專利名稱：負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工真皮替代物再生材料及其制備方法。
技術(shù)背景
皮膚作為人體最大的器官，主要由表皮層、真皮層和皮下組織構(gòu)成，同時(shí)含有豐富 的血管和神經(jīng)。日常工作生活中由于各種原因如創(chuàng)傷、燒傷、慢性疾病、手術(shù)等很容易造成 皮膚的缺損。皮膚組織雖然具有較強(qiáng)的再生能力，但是在大面積的全層皮膚缺損情況下，由 于真皮層的缺失，皮膚的再生能力明顯減弱，極易產(chǎn)生大量的瘢痕形成或瘢痕攣縮。
治療全層皮膚缺損的關(guān)鍵是重建和再生真皮組織、促進(jìn)創(chuàng)面盡早封閉、避免微生 物入侵等。目前，應(yīng)對(duì)組織缺損的方式主要有三種，即自體組織移植、異體/異種組織移 植、人工材料替代。自體皮移植仍然是臨床治療全層皮膚缺損最有效的方法，但是該方法面 臨著自體皮供應(yīng)不足的缺點(diǎn)，且是一種“以傷治傷”的辦法；異體或異種組織移植又受到免 疫排斥反應(yīng)的限制；另一個(gè)常用的治療方法就是采用人工材料皮膚。目前國(guó)際市場(chǎng)上人工 皮膚有 Apligraf、Integra、Transcyte、AlloDerm 禾口 Dermagraft 等。
膠原-殼聚糖多孔支架真皮替代物再生材料可以有效誘導(dǎo)缺損組織處細(xì)胞的遷 移、增殖和分化，原位誘導(dǎo)缺損真皮組織的再生。該真皮替代物再生材料不但可以在體內(nèi)起 到良好的支撐作用，而且其所采用的膠原和殼聚糖是具有良好生物相容性、低免疫原性和 可降解性的天然高分子材料。
中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?2112498. 1申請(qǐng)日2002-07-10)公開(kāi)了組織工程用膠 原/殼聚糖多孔支架的制備方法，該方法采用天然生物材料膠原和殼聚糖為原料，通過(guò)冷 凍-凍干，再進(jìn)一步通過(guò)真空干熱法、醛類化合物或碳化二亞胺類化合物交聯(lián)，制備具有微 結(jié)構(gòu)可控、適宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。該發(fā)明的膠原/殼聚糖支架的生 物相容性好，降解速率可控，且材料來(lái)源廣泛，成本低，制備工藝簡(jiǎn)單可行，重復(fù)性好，所構(gòu) 建的支架可以廣泛地應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
進(jìn)一步，中國(guó)發(fā)明專利(申請(qǐng)?zhí)?00510060749. 6申請(qǐng)日2005-09-13)公開(kāi)了復(fù) 合血管生成素的肝素化膠原/殼聚糖多孔支架的制備方法，該方法用乙酸溶液分別將牛腱 膠原、殼聚糖配制成0. 5^5%的溶液，混合均勻注入模具，殼聚糖溶液含量為5 30%，冷凍后 置凍干機(jī)中凍干得到膠原/殼聚糖多孔支架；真空處理后，將其浸泡到含肝素鈉的2-N-嗎 啉乙烷磺酸溶液中浸泡，然后添加1-乙基-3-3- (二甲基胺丙基)-碳化二亞胺溶液和N-羥 基丁二酰亞胺溶液處理，清洗，再次冷凍、凍干得到肝素化膠原/殼聚糖多孔支架；浸泡到 血管生成素溶液中。該專利工藝簡(jiǎn)單、有效，影響因素少，較易推廣，制備的肝素化膠原/殼 聚糖多孔支架所具有適宜的孔徑和孔隙率，適合皮膚組織工程的真皮替代物。
人工真皮替代物再生材料血管化速度是影響其再生能力、材料移植成活率的關(guān) 鍵。由于人工真皮替代物再生材料中缺乏相互連通的血管網(wǎng)絡(luò)，難以實(shí)現(xiàn)與創(chuàng)面基底區(qū)血 管的快速接連。在移植初期，人工真皮替代物再生材料中的細(xì)胞所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要依靠擴(kuò)散作用來(lái)實(shí)現(xiàn)，而細(xì)胞的增殖和分化等功能常因營(yíng)養(yǎng)成分的缺乏而受限，甚至導(dǎo)致細(xì) 胞調(diào)亡，從而影響其再生速度和存活率。目前的人工真皮替代物再生產(chǎn)品的血管化速率較 慢，植入物完全血管化一般需要幾周(2、周)的時(shí)間，增加了病人的住院時(shí)間和感染風(fēng)險(xiǎn)。 因此，如何促進(jìn)人工真皮替代物再生材料的血管化速度，進(jìn)而縮短創(chuàng)面缺血時(shí)間，提高移植 存活率，是皮膚再生與修復(fù)研究中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。
