專利名稱：苦丁茶冬青葉的提取方法、總皂苷及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種苦丁茶冬青葉的提取方法和由該方法提取的苦丁茶冬青葉總皂苷及其用途。具體地，本發(fā)明涉及一種提取苦丁茶冬青葉的總皂苷部位的方法，用該方法提取的總皂苷可用于降低膽固醇、降低血脂、抗粥樣動(dòng)脈硬化。
背景技術(shù)：
聞血脂包括聞膽固醇和聞甘油二酷，如者的危害性遠(yuǎn)遠(yuǎn)聞?dòng)诤笳?。?duì)于聞血脂而言，藥物性降脂療法是治療高脂血癥的最有效措施。目前，降低甘油三酯的有效藥物已經(jīng)很多，但降低膽固醇的有效藥物還主要為他汀類。該類藥物主要是對(duì)抗高膽固醇血癥所致的動(dòng)脈硬化，其作用機(jī)理為抑制肝臟膽固醇合成。但是長期服用他汀類藥物對(duì)肝臟和肌肉有明顯的毒性作用，同時(shí)導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶增高，少數(shù)服用者出現(xiàn)橫紋肌溶解癥和急性腎衰竭，盡管經(jīng)過了幾代藥物結(jié)構(gòu)的修飾，仍未解決其毒副作用問題?？喽〔铻閭鹘y(tǒng)的民間飲品，作為減肥、降血脂、降血壓、清熱解毒等功用的保健茶已有近千年的飲用歷史。市場上的苦丁茶品種繁多，據(jù)調(diào)查已有22種植物的葉可作為苦丁茶使用，但具體那一種苦丁茶具有較好的降血脂、降血壓等功效則不得而知，導(dǎo)致消費(fèi)者花費(fèi)了大量的金錢，但降血脂效果甚微，甚至沒有效果。

發(fā)明內(nèi)容
近年來，本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過系統(tǒng)的比較研究，發(fā)現(xiàn)只有來源于冬青屬植物的苦丁茶冬青(Ilex kudingcha C. J. Tseng)的葉具有非常明顯的降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其有效成分為皂苷類成分，同時(shí)，該植物所含的皂苷類成分的苷元也與其它來源的苦丁茶明顯不同。通過對(duì)活性成分和藥理作用進(jìn)行系統(tǒng)的研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)苦丁茶冬青葉的皂苷類成分具有明顯的降低膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其作用強(qiáng)度與他汀類藥物相當(dāng)，但其機(jī)理與他汀類藥物完全不同。此外，該類皂苷還有降低甘油三酯、抗氧化、腎保護(hù)、改善血液流變學(xué)等作用。作用機(jī)理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂機(jī)理為抑制腸道及肝臟?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的活性，從而抑制膽固醇腸道吸收。但是，按照常規(guī)中藥材提取方法提取得到的苦丁茶冬青葉提取物中異綠原酸的含量大大高于苦丁茶皂苷的含量。 而經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，異綠原酸具有升高血脂的作用。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種苦丁茶冬青葉的提取方法，該提取方法能夠?qū)⒖喽〔瓒嗳~總皂苷部位與總異綠原酸部位分離，并分別得到苦丁茶冬青葉皂苷部位含量較高的提取物和總異綠原酸部位含量較高的提取物；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供由本發(fā)明的方法提取的苦丁茶冬青葉總皂苷，其總皂苷部位含量可以達(dá)到80%以上，能夠降低血脂和抗粥樣動(dòng)脈硬化，同時(shí)對(duì)肝臟和腎臟具有保護(hù)作用；本發(fā)明的再一個(gè)目的在于， 提供上述苦丁茶冬青葉總皂苷部位在制備用于降低膽固醇、降低血脂、抗粥樣動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。針對(duì)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案
