專利名稱：純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過從含有聚乙二醇化(PEGylated)蛋白質(zhì)的樣品中去除雜質(zhì)來純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)(特別是，但不專指維生素K依賴性凝血因子例如因子IX (FIX))的方法，涉及用所述方法純化的蛋白質(zhì)，以及涉及所述純化后的蛋白質(zhì)在治療中的用途，特別但并非唯一地涉及所述純化后的蛋白質(zhì)在用于治療由凝血因子減輕的疾病中的用途，所述治療例如血友病的預(yù)防性治療。
背景技術(shù)：
凝血是包括多種血液組分或因子的復(fù)雜相互作用的過程，這最終導(dǎo)致血纖蛋白血塊。通常，參與被稱為凝血“級聯(lián)”的血液組分為酶原(proenzyme或zymogen),即通過激活劑的作用而被轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍姿饷傅臒o酶活的蛋白，所述激活劑本身為活化凝血因子。經(jīng)過所述轉(zhuǎn)變后的凝血因子通常情況下稱作“活性因子”，并通過加上小寫“a”后綴來命名(例如因子 Vila)。需要活化因子(〃Xa〃)來將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟福潆S后將血纖蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)檠w蛋白，這作為形成血纖蛋白血塊的最后階段。有兩個系統(tǒng)或途徑促進(jìn)因子X的活化?！皟?nèi)源途徑”是指通過利用僅存在血漿中的因子而致使凝血酶生成的那些反應(yīng)。一系列由蛋白酶介導(dǎo)的活化最終生成因子IXa，其與因子VIIa —起將因子X裂解為因子Xa。相同的蛋白水解通過在凝血的“外源途徑”中的因子VIIa與其輔因子，組織因子來實現(xiàn)。組織因子為膜結(jié)合蛋白，并且通常不在血漿內(nèi)循環(huán)。然而當(dāng)血管破裂時，在Ca2+與磷脂存在下，其可與因子VIIa復(fù)合以催化因子X活化或因子IX活化。兩種凝血途徑在止血中的相對重要性尚不明確。因子IXa (FIXa)是胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，其通過生成作為X酶復(fù)合物一部分的大多數(shù)因子Xa而在止血過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，凝血期間需要所述因子Xa來支持凝血酶的正確生成(Hoffman M 和 Monroe D. Μ. , III (2001) A cell-based model ofhemostasis. Thromb Haemost 85, 958-965中的綜述)。因子IXa活性的先天性缺乏是X-連鎖的出血障礙血友病B的原因，所述血友病B影響約1:100,000的男性。這些血友病患者目前主要通過用重組或血漿-來源的凝血因子IX的替代療法來治療。因子IX為維生素K依賴性凝血因子，其在結(jié)構(gòu)上與因子VII、因子X和蛋白C相似。血漿半衰期為約18至30小時的循環(huán)的酶原形式由415個氨基酸組成，其可分為4個不同的結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包括N末端的富含Y-羧基谷氨酸(Gla)結(jié)合域，兩個EGF結(jié)構(gòu)域，和C末端胰蛋白酶-樣絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域。因子IX的活化通過以下而發(fā)生在Arg145-Ala146和Arg18tl-Val181的有限蛋白水解釋放35個氨基酸的片段，即所謂的激活肽(Schmidt A. E.和Bajaj S. P. (2003) Structure-function relationships in Factor IX and FactorIXa. Trends Cardiovasc Med 13，39-45)。此激活肽高度糖基化，其包含個N連接和多達(dá)4個O連接聚糖。
蛋白質(zhì)循環(huán)半衰期的延長可通過修飾蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)。聚乙二醇化是已建立的一種用于延長蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期的方法。因子IX (FIX)的糖聚乙二醇化(GlycoPEGylation)生成多種聚乙二醇化物質(zhì)，例如單、二和三-聚乙二醇化物質(zhì)。如此的組合因而為形成多種單聚乙二醇化和二聚乙二醇化物質(zhì)提供了可能性。單聚乙二醇化形式已被鑒定為具有期需的藥理學(xué)概況(profile)，并因而被選為優(yōu)選的藥物候選物。因此，從聚乙二醇化和非聚乙二醇化物質(zhì)的混合物中分離單聚乙二醇化形式是期需的。除了聚乙二醇化物質(zhì)彼此分離及其與非聚乙二醇化物質(zhì)的分離之外，純化過程還必須提供充分減少的反應(yīng)中所使用試劑。開發(fā)一種保證期需產(chǎn)物質(zhì)量的方法是必要的，并且將有利的是，開發(fā)可提供充分減少的過程相關(guān)雜質(zhì)(例如聚乙二醇化試劑、酶、來自試劑的副產(chǎn)物)以及產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)(例如非聚乙二醇化物質(zhì))的單個步驟純化。US 2008/207879 (Baxter Int)描述了 rFIX的純化過程，其包括將產(chǎn)物加入陰離子交換柱，和用超過200 mM的鹽濃度洗柱子，以及用包含二價陽離子的洗脫緩沖液洗脫。發(fā)明概述 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法，其包括用洗脫緩沖液的陰離子交換色譜，其特征在于，所述色譜包括洗脫前的雜質(zhì)去除步驟，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括用酸性緩沖液對所述陰離子交換柱進(jìn)行洗滌。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了純化的聚乙二醇化因子IX凝血因子，其可通過本文闡述的方法獲取。附圖
簡述
圖I展示了用本發(fā)明純化方法所得到的色譜圖。發(fā)明詳述