多項(xiàng)研究證實(shí)rhGM-CSF在深I(lǐng)I度燒傷創(chuàng)面、慢性疾病所致潰瘍等多種原因?qū)е?的皮膚缺損治療中顯示了明顯的積極作用，rhGM-CSF能夠通過(guò)從骨髓動(dòng)員和招募造血干細(xì) 胞和內(nèi)皮干細(xì)胞，以調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖、分化和存活，還特異性地刺激骨髓祖細(xì)胞向粒細(xì) 胞和巨噬細(xì)胞分化，以調(diào)動(dòng)免疫系統(tǒng)。但細(xì)胞因子存在活性不穩(wěn)定，容易降解的缺陷。發(fā)明內(nèi)容
為了解決細(xì)胞因子存在活性不穩(wěn)定，容易降解的缺陷，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供 一種負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，該再生材料具有快速血管化，可 廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷和燒傷等全層皮膚缺損修復(fù)。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種上述的負(fù) 載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料的制備方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，該再生材料由肝素化的膠原-殼 聚糖支架負(fù)載所述rhGM-CSF溶液構(gòu)成。
作為優(yōu)選，上述的rhGM-CSF溶液的濃度為lOOng/m廣300 μ g/ml。
作為優(yōu)選，上述的肝素化的膠原-殼聚糖支架由膠原-殼聚糖支架在含肝素、EDC (1-乙基-3-3-( 二甲基胺丙基)-碳化二亞胺)和NHS(N-羥基丁二酰亞胺)的MES(2-N-嗎 啉乙烷磺酸)溶液中真空脫泡后交聯(lián)反應(yīng)，然后冷凍干燥制得，肝素與膠原-殼聚糖支架中 的膠原的質(zhì)量比為1:20 1:4，EDC和NHS的濃度比為1:1 4:1。
作為再優(yōu)選，上述的膠原-殼聚糖支架中殼聚糖和膠原的質(zhì)量比為1:纊5:5。
為了實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案一種制備上述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料的方法，該方法 包括以下的步驟1)用質(zhì)量濃度為0.39Γ5%的乙酸溶液分別配制質(zhì)量濃度為0. 059Γ5%的膠原溶液和殼 聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆颉⒄婵彰撆莺?，得到膠原-殼聚糖 混合溶液；將膠原-殼聚糖共混液注入模具中，于4°C下充分作用M小時(shí)后，采用冷凍-干 燥法，在_5°C -80°C溫度下冷凍干燥，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；2)將上述步驟1)所得的膠原-殼聚糖三維多孔支架在80°C 180°C下真空干熱交聯(lián)處 理24小時(shí)；3)將肝素按與膠原-殼聚糖支架中的膠原的質(zhì)量比為l:2(Tl:4的比例置于含EDC和 NHS的MES溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹?；再將上述步驟2)所得的干熱處理后的膠原-殼聚糖支 架置于該種混合液中，真空脫泡，交聯(lián)114小時(shí)；反復(fù)沖洗后，再次在_5°C -80°C溫度下冷 凍干燥，制得所述的肝素化的膠原-殼聚糖支架；4)利用注射用水或去離子水配制濃度為lOOng/m廣300μ g/ml的rhGM-CSF溶液，將膠 原-殼聚糖支架浸泡在該溶液中，4°C下靜置孵育M小時(shí)，即得到所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料。
當(dāng)然，本發(fā)明的膠原-殼聚糖支架可以采用中國(guó)發(fā)明專利0211M98. 1公開(kāi)的方法 制備，肝素化的膠原-殼聚糖支架也可以采用200510060749. 6公開(kāi)的方法制備。
作為優(yōu)選，上述的EDC與NHS比為1:1 4:1。
作為優(yōu)選，上述的MES溶液的濃度0. 05M, pH5. 4。