—種苦丁茶冬青葉的提取方法，該方法可以包括如下步驟(I)用50 70%的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青葉；(2)將提取液濾過并除去其中的乙醇；(3)將步驟(2)得到的溶液上大孔樹脂柱進(jìn)行吸附，然后依次用水、pH值9 11的10 30%堿性乙醇水溶液、10 30%乙醇水溶液和50 70%乙醇水溶液洗脫該樹脂柱；(4)收集用50 70%乙醇水溶液洗脫得到的溶液，濃縮、干燥即得。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，所述步驟(I)中乙醇的濃度可以優(yōu)選為55 65%，最優(yōu)選為60% ;步驟(3)中乙醇的濃度可以優(yōu)選為55 65%，最優(yōu)選為60%。在本文中，所述乙醇水溶液的濃度是指乙醇在乙醇水溶液中的體積百分比濃度。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，所述步驟(I)的回流提取的操作方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，該操作中乙醇水溶液的用量可以根據(jù)原料的量來確定，例如乙醇水溶液與原料的重量比可以為2 20 1，優(yōu)選為5 15 I ;提取的次數(shù)可以為I 8次，優(yōu)選為2 4次；每次回流提取的時(shí)間可以為O. 5 5小時(shí)，優(yōu)選為O. 5 2小時(shí)，各次回流提取的時(shí)間可以相同也可以不同，各次回流所使用的乙醇的濃度可以相同也可以不同，并且各次回流所使用的乙醇的量可以相同也可以不同。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以先使用原料重量10倍的60%乙醇回流I小時(shí)，將提取液濾過后再使用原料重量 8倍的60%乙醇回流I小時(shí)，將提取液濾過后再使用原料重量8倍的60%乙醇回流I小時(shí)， 然后將三次回流提取分離出的濾液合并。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，所述步驟(2)中除去乙醇的方法和步驟(4)中濃縮的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，例如，均可以為減壓蒸餾。步驟(4)中干燥的方法優(yōu)選為真空干燥。為了節(jié)約乙醇的用量，本發(fā)明的方法還可以包括將步驟(2)分離出的乙醇和/或步驟⑷分離出的乙醇回收，并再次用于步驟⑴的回流提取。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，所述步驟(3)中使用的大孔樹脂柱是本領(lǐng)域常用的樹脂柱，就本發(fā)明而言，優(yōu)選為苯乙烯型的大孔吸附樹脂，如D101、HPD100、HPD400A、 AB-8和NKA等型號(hào)的大孔樹脂柱。所述大孔樹脂柱的徑高比可以為I : 3 10，優(yōu)選為
I 4 7，最優(yōu)選為I : 6 ;樹脂與苦丁茶冬青葉的重量比可以為5 15 1，優(yōu)選為6 10 1，最優(yōu)選為7 I。優(yōu)選情況下，為了得到效價(jià)更高的苦丁茶冬青葉總皂苷部位，所述步驟(3)的洗脫過程可以為先用4 10柱體積水淋洗至無糖反應(yīng)；再用5 10柱體積pH值9 11 的10 30%堿性乙醇水溶液淋洗；然后用2 5體積10 30%乙醇水溶液淋洗；最后用 3 6柱體積50 70%乙醇水溶液洗脫該樹脂柱。例如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(3)為將步驟(2)得到的溶液上HPD400A大孔樹脂柱進(jìn)行吸附(樹脂柱徑高比為
I 4，樹脂與藥材的重量比為7 I)，反復(fù)上樣3次，靜止吸附30分鐘，吸附后先用水淋洗樹脂柱至無糖，再用8倍柱體積25%的堿性乙醇(pH= 10)淋洗樹脂柱，然后用3倍柱體積 25%的中性乙醇淋洗樹脂柱至中性，最后用4倍柱體積60%的乙醇洗脫該樹脂柱，將60% 乙醇洗脫液收集蒸干即得到苦丁茶冬青葉總皂苷部位。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，所述步驟(3)中的堿性乙醇水溶液的pH值可以最優(yōu)選為10。根據(jù)本發(fā)明提供的提取方法，其中，該方法還可以包括步驟(5)將用pH值9 11 的10 30%堿性乙醇水溶液和用10 30%乙醇水溶液洗脫得到的溶液合并、調(diào)節(jié)pH值2 3、濃縮、干燥，得到總異綠原酸。本發(fā)明還提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青葉總皂苷，其總皂苷部位含量可以達(dá)到80%以上，能夠降低血脂和抗粥樣動(dòng)脈硬化，同時(shí)對(duì)肝臟和腎臟具有保護(hù)作用。本發(fā)明還提供了使用上述方法提取的苦丁茶冬青葉總皂苷在制備用于降低膽固醇、降低血脂和抗粥樣動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。該苦丁茶冬青葉總皂苷既可以單獨(dú)使用， 也可以與他汀類藥物聯(lián)合使用，以提高藥效并改善他汀類藥物的毒副作用。本發(fā)明提供的苦丁茶冬青葉總皂苷具有明顯的降低膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，其作用強(qiáng)度與他汀類藥物相當(dāng)，但其機(jī)理與他汀類藥物完全不同。此外，該提取物還有降低甘油三酯、抗氧化、腎保護(hù)、改善血液流變學(xué)等作用。作用機(jī)理研究表明，苦丁茶冬青皂苷降血脂機(jī)理為抑制腸道及肝臟?；o酶A膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)的活性，從而抑制膽