根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法，其包括用洗脫緩沖液的陰離子交換色譜，其特征在于，所述色譜包括洗脫前的雜質(zhì)去除步驟，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括用酸性緩沖液對所述陰離子交換柱進(jìn)行洗滌。本發(fā)明的純化方法相較于之前描述的純化方法擁有眾多優(yōu)勢。意想不到地發(fā)現(xiàn)，在洗滌期間盡管存在酸性緩沖液，但聚乙二醇化蛋白質(zhì)(例如FIX)仍然與樹脂結(jié)合。迄今為止純化因子(聚乙二醇化蛋白質(zhì)濃度與雜質(zhì)濃度之比)意想不到地高。例如在本發(fā)明中，所得級分中ST3Gal3的含量顯著降低。ST3Gal3為在糖聚乙二醇化過程期間使用的聚乙二醇化酶。在所得級分中存在此酶顯然是非期需的，這是因為在接下來的純化過程中可出現(xiàn)進(jìn)一步聚乙二醇化。此外，將殘余的酶視為雜質(zhì)，并且在單聚乙二醇化rFIXa的藥物制劑中將殘余的酶量降到非常低的水平是期需的。本發(fā)明的酸性洗滌步驟還提供了滅活樣品中可能存在的任何pH敏感病毒的優(yōu)勢。本發(fā)明還提供了使單個色譜步驟的純化得以進(jìn)行的額外優(yōu)勢。聚乙二醇化蛋白質(zhì)可通過文獻(xiàn)中已知且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法之一獲得。WO2005/055950和WO 2006/127896描述了 FIX的聚乙二醇化方法，其中將PEG基團(tuán)經(jīng)酶連接
到糖基上。用本發(fā)明方法進(jìn)行純化的聚乙二醇反應(yīng)混合物可經(jīng)由糖聚乙二醇化或其它已知的聚乙二醇化方法獲得。盡管聚乙二醇化蛋白質(zhì)的純化構(gòu)成本發(fā)明的特定方面，但所述方法亦可同樣應(yīng)用于與除PEG外的聚合物(例如聚唾液酸)連接的蛋白質(zhì)純化。在一個實施方案中，所連接的PEG基團(tuán)大小在約2至約40 kD之間變化。
在一個實施方案中，通過酸性洗滌步驟去除的雜質(zhì)為ST3Gal3。在一個實施方案中，雜質(zhì)去除步驟包括用pH在3. 8至5. O之間(即在下列任一pH 3. 9、4· 0、4· 1、4· 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9 或 5· O)，例如在 4. O 至 4. 5 之間(即在下列任一 pH :4. 0、4. 1、4. 2、4. 3、4. 4或4. 5)，例如在4. 0至4. 4之間，特別為4. I至4. 3之間，更特別為4. 1、4. 2或4. 3的酸性緩沖液洗滌。在低于4. 5的pH下進(jìn)行雜質(zhì)去除步驟的優(yōu)勢為由于存在Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域，聚乙二醇化蛋白質(zhì)在所述pH下將緊密地結(jié)合，因此，酸性洗滌可用于降低等電點(diǎn)高于聚乙二醇化蛋白質(zhì)的其它雜質(zhì)濃度。將理解的是，緩沖液包含任何能夠降低pH值至約4. 5以下的合適緩沖液，然而，適宜地所述緩沖液將不包含二價陽離子 。在一個實施方案中，酸性緩沖液包含乙酸鈉和/或乙酸。在另一實施方案中，酸性緩沖液包含50 mmol乙酸鈉和140 mmol乙酸。將理解的是，可使用更低濃度的乙酸鈉或乙酸，然而，保持這兩個組分的比率恒定是重要的，并且酸性洗滌步驟足夠長以將PH降至4. 5以下。將理解的是，酸性洗滌步驟在洗脫之前和上樣至陰離子交換柱之后實施。在一個實施方案中，平衡化步驟在上樣步驟之前實施。進(jìn)行平衡化步驟的好處在于未結(jié)合的聚乙二醇化蛋白質(zhì)經(jīng)過陰離子交換柱洗掉。在另一實施方案中，平衡化步驟包括了在PH 5至7之間的平衡緩沖液的施用。在PH 5至7之間實施平衡化步驟的優(yōu)勢在于在此pH下雜質(zhì)CAM-NAN意想不到地不與陰離子交換柱結(jié)合,因而在穿流液(flowthrough)中被去除。在一個實施方案中，第二平衡化步驟實施于酸性洗滌步驟之前，但將理解的是所述第二平衡化步驟可以被忽略(例如，酸性洗滌步驟可直接在上樣步驟之后)。在酸性洗滌步驟之前實施平衡化步驟的優(yōu)勢在于ST3Gal3在從平衡條件(例如pH 5至7之間)和酸性洗滌條件(例如pH 4至4. 5之間)的pH變化或pH梯度下選擇性地被洗脫。在又一實施方案中，平衡化步驟包括施用PH 6的平衡緩沖液，例如pH 6的含有組氨酸的緩沖液。在一個實施方案中，所述平衡緩沖液包含乙酸鈉和乙酸。在另一實施方案中，所述平衡緩沖液包含10 mM乙酸和90 mM乙酸鈉。將理解的是，聚乙二醇化樣品在平衡化步驟之后將上樣至陰離子交換柱(即在平衡化步驟之后但在酸性洗滌步驟之前)。聚乙二醇化樣品也可在PH 4-4. 5的酸性洗滌步驟期間直接上樣，然而，盡管這會致使ST3Gal3結(jié)合的顯著減少，但亦可能的是，陰離子交換柱結(jié)合聚乙二醇化樣品的能力可被降低。在一個實施方案中，第三平衡化步驟在酸性洗滌之后但在洗脫之前實施。在一個實施方案中，聚乙二醇化蛋白質(zhì)為維生素K依賴性蛋白質(zhì)，例如維生素K依賴性凝血因子。在另一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子包括含半乳糖的凝血因子。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子選自因子II (FII)、因子VII(FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子為因子IX (FIX)或因子VII (FVII)。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子為因子IX (FIX)。在本發(fā)明上述任一方面的實施方案中，所述因子IX選自WO 03/031464、US2005/0106658、WO 2004/099231、US 2004/0132640、US 2005/0100982,US 2004/0137557、US 2006/0030521,US 2004/006391KUS 2006/0040856,WO 2005/055950,WO 2006/127896和TO 2008/119815中公開的非限定因子IX衍生物的任一種。在另一實施方案中，所述因子IX為PEG40k-FIX，如在WO 2008/119815的實施例I中描述的。在一個實施方案中，在凝血因子IX為PEG40k_FIX的情況下，雜質(zhì)去除步驟中的酸性緩沖液的pH值下限為約pH 3. 7 - 3. 8，這是因為PEG40k-FIX在此pH下洗脫。將理解的是，陰離子交換色譜可依據(jù)技術(shù)人員所知的方法實施。