本發(fā)明將細(xì)胞因子治療與組織工程再生醫(yī)學(xué)的方法和技術(shù)結(jié)合，選擇具有良好 生物相容性、低免疫原性和可降解性的天然高分子材料，與rhGM-CSF相復(fù)合，形成具有 rhGM-CSF生物活性的復(fù)合型組織工程皮膚真皮替代物再生材料，實(shí)現(xiàn)rhGM-CSF的可控的 持續(xù)釋放，促進(jìn)人工真皮替代物再生材料的血管化，最終獲得具有高移植成活率和良好再 生修復(fù)效果的復(fù)合型組織工程皮膚真皮替代物再生材料。
本發(fā)明制備的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，其突出特點(diǎn) 是以可生物降解的膠原蛋白為主要原料，添加殼聚糖起促進(jìn)交聯(lián)、增強(qiáng)與耐降解作用；通過(guò) 控制冷凍干燥條件，得到具有特定微結(jié)構(gòu)(孔徑、孔隙率等)的多孔支架。通過(guò)改變r(jià)hGM-CSF 負(fù)載量，得到具有不同血管化速度的人工真皮替代物再生材料。結(jié)果表明該人工真皮替代 物再生材料能夠有效促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和分化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的浸入，具有良好 的組織相容性。SD大鼠皮下埋植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)能夠快速血管化(10天)。這種人工真皮替代物再 生材料可作為組織生長(zhǎng)的臨時(shí)支架，促進(jìn)創(chuàng)面的血管化，肉芽組織、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞 在多孔支架內(nèi)的生長(zhǎng)。這些長(zhǎng)入的組織或細(xì)胞會(huì)分泌出相應(yīng)的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)而分化成新的 皮膚組織，促進(jìn)受損皮膚的再生。與此同時(shí)，外源性的膠原-殼聚糖多孔支架會(huì)隨著新生組 織的不斷生長(zhǎng)而逐漸降解，并被機(jī)體吸收，最終得到的是與人體自身幾乎一致的皮膚組織。
本發(fā)明為創(chuàng)傷、燒傷和慢性皮膚潰瘍等全層皮膚缺損的治療提供了一種性能良好 的人工真皮替代物，可以顯著加速人工真皮替代物再生材料的血管化進(jìn)程、降低感染風(fēng)險(xiǎn)， 促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，減少瘢痕的增生，進(jìn)而減輕病人的痛苦?？梢詮V泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷和外 科整形等方面。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，材料來(lái)源廣泛，生產(chǎn)效率高，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。與 國(guó)外同類產(chǎn)品相比，本發(fā)明產(chǎn)品成本方面具有很大優(yōu)勢(shì)。


圖1是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架的掃描電鏡(SEM)照片。
圖2是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架在SD大鼠體內(nèi)埋植的手 術(shù)照片。
圖3是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架在SD大鼠體內(nèi)埋植7天、 14天后的大體照片，虛線代表埋植材料邊界。
圖4是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架在SD大鼠體內(nèi)埋植14 天后的大體照片，虛線代表埋植材料邊界。
圖5是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架在SD大鼠體內(nèi)埋植7天 天后的HE圖，箭頭表示血管，m表示埋植材料，X 200。
圖6是本發(fā)明負(fù)載rhGM-CSF的膠原-殼聚糖復(fù)合型支架在SD大鼠體內(nèi)埋植14 天后的HE圖，箭頭表示血管，m表示埋植材料，X 200。
具體實(shí)施方式