固醇腸道吸收。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中
圖I為實(shí)施例I制得的樣品Al的高效液相色譜圖2為對(duì)比例I制得的樣品Cl的高效液相色譜圖3為對(duì)比例2制得的樣品C2的高效液相色譜圖4為對(duì)比例3制得的樣品C3的高效液相色譜圖5顯示苦丁茶冬青總皂苷對(duì)ApoE-/-小鼠血漿總膽固醇水平的影響；
圖6顯示苦丁茶冬青總皂苷對(duì)ApoE-/-小鼠血漿MDA水平的影響；
圖7顯示苦丁茶冬青總皂苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響；
圖8顯示苦丁茶冬青總皂苷對(duì)糞便中總膽固醇含量的影響；
圖9顯示苦丁茶冬青總皂苷對(duì)Caco-2細(xì)胞表達(dá)ACAT2mRNA的影響。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。但這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不
用于限制本發(fā)明的范圍。需要說明的是，實(shí)施例中出現(xiàn)的各種百分比濃度的乙醇，均是指相應(yīng)體積百分比濃度的乙醇水溶液。實(shí)施例I本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的苦丁茶冬青葉的提取方法。提取稱取苦丁茶冬青葉藥材O. 5Kg，分別用5L和4L 60%的乙醇回流提取并過濾兩次，回流時(shí)間分別為O. 5小時(shí)和I小時(shí)，將濾液合并；除乙醇將提取得到的濾液減壓蒸餾至無醇味，并將乙醇回收，濃縮液的相對(duì)密度為I. 06 1.08(室溫)；吸附將得到的溶液上HPD400A大孔樹脂柱吸附，樹脂柱的填充量為5Kg，徑高比為I : 4，反復(fù)上樣3次，靜止吸附30分鐘；洗雜先用4柱體積的去離子水淋洗樹脂柱至無糖；再用8柱體積的20%堿性乙醇(NaOH，pH = 10)淋洗；然后用3柱體積的20%乙醇淋洗至中性；洗脫用6柱體積60%乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫；
濃縮、干燥將洗脫液減壓蒸餾回收乙醇，然后進(jìn)行真空干燥，并將干燥后得到的固體粉碎過100目篩，得到65. 35克苦丁茶冬青葉提取物，記作Al，出膏率為13.07%。實(shí)施例2本實(shí)施例用于說明本發(fā)明提供的苦丁茶冬青葉的提取方法。提取稱取苦丁茶冬青葉藥材O. 5Kg，先后用4L體積百分比為65%的乙醇、3L 60%的乙醇及3L 50%的乙醇回流提取并過濾三次，回流時(shí)間分別為2小時(shí)、I小時(shí)和O. 5 小時(shí)，將濾液合并；除乙醇將提取得到的濾液減壓蒸餾至無醇味，并將乙醇回收，濃縮液的相對(duì)密度為I. 06 1.08(室溫)；吸附將得到的溶液上AB-8大孔樹脂柱吸附，樹脂柱的填充量為3. 5Kg，徑高比為 1:8;洗雜先用8柱體積的去離子水淋洗樹脂柱至無糖；再用10柱體積的30%堿性乙醇(NaOH，pH = 10. 5)淋洗；然后用4柱體積的30%乙醇淋洗至中性；洗脫用3柱體積65體積％乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫；濃縮、干燥將洗脫液減壓蒸餾，然后進(jìn)行真空干燥，并將干燥后得到的固體粉碎 100目篩，得到50. 31克苦丁茶冬青葉提取物，記作A2，出膏率為10.06%。對(duì)比例I本對(duì)比例用于說明洗雜過程僅用水淋洗的苦丁茶冬青葉的提取方法。按照與實(shí)施例I相同的方法進(jìn)行提取、除乙醇和吸附過程；洗雜用4柱體積的去離子水淋洗樹脂柱至無糖；洗脫用4柱體積60%乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫；濃縮、干燥將洗脫液減壓蒸餾，然后進(jìn)行真空干燥，并將干燥后得到的固體粉碎過100目篩，得到150克苦丁茶冬青葉提取物，記作Cl，出膏率為30.00%。對(duì)比例2本對(duì)比例用于說明洗雜過程僅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青葉的提取方法。按照與實(shí)施例I相同的方法進(jìn)行提取、除乙醇和吸附過程；洗雜用4柱體積的去離子水淋洗樹脂柱至無糖；再用5柱體積的10%乙醇淋洗；洗脫用4柱體積60%乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫；濃縮、干燥將洗脫液減壓蒸餾，然后進(jìn)行真空干燥，并將干燥后得到的固體粉碎過100目篩，得到110. 23克苦丁茶冬青葉提取物，記作C2，出膏率為22. 05%。對(duì)比例3本對(duì)比例用于說明洗雜過程僅用水和乙醇淋洗的苦丁茶冬青葉的提取方法。按照與實(shí)施例I相同的方法進(jìn)行提取、除乙醇和吸附過程；洗雜用4柱體積的去離子水淋洗樹脂柱至無糖；再用11柱體積的20%乙醇淋洗；洗脫用4柱體積60%乙醇將樹脂上吸附的提取物洗脫；濃縮、干燥將洗脫液減壓蒸餾，然后進(jìn)行真空干燥，并將干燥后得到的固體粉碎過100目篩，得到102. 8克苦丁茶冬青葉提取物，記作C3，出膏率為20. 56%。成分測定