合適陰離子交換材料的實例包括Q-樹脂(Q-resin)、 季胺和DEAE樹脂、二乙氨基乙烷(DiEthylAminoEthane)。陰離子交換樹脂可市購，例如Mono Q Source 15Q或30Q(GE-health care)> Poros 20HQ 或 50HQ (Applied Biosystems)> Toyopearl Q650S (TosoHaas)以及其它。在一個實施方案中，所述陰離子交換材料包括HQ，例如Poros HQ，例如Poros 50HQ。Poros HQ可從Applied Biosystems獲得,其基于產(chǎn)生高容量的季銨化聚乙烯亞胺官能團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其可通過本文闡述的方法獲取。在一個實施方案中，所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為維生素K依賴性蛋白質(zhì)，例如維生素K依賴性凝血因子。在另一實施方案中，所述維生素依賴性K凝血因子包括含半乳糖的凝血因子。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子選自因子II (FII)、因子VII(FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子為因子IX (FIX)或因子VII (FVII)。在又一實施方案中，所述維生素K依賴性凝血因子為因子IX (FIX)。在一個實施方案中，純化后的蛋白質(zhì)，例如單聚乙二醇化維生素K依賴性蛋白質(zhì)基本上不含ST3Gal3。“基本上不含”是指所述單聚乙二醇化維生素K依賴性蛋白質(zhì)含有少于 100 ng/mL 的 ST3Gal3。在一個實施方案中，純化后的蛋白質(zhì)，例如單聚乙二醇化維生素K依賴性蛋白質(zhì)基本上不含多聚乙二醇化物質(zhì)?！盎旧喜缓笔侵竼尉垡叶蓟S生素K依賴性蛋白質(zhì)含有少于20%的多聚乙二醇化物質(zhì)，例如少于15%，或少于10%或少于5%、少于3%、少于2%或少于1%。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有本文闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)(例如純化的因子IX)的藥物組合物。純化凝血因子和包含凝血因子的藥物組合物可用于治療通過給予凝血因子(例如FIX)而減輕的疾病，所述疾病例如出血障礙(bleeding disorder),例如血友病、血液病、關(guān)節(jié)積血(hemarthrosis)、血腫、粘膜出血、遺傳性血液病、家族性出血障礙、家族性血液病或因子替代療法。在一個實施方案中，通過給予凝血因子而減輕的疾病為血友病，例如血友病B或克里斯馬斯病(Christmas disease)。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療血友病的方法，其包括給予患者如前所述的治療有效量的純化凝血因子。亦提供了用于治療血友病的如前所述的純化凝血因子。 亦提供了如前所述的純化凝血因子在制備用于治療血友病的藥物中的用途。亦提供了用于治療血友病的包含如前所述的純化凝血因子的藥物組合物。需要理解的是,治療性和預(yù)防性(prophylactic)(預(yù)防性(preventive))方案代表了本發(fā)明的不同方面。特別應(yīng)理解的是，本發(fā)明提供了具有更長血漿半衰期的純化凝血因子，從而使其適于血友病的預(yù)防性治療。此血友病的預(yù)防性治療構(gòu)成了本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。制劑可進(jìn)一步包括緩沖液系統(tǒng)、防腐劑、張度劑(tonicity agent)、螯合劑、穩(wěn)定劑和表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，藥物制劑為水性制劑，例如含水的制劑。這樣的制劑通常為溶液或混懸液。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物制劑為水溶液。在一個實施方案中，所述藥物制劑為凍干制劑，醫(yī)生或患者在使用之前向其加入溶劑和/或稀釋劑。
在一個實施方案中，所述藥物制劑為干燥制劑(例如凍干或噴霧干燥的)，其無需任何溶解即可使用。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的純化凝血因子水溶液和緩沖液的藥物制劑，其中所述純化凝血因子以O(shè). 1-100 mg/ml的濃度存在，和其中所述制劑具有約2. O至約10. O的pH。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑的pH選自包括以下的列表2. 0、2. 1、2. 2、2. 3、2· 4、2· 5、2· 6、2· 7、2· 8、2· 9、3· 0、3· 1、3· 2、3· 3、3· 4、3· 5、3· 6、3· 7、3· 8、3· 9、4· 0、4· I、4. 2、4· 3、4· 4、4· 5、4· 6、4· 7、4· 8、4· 9、5· 0、5· 1、5· 2、5· 3、5· 4、5· 5、5· 6、5· 7、5· 8、5· 9、6· O、6. I、6. 2、6. 3、6. 4、6. 5、6. 6、6. 7、6. 8、6. 9、7. O、7. I、7. 2、7. 3、7. 4、7. 5、7. 6、7. 7、7. 8、7. 9、
8.O λ 8. 1、8· 2、8· 3、8· 4、8· 5、8· 6、8· 7、8· 8、8· 9、9· 0、9· 1、9· 2、9· 3、9· 4、9· 5、9· 6、9· 7、9· 8、