將膠原和殼聚糖分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%乙酸溶液，然后將膠原溶液和殼聚 糖溶液按照9 1的體積比混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，注入直徑?cm的模具中，使其高度達(dá) 1. 5mm，置于4°C下M小時(shí)后，于-20°C冷凍M小時(shí)，然后置于凍干機(jī)中凍干16小時(shí)；凍干的 支架于105°C下真空干熱交聯(lián)M小時(shí)；根據(jù)肝素與膠原質(zhì)量比為1:10的比例，將肝素添加 至摩爾濃度比為2 :1的EDC (20_ol)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4) 溶液中，再將上述凍干后的支架置于該混合液中交聯(lián)M小時(shí)，經(jīng)反復(fù)清洗后再次冷凍-凍 干得到交聯(lián)后的肝素化的膠原-殼聚糖支架(微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。
將肝素化的膠原-殼聚糖支架經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，滴加濃度為100yg/ml的 rhGM-CSF溶液300 μ 1，4°C下孵育過(guò)夜，備用。
實(shí)施例2將膠原和殼聚糖分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%乙酸溶液，然后將膠原溶液和殼聚糖溶液 按照9 1的體積比混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，注入直徑?cm的模具中，使其高度達(dá)1. 5mm，置 于4°C下M小時(shí)后，于_20°C冷凍M小時(shí)，然后置于凍干機(jī)中凍干16小時(shí)；凍干的支架于 105°C下真空干熱交聯(lián)M小時(shí)；根據(jù)肝素與膠原質(zhì)量比為1:10的比例，將肝素添加至摩爾 濃度比為2 :1的EDC (20_ol)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4)溶液 中，再將上述凍干后的支架置于該混合液中交聯(lián)M小時(shí)，經(jīng)反復(fù)清洗后再次冷凍-凍干得 到交聯(lián)后的肝素化的膠原-殼聚糖支架(微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。
將肝素化的膠原-殼聚糖支架經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，滴加濃度為200 μ g/ml的 rhGM-CSF溶液200 μ 1，4°C下孵育過(guò)夜，備用。
實(shí)施例3將膠原和殼聚糖分別配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 5%乙酸溶液，然后將膠原溶液和殼聚糖溶液 按照9 1的體積比混合后，充分?jǐn)嚢杈鶆?，注入直徑?cm的模具中，使其高度達(dá)1. 5mm，置 于4°C下M小時(shí)后，于_20°C冷凍M小時(shí)，然后置于凍干機(jī)中凍干16小時(shí)；凍干的支架于 105°C下真空干熱交聯(lián)M小時(shí)；根據(jù)肝素與膠原質(zhì)量比為1:10的比例，將肝素添加至摩爾 濃度比為2 :1的EDC (20_ol)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的0. 05M MES (pH5. 4)溶液 中，再將上述凍干后的支架置于該混合液中交聯(lián)M小時(shí)，經(jīng)反復(fù)清洗后再次冷凍-凍干得 到交聯(lián)后的肝素化的膠原-殼聚糖支架(微結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。
將肝素化的膠原-殼聚糖支架經(jīng)環(huán)氧乙烷消毒后，滴加濃度為300 μ g/ml的 rhGM-CSF溶液ΙΟΟμ 1，4°C下孵育過(guò)夜，備用。
試驗(yàn)例手術(shù)前一天，將SD大鼠背部的鼠毛剪去，然后用脫毛劑脫毛；手術(shù)時(shí)，在SD大鼠的脊 柱兩側(cè)各做兩個(gè)“囊”(見(jiàn)圖2)，間隙1cm，然后將實(shí)施例1制備得到的負(fù)載rhGM-CSF的膠 原-殼聚糖復(fù)合型支架平展地植入，縫合。于術(shù)后7天、14天取材，大體觀察及HE染色觀察 復(fù)合支架在體內(nèi)的生物學(xué)特征(見(jiàn)圖3 圖6)。大體觀可見(jiàn)大量血管分布于植入的人工真皮 替代物再生材料的表面與周圍；HE染色觀察可見(jiàn)，植入的人工真皮替代物再生材料與周圍 組織連接緊密，有豐富的血管在材料周圍及其內(nèi)部形成，周圍組織并有向植入材料浸潤(rùn)生 長(zhǎng)的趨勢(shì)。權(quán)利要求