一、高效液相色譜檢測(HPLC)色譜柱Kromasil100-5-C 18 (4. 6 X 250mm),流速0. 8ml/min ;檢測波長 226nm ;柱溫30°C ;流動(dòng)相乙腈-O. I %磷酸溶液，梯度洗脫，洗脫條件如表I所示表I
權(quán)利要求
1.一種苦丁茶冬青葉的提取方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(I)用50 70%的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青葉；(2)將提取液濾過并除去其中的乙醇；(3)將步驟(2)得到的溶液上大孔樹脂柱進(jìn)行吸附，然后依次用水、pH值9 11的10 30%堿性乙醇水溶液、10 30%乙醇水溶液和50 70%乙醇水溶液洗脫該樹脂柱；(4)收集用50 70%乙醇水溶液洗脫得到的溶液，濃縮、干燥即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述步驟(I)中乙醇的濃度為55 65%，最優(yōu)選為60% ;步驟(3)中乙醇的濃度為55 65%，最優(yōu)選為60%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中，所述步驟(I)中提取I 8次，優(yōu)選為2 4次；每次O. 5 5小時(shí)，優(yōu)選為O. 5 2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟(2)中除去乙醇的方法為減壓蒸餾，所述步驟(4)中濃縮的方法為減壓蒸餾；干燥的方法為真空干燥。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟(3)中的大孔樹脂柱的徑高比為I : 3 10，優(yōu)選為I : 4 7，最優(yōu)選為I : 6;樹脂與苦丁茶冬青葉的重量比為 5 15 : 1，優(yōu)選為6 10 I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述步驟(3)中的堿性乙醇水溶液的pH值為10。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，該方法還包括步驟(5)將用pH值 9 11的10 30%堿性乙醇水溶液和用10 30%乙醇水溶液洗脫得到的溶液合并、調(diào)節(jié) pH值2 3、濃縮、干燥，得到總異綠原酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中該方法還包括將步驟(2)分離出的乙醇和/或步驟(4)分離出的乙醇回收，并再次用于步驟(I)的回流提取。
9.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)的方法提取得到的苦丁茶冬青葉總皂苷。
10.權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述方法提取得到的苦丁茶冬青葉總皂苷在制備用于降低膽固醇、降低血脂和抗粥樣動(dòng)脈硬化的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種苦丁茶冬青葉的提取方法和用該方法提取的苦丁茶冬青葉總皂苷及其用途。所述提取方法包括如下步驟(1)用50～70％的乙醇水溶液回流提取苦丁茶冬青葉；(2)將提取液濾過并除去其中的乙醇；(3)將步驟(2)得到的溶液上大孔樹脂柱進(jìn)行吸附，然后依次用水、pH值9～11的10～30％堿性乙醇水溶液、10～30％乙醇水溶液和50～70％乙醇水溶液洗脫該樹脂柱；(4)將用50～70％乙醇水溶液洗脫得到的溶液濃縮、干燥即得。制得的總皂苷可以用制備用于降低膽固醇、降低血脂和抗粥樣動(dòng)脈硬化的藥物。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102600214SQ20111002602
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者唐麗, 姜勇, 屠鵬飛, 張彤梅, 車彥云, 鄭嬌, 馬治中, 高雅 申請(qǐng)人:北京大學(xué)