9.9 和 10. O0在本發(fā)明的一個實施方案中，所述緩沖液選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、2-羥乙基-I-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(Ν-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、2_(Ν_嗎啉基)乙磺酸(MES)、N-環(huán)己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-環(huán)己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉，以及三(羥甲基)_氨基甲燒、N-二(輕乙基)甘氨酸(bicine)、曲辛(tricine)、蘋果酸、琥拍酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖液的每一種構(gòu)成了本發(fā)明備選實施方案。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含活性位點(diǎn)抑制劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含藥學(xué)上可接受的防腐劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述防腐劑選自酚、鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯丁醇，以及硫柳萊、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲(imidurea)、氯己定(chlorohexidine)、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對羥基苯甲酸乙酯、芐索氯銨、氯苯甘醚(3-對-氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，防腐劑以O(shè). I mg/ml至20 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述防腐劑以O(shè). I mg/ml至5 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述防腐劑以5 mg/ml至10 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述防腐劑以10 mg/ml至20 mg/ml的濃度存在。這些具體防腐劑的每一種組成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用防腐劑對技術(shù)人員而言是熟知的。為了方便起見可參考 Remington -.The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含等滲劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述等滲劑選自鹽類(例如氯化鈉)、糖或糖醇(sugar alcohol)、氨基酸(L_甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(alditol)(例如甘油(丙三醇)、I，2-丙二醇(propanediol 或 propyleneglycol) >1,3-丙二醇、I, 3- 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物?？墒褂萌魏翁穷惾鐔翁恰⒍腔蚨嗵腔蛩苄云暇厶?glucan)、包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖(dextran)、支鏈淀粉、糊精、環(huán)糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素鈉。在一個實施方案中糖添加劑為蔗糖。將糖醇定義為具有至少一個-OH基團(tuán)的C4-C8烴，例如甘露醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一個實施方案中糖醇添加劑為甘露醇。上面所述的糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。所用劑量無固定的限制，只要糖或糖醇在液體制劑中可溶，并且不負(fù)面地影響使用本發(fā)明方法所達(dá)到的穩(wěn)定效果即可。在 一個實施方案中，所述糖或糖醇的濃度在約I mg/ml到約150 mg/ml之間。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述等滲劑以I mg/ml到50 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述等滲劑以I mg/ml到7 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述等滲劑以8 mg/ml到24 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述等滲劑以25 mg/ml到50 mg/ml的濃度存在。這些具體的等滲劑的每一種組成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用等滲劑對技術(shù)人員而言是熟知的。為了方便起見可參考Remington The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含鰲合劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，鰲合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、檸檬酸和天冬氨酸的鹽類及其混合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述鰲合劑以0. I mg/ml到5 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述鰲合劑以0. I mg/ml到2 mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述鰲合劑以2 mg/ml到5 mg/ml的濃度存在。這些具體的鰲合劑的每一種組成了本發(fā)明的備選實施方案。在藥物組合物中使用鰲合劑對技術(shù)人員而言是熟知的。為了方便起見可參考Remington -.The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含穩(wěn)定劑。在藥物組合物中使用穩(wěn)定劑對技術(shù)人員而言是熟知的。為了方便起見可參考Remington Science and Practiceof Pharmacy,第 20 版，2000。更具體的說，本發(fā)明組合物為穩(wěn)定的液體藥物組合物，其治療活性組分包括在以液體藥物制劑存儲期間可能顯示聚集體形成的多肽?！熬奂w形成”意指多肽分子間的物理相互作用，導(dǎo)致寡聚體的形成，其可保持可溶性，或可為從溶液中沉淀出的可見的大聚集體。“存儲期間”意指液體藥物組合物或制劑一旦制備好，不是立即給予受試者。