1.負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，其特征在于該再生材料由肝 素化的膠原-殼聚糖支架負(fù)載所述rhGM-CSF溶液構(gòu)成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，其特征 在于rhGM-CSF溶液的濃度為100ng/m廣300 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料， 其特征在于肝素化的膠原-殼聚糖支架由膠原-殼聚糖支架在含肝素、EDC和NHS的MES 溶液中真空脫泡后交聯(lián)反應(yīng)，然后冷凍干燥制得，肝素與膠原-殼聚糖支架中的膠原的質(zhì) 量比為1:20 1:4，EDC和NHS的濃度比為1:1 4:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，其特征 在于膠原-殼聚糖支架中殼聚糖和膠原的質(zhì)量比為1:9飛:5。
5.一種制備權(quán)利要求1所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料的 方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)用質(zhì)量濃度為0.39Γ5%的乙酸溶液分別配制質(zhì)量濃度為0. 059Γ5%的膠原溶液和殼 聚糖溶液，將殼聚糖溶液加入膠原溶液中，充分?jǐn)嚢杈鶆?、真空脫泡后，得到膠原-殼聚糖 混合溶液；將膠原-殼聚糖共混液注入模具中，于4°C下充分作用M小時(shí)后，采用冷凍-干 燥法，在_5°C -80°C溫度下冷凍干燥，獲得膠原-殼聚糖三維多孔支架；2)將上述步驟1)所得的膠原-殼聚糖三維多孔支架在80°C 180°C下真空干熱交聯(lián)處 理24小時(shí)；3)將肝素按與膠原-殼聚糖支架中的膠原的質(zhì)量比為l:2(Tl:4的比例置于含EDC和 NHS的MES溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹颍辉賹⑸鲜霾襟E2)所得的干熱處理后的膠原-殼聚糖支 架置于該種混合液中，真空脫泡，交聯(lián)114小時(shí)；反復(fù)沖洗后，再次在_5°C -80°C溫度下冷 凍干燥，制得所述的肝素化的膠原-殼聚糖支架；4)利用注射用水或去離子水配制濃度為lOOng/m廣300μ g/ml的rhGM-CSF溶液，將膠 原-殼聚糖支架浸泡在該溶液中，4°C下靜置孵育M小時(shí)，即得到所述的負(fù)載rhGM-CSF的 組織工程皮膚真皮替代物再生材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料的方法， 其特征在于:EDC與NHS比為1:1 4:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料的方法， 其特征在于MES溶液的濃度0. 05M, pH5. 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人工真皮替代物再生材料及其制備方法。負(fù)載rhGM-CSF的組織工程皮膚真皮替代物再生材料，該再生材料由肝素化的膠原-殼聚糖支架負(fù)載所述rhGM-CSF溶液構(gòu)成。本發(fā)明還公開(kāi)了上述的再生材料的一種制備方法。本發(fā)明為創(chuàng)傷、燒傷和慢性皮膚潰瘍等全層皮膚缺損的治療提供了一種性能良好的人工真皮替代物，可以顯著加速人工真皮替代物再生材料的血管化進(jìn)程、降低感染風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，減少瘢痕的增生，進(jìn)而減輕病人的痛苦?？梢詮V泛應(yīng)用于創(chuàng)傷、燒傷和外科整形等方面。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，材料來(lái)源廣泛，生產(chǎn)效率高，適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61L27/60GK102038976SQ201110028978
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者孫華鳳, 有傳剛, 王新剛, 胡信雷, 胡行, 鄭玉蓉, 韓春茂, 高長(zhǎng)有 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)