRNA，以發(fā)揮RNA干擾作用，抑制致病基因復(fù)制，能夠在活體內(nèi)運(yùn)送siRNA靶向肺呼吸道上皮，是以沉默靶基因?yàn)槟康陌l(fā)揮相應(yīng)藥效作用的非病毒運(yùn)送系統(tǒng)。
文檔編號A61K47/48GK102178957SQ20111004054
公開日2011年9月14日 申請日期2011年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月18日
發(fā)明者劉文廣, 孫鵬, 徐軍, 羅永峰, 翟欣昀 申請人:呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 天津大學(xué), 廣州醫(yī)學(xué)院