而是，制備好后，將其包裝用于存儲，以液體形式、以冷凍狀態(tài)，或以干燥形式以便后來重構(gòu)成液體形式或以其它適合給予受試者的形式?！案稍镄问健币庵敢后w藥物組合物或制劑通過以下來干燥凍干(即冷凍干燥；參見例如Williams和Polli (1984) J. Parenteral Sci.Technol. 38:48-59)、噴霧干燥(參見 Masters (1991)的 Spray-Drying Handbook (第5 版；Longman Scientific and Technical, Essez, U. K.)、第 491-676 頁;Broadhead等(1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206;和 Mumenthaler 等(1994) Pharm.Res. 11:12-20),或者風(fēng)干(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470;和Roser (1991) Biopharm. 4:47-53)。
在液體藥物組合物存儲期間多肽導(dǎo)致的聚集體形成可負(fù)面地影響該多肽的生物活性，從而導(dǎo)致該藥物組合物治療效果的喪失。此外，聚集體形成可引起其它問題，例如用輸注系統(tǒng)給予含有多肽的藥物組合物時，管、膜或泵的堵塞。
本發(fā)明藥物組合物還可包括一定量的氨基酸堿，其足以降低在組合物存儲期間多肽導(dǎo)致的聚集體形成。“氨基酸堿”意指氨基酸或氨基酸組合，其中任何給定氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在。當(dāng)使用氨基酸組合時，所有的氨基酸可以其游離堿形式存在、所有氨基酸可以其鹽形式存在或者一些可以其游離堿形式存在而其它以其鹽形式存在。在一個實施方案中，用于制備本發(fā)明組合物的氨基酸為那些攜帶帶電側(cè)鏈的氨基酸，例如精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸(例如甲硫氨酸、組氨酸、咪唑、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸及其混合物)的任何立體異構(gòu)體(即L、D或其混合物)或這些立體異構(gòu)體的組合，可存在于本發(fā)明的藥物組合物中，只要特定的氨基酸以其游離堿形式或其鹽形式存在即可。在一個實施方案中使用了 L-立體異構(gòu)體。本發(fā)明組合物也可用這些氨基酸的類似物配制?！鞍被犷愃莆铩币庵笌砥谛枳饔眉唇档捅景l(fā)明液體藥物組合物存儲期間多肽導(dǎo)致的聚集體形成的天然存在氨基酸的衍生物。合適的精氨酸類似物包括，例如，氨基胍、鳥氨酸和N-單乙基L-精氨酸，合適的甲硫氨酸類似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，以及合適的半胱氨酸類似物包括S-甲基-L-半胱氨酸。和其它氨基酸一樣，氨基酸類似物以其游離堿形式或其鹽形式包含在組合物中。在本發(fā)明的一個實施方案中，所使用的氨基酸或氨基酸類似物的濃度足以防止或延遲蛋白質(zhì)聚集體的形成。在本發(fā)明的一個實施方案中，當(dāng)作為治療劑的多肽為至少包含一個易受下述氧化影響的甲硫氨酸殘基的多肽時，可添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或氨基酸類似物)來抑制甲硫氨酸殘基氧化至甲硫氨酸亞砜?！耙种啤币庵讣琢虬彼嵫趸奈镔|(zhì)隨時間的最小積累。抑制甲硫氨酸氧化導(dǎo)致更大程度上保持多肽為其正確分子形式。任何甲硫氨酸的立體異構(gòu)體(L、D或其混合物)或其組合均可使用。添加的量應(yīng)為足以抑制甲硫氨酸殘基氧化的量，使得甲硫氨酸亞砜的量對于調(diào)節(jié)劑是可接受的。通常，這意味著組合物包含不超過約10%到約10%的甲硫氨酸亞砜。一般來說，這可以通過添加甲硫氨酸來實現(xiàn)，使得添加到甲硫氨酸殘基的甲硫氨酸比率范圍為約1:1到約1000:1，例如10:1到約100:1。 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含選自高分子量聚合物或低分子化合物的穩(wěn)定劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述穩(wěn)定劑選自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基_/羥基纖維素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL, HPC-L和HPMC)、環(huán)糊精、含硫物質(zhì)例如硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲硫基乙醇和不同的鹽(例如氯化鈉)。這些具體穩(wěn)定劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。藥物組合物還可包含其它的穩(wěn)定劑，其進(jìn)一步增加其中治療活性多肽的穩(wěn)定性。本發(fā)明特別受關(guān)注的穩(wěn)定劑包括，但不僅限于甲硫氨酸和EDTA(其保護(hù)多肽免于甲硫氨酸氧化)和非離子表面活性劑，其保護(hù)多肽免于與凍融或機(jī)械剪切相關(guān)的聚集。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述制劑還包含表面活性劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述表面活性劑選自去垢劑、乙氧基化蓖麻油、多糖酵解的(polyglycolyzed)甘油酯、乙?；瘑胃视王?、脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(例如泊洛沙姆(poloxamer)例如 Pluronic F68、泊洛沙姆 188 和 407、Triton X-100)、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物例如烷化和烷氧基化衍生物(吐溫(tween)，例如吐溫-20、吐溫-40、吐溫-80和布里杰(Brij)-35)、其單甘油酯或乙氧基化衍生物、其甘油二酯或聚氧乙烯衍生物、醇類、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、雙磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂衍生物(例如二棕櫚酰磷脂酸)和溶血磷脂衍生物(例如棕櫚酰溶血磷脂酰-L-絲氨酸和乙醇胺、膽堿、絲氨酸或蘇氨酸的I-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰膽堿的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)_衍生物，例如溶血磷脂酰膽堿的月桂酰和肉豆蘧酰衍生物、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、和極性頭部基團(tuán)的修飾物(modification)，所述極性頭部基團(tuán)即膽堿、乙醇胺、磷脂酸、絲氨酸、蘇氨酸、甘油、肌醇以及帶正電荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP，溶血磷脂酰絲氨酸和溶血磷脂酰蘇氨酸、和甘油磷脂(例如腦磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神經(jīng)酰胺、神經(jīng)節(jié)苷脂)、十二基磷酸膽堿、雞蛋溶血卵磷脂、夫西地酸的衍生物(例如?；嵌浞蛭鞯厮徕c等)、C6-C12的長鏈脂肪酸(例如油酸和辛酸)及其鹽、?；鈮A和衍生物、賴氨酸、精氨酸或組氨酸的N°-?；苌?，或賴氨酸或精氨酸的側(cè)鏈酰化衍生物、包含賴氨酸、精氨酸或組氨酸和中性或酸性氨基酸任何組合的二肽的N°-?；苌铩行园被岷蛢蓚€帶電氨基酸的任何組合的三肽的N°-?；苌?、DSS(多庫酯鈉、CAS登記號[577-11-7])，多庫酯鈣，CAS登記號[128-49-4])、多庫酯鉀，CAS登記號[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉)、辛酸鈉、膽酸或其衍生物、膽汁酸及其鹽和甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合物、熊脫氧膽酸、膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、?；悄懰徕c、甘膽酸鈉、N-十六基-N，N-二甲基-3-銨基(amm0ni0)-l-丙磺酸鹽、陰離子(烷基-芳基-磺酸鹽)單價表面活性劑、兩性離子型表面活性劑(例如N-烷基-N，N-二甲基銨基-I-丙磺酸鹽、3-膽酰胺(cholamido)-I-丙基二甲基銨基-I-丙磺酸鹽、陽離子表面活性劑(季銨堿)(例如十六燒基三甲基溴化銨、西批氯銨(cetylpyridinium chloride))、非離子表面活性劑(例如十二燒基β-D-卩比喃葡萄糖苷)、poloxamine (例如Tetronic ’ s),其為源自向乙二胺順序添加環(huán)氧丙烷和環(huán)氧乙烷的四功能的嵌段共聚物，或者所述表面活性劑可選自咪唑啉衍生物，或其混合物。這些具體表面活性劑的每一種構(gòu)成了本發(fā)明的備選實施方案。
在藥物組合物中使用表面活性劑對技術(shù)人員而言是熟知的。為了方便起見可參考Remington .,The Science and Practice of Pharmacy,第 20 版，2000。有可能其它成分可存在于本發(fā)明藥物制劑中。這樣額外的成分可包括潤濕劑、乳化劑、抗氧化劑、膨脹劑、張度調(diào)節(jié)劑(tonicity modifier)、螯合劑、金屬離子、油性溶媒、蛋白質(zhì)(例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和兩性離子(例如氨基酸，例如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。這樣額外的成分當(dāng)然不應(yīng)負(fù)面地影響本發(fā)明藥物制劑的整體穩(wěn)定性。包含本發(fā)明純化凝血因子的藥物組合物可在需要所述治療的患者的數(shù)個部位給予，所述部位例如局部，例如，皮膚和粘膜部位，在旁路(bypass)吸收的部位,例如,在動脈、在靜脈、在心臟給予，以及在涉及吸收的部位，例如，在皮膚、皮下、肌肉或在腹部中給予。本發(fā)明藥物組合物的給予可通過數(shù)個給藥途徑，例如向需要所述治療的患者經(jīng)舌給藥、舌下給藥、含服給藥、經(jīng)口給藥、口腔給藥、經(jīng)胃和腸、鼻、肺給藥，例如通過細(xì)支氣管和肺泡或其組合給藥、經(jīng)表皮、經(jīng)皮、透皮、陰道、直腸、經(jīng)眼給藥，例如通過結(jié)膜、輸尿管給藥，和胃腸外給藥。本發(fā)明藥物組合物可以數(shù)種劑型給予，例如作為溶液劑、混懸劑、乳劑、微乳劑、復(fù)合型乳劑、泡沫劑、藥膏、糊劑、硬膏劑、軟膏劑、片劑、包衣片劑、洗劑(rinse)、膠囊劑，例如硬明膠膠囊和軟明膠膠囊、栓劑、直腸用膠囊劑、滴劑、凝膠劑、噴霧劑、散劑、氣霧劑、吸入齊IJ、滴眼劑、眼用軟膏劑、眼用洗劑(ophthalmic rinse)、陰道栓劑、陰道環(huán)、陰道軟膏劑、注射液、原位轉(zhuǎn)換溶液、例如原位凝膠、原位沉降、原位沉淀、原位結(jié)晶、輸液劑和植入物。本發(fā)明組合物還可與藥物載體、藥物遞送系統(tǒng)和改進(jìn)的藥物遞送系統(tǒng)配混，或與其連接，例如通過共價、疏水和靜電相互作用，以便進(jìn)一步增強(qiáng)本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、提高生物利用度、提高可溶性、降低副作用、達(dá)到時間治療(其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知)、并且提高患者依從性或其任意組合。載體、藥物遞送系統(tǒng)和改進(jìn)的藥物遞送系統(tǒng)的實例包括，但不僅限于聚合物，例如纖維素和衍生物、多糖，例如葡聚糖和衍生物、淀粉和衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯和丙烯酸甲酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白，例如白蛋白、凝膠，例如熱膠化系統(tǒng)，例如為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的嵌段共聚物系統(tǒng)，膠束、脂質(zhì)體、微球體、納米顆粒、液晶及其分散體、L2相及其分散體(其為脂質(zhì)-水系統(tǒng)中相特性領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知)、聚合物膠束、復(fù)合型乳劑、自乳化劑、自微乳化劑、環(huán)糊精及其衍生物，和樹枝狀高分子(dendrimer)。本發(fā)明組合物可用于制備用于經(jīng)肺給予本發(fā)明肽的固體、半固體、散劑和溶液劑，所述經(jīng)肺給予使用例如定量吸入器、干粉吸入器和噴霧器，這些裝置都為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。本發(fā)明組合物特別可用于制備控釋、持續(xù)釋放、延遲釋放、延緩釋放和緩釋的藥物遞送系統(tǒng)。更具體地，但不僅限于，組合物可用于制備胃腸外控釋和持續(xù)釋放系統(tǒng)(兩個系統(tǒng)均導(dǎo)致給予量減少數(shù)倍)，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。甚至更優(yōu)選皮下給予的控釋和持續(xù)釋放系統(tǒng)。不受限于本發(fā)明的范圍，有用的控釋系統(tǒng)和組合物的實例為水凝膠、油性凝膠、液晶、聚合物膠束、微球體和納米顆粒。制備可用于本發(fā)明組合物的控釋系統(tǒng)的方法包括，但不限于，結(jié)晶、冷凝(condensat ion)、共結(jié)晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高壓均質(zhì)化、包封、噴霧干燥、微膠囊化、凝聚、相分離、溶劑蒸發(fā)以產(chǎn)生微球體、擠壓和超臨界流體工藝。一般參考可參見Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L. , ed. Marcel Dekker,New York, 2000)和 Pharmaceutical Sciences 第 99 卷Protein Formulation andDelivery (MacNally, E. J. , ed. Marcel Dekker, New York, 2000)。胃腸外給藥可通過皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或使用注射器，任選筆形注射器的靜脈內(nèi)注射來實施?；蛘?，胃腸外給藥可通過輸注泵來實施。另一選擇為這樣的組合物其可為溶液劑或混懸劑，以便以鼻或肺噴霧形式給予本發(fā)明肽。作為又一選擇，包含本發(fā)明肽的藥物組合物還可適用于透皮給予，例如通過無針注射或通過貼劑，任選離子導(dǎo)入貼劑(iontophoretic patch),或透粘膜例如含服來給予。術(shù)語“穩(wěn)定的組合物”是指具有增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性或增強(qiáng)的物 理和化學(xué)穩(wěn)定性的組合物。本文使用的術(shù)語蛋白質(zhì)組合物的“物理穩(wěn)定性”是指由于蛋白質(zhì)暴露于熱-機(jī)械應(yīng)力下和/或與不穩(wěn)定的界面和表面(例如疏水表面和界面)相互作用而使蛋白質(zhì)形成無生物活性和/或不溶性蛋白質(zhì)聚集體的趨勢。水性蛋白質(zhì)組合物的物理穩(wěn)定性通過在將裝入合適容器(例如藥筒或小瓶)中的組合物在不同的時間期間內(nèi)暴露于不同溫度下的機(jī)械/物理應(yīng)力(例如攪拌)之后借助目視檢查和/或濁度測量來評估。所述組合物的目視檢查在具有暗背景的明亮聚焦光下進(jìn)行。所述組合物的濁度通過對濁度的程度進(jìn)行目試評分排行來表征，例如等級I到3(表現(xiàn)無濁度的組合物對應(yīng)目試評分為O，和在日光下表現(xiàn)目試濁度的組合物對應(yīng)目試評分為3)。當(dāng)組合物在日光下表現(xiàn)濁度時，則將此組合物歸為就蛋白質(zhì)聚集體而言的物理上不穩(wěn)定?；蛘撸鼋M合物的濁度可通過為技術(shù)人員所熟知的簡單濁度測量法來評估。水性蛋白質(zhì)組合物的物理穩(wěn)定性還可通過使用蛋白質(zhì)構(gòu)象狀態(tài)的光譜試劑或探測物(probe)來評估。所述探測物優(yōu)選為優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)的非天然構(gòu)象異構(gòu)體的小分子。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的小分子光譜探測物的一個實例為硫黃素T。硫黃素T是廣泛用于淀粉樣原纖維檢測的熒光染料。在原纖維的存在下，并且也可能存在其它蛋白質(zhì)構(gòu)型的情況下，當(dāng)硫黃素T結(jié)合原纖維蛋白質(zhì)形式時， 其在約450 nm下產(chǎn)生新的最大激發(fā)和在約482 nm下產(chǎn)生增強(qiáng)的發(fā)射。在所述波長下未結(jié)合的硫黃素T基本上是非熒光的。其它小分子可用作蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)從天然到非天然態(tài)狀態(tài)變化的探測物。例如優(yōu)先結(jié)合蛋白質(zhì)暴露的疏水塊(hydrophobic patch)的“疏水塊”探測物。疏水塊在蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)下通常埋在其三級結(jié)構(gòu)中，但當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)開始解折疊或變性時暴露在外。這些小分子的光譜探測物的實例為芳香的疏水染料、例如蒽、吖唳、菲咯啉(phenanthroline)等。其它光譜探測物為金屬-氨基酸絡(luò)合物，例如疏水氨基酸的鈷金屬絡(luò)合物，所述疏水氨基酸例如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸等。本文使用的術(shù)語蛋白質(zhì)組合物的“化學(xué)穩(wěn)定性”是指蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中化學(xué)共價鍵改變，其導(dǎo)致與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比，生成具有潛在較低生物學(xué)效價和/或潛在升高的免疫原性的化學(xué)降解產(chǎn)物。根據(jù)天然蛋白質(zhì)的類型和性質(zhì)及蛋白質(zhì)所暴露的環(huán)境可形成多種化學(xué)降解產(chǎn)物。消除化學(xué)降解很可能不可完全避免，并且在蛋白質(zhì)組合物的存儲和使用期間往往可看到漸增量的化學(xué)降解產(chǎn)物，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。大多數(shù)蛋白質(zhì)傾向于脫酰氨基，即其中谷氨?；蛱於埢膫?cè)鏈酰胺基水解形成游離羧酸的過程。其它降解途徑包括高分子量轉(zhuǎn)變產(chǎn)物的生成，其中兩個或多個蛋白質(zhì)分子通過轉(zhuǎn)酰氨基和/或二硫鍵相互作用而彼此共價結(jié)合，導(dǎo)致共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物的生成{Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T. J. & Manning M. C., PlenumPress, New York 1992)。氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)也可提及為化學(xué)降解的另一變體。蛋白質(zhì)組合物的化學(xué)穩(wěn)定性可通過暴露于不同環(huán)境條件下后在不同時間點(diǎn)測量化學(xué)降解產(chǎn)物的量來評估(降解產(chǎn)物的生成通?？赏ㄟ^例如升高溫度來實現(xiàn))。每種單獨(dú)的降解產(chǎn)物的量通常通過使用多種色譜技術(shù)(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)依據(jù)分子大小和/或電荷來分離降解產(chǎn)物而測定。因此，如上所概述的，“穩(wěn)定的組合物”是指具有增強(qiáng)的物理穩(wěn)定性，增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性或增強(qiáng)的物理和化學(xué)穩(wěn)定性的組合物。一般來說，組合物必須在使用和存儲期間(按照推薦的使用和存儲條件)保持穩(wěn)定直到有效期限為止。在本發(fā)明的一個實施方案中，包含本發(fā)明純化蛋白質(zhì)的藥物組合物在6周以上的使用和三年以上的存儲中保持穩(wěn)定。在本發(fā)明的另一實施方案中，包含本發(fā)明純化蛋白質(zhì)的藥物組合物在4周以上的使用和三年以上的存儲中保持穩(wěn)定。在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，包含本發(fā)明純化蛋白質(zhì)的藥物組合物在4周以上的使用和兩年以上的存儲中保持穩(wěn)定。在本發(fā)明的更進(jìn)一步實施方案中，包含本發(fā)明純化蛋白質(zhì)的藥物組合物在2周以上的使用和兩年以上的存儲中保持穩(wěn)定。在本發(fā)明的更進(jìn)一步實施方案中，包含本發(fā)明純化蛋白質(zhì)的藥物組合物在I周以上的使用和六個月以上的存儲中保持穩(wěn)定。 現(xiàn)將通過參考以下非限定性實施例來描述本發(fā)明。實施例I
聚乙二醇化FIX的純化 (a)加入溶液
緩沖液交換過的聚乙二醇化FIX具有95%以上純度。加入物的pH值約為6。FIX的濃度約為I mg/mL。加入星約為5 g產(chǎn)物/L樹脂。(b)柱
Poros 50 HQj 15. 7 mL。(C)緩沖液
-平衡緩沖液10 mM乙酸、90 mM乙酸鈉，pH 5. 7
-酸性洗漆5個柱體積(CV)的酸性洗漆緩沖液乙酸鈉65 mmol/kg、乙酸185 mmol/kg, pH 4· 3 ;5個柱體積
-洗脫5個柱體積的線性梯度，從100%平衡緩沖液到100%洗脫緩沖液(10 mM組氨酸、50 mM NaCl、50 mM CaCl2)
-再生3個柱體積的I M氯化鈉 (d)程序
Mt緩麵mm %-洗脫緩沖液
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UiM 24 CV/h : 6,28 ιιι /ηι η 5 T
色譜純化程序的結(jié)果展示在圖I中，其描述了用UV280nm信號獲得的色譜圖。標(biāo)記為“ I”的峰描述了穿流液其中例如CMP-NAN被去除。標(biāo)記為“2”的峰描述了對應(yīng)于ST3Gal3的峰，即其表現(xiàn)了其中ST3Gal3被去除并且標(biāo)記為“3”的峰描述了產(chǎn)物峰。
圖I的結(jié)果清楚地展示了產(chǎn)物峰與雜質(zhì)例如ST3Gal3和CMP-Nan的明顯分離，證實了本發(fā)明方法提供的有效純化。實施方案列表
實施方案I :純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法，其包括用洗脫緩沖液的陰離子交換色譜，其特征在于所述色譜包括洗脫前的雜質(zhì)去除步驟，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括使用酸性緩沖液對所述陰離子交換柱進(jìn)行洗滌。實施方案2 :實施方案I的方法，其中連接的PEG基團(tuán)大小在約2到約40KD之間變化。實施方案3 :實施方案I或在實施方案2的方法，其中通過酸性洗滌步驟去除的雜 質(zhì)為 ST3Gal3。實施方案4 :任何前述實施方案的方法，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括使用3. 8至5. O、3. 9至4. 8或4. O至4. 5之間pH的酸性緩沖液進(jìn)行洗滌。實施方案5 :實施方案4的方法，其中所述pH為3. 9,4. O或4. I。實施方案6 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 2。實施方案7 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 3。實施方案8 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 4。實施方案9 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 5。實施方案10 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 6。實施方案11 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 7。實施方案12 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 8。實施方案13 :實施方案4的方法，其中所述pH為4. 9。實施方案14 :實施方案4的方法，其中所述pH為5.0。實施方案15 :實施方案4的方法，其中所述pH在4. O至4. 4之間。實施方案16 :實施方案4的方法，其中所述pH在4. I至4. 3之間。實施方案17 :任何前述實施方案的方法，其中所述酸性緩沖液不包含二價陽離子。實施方案18 :任何前述實施方案的方法，其中所述酸性緩沖液包含乙酸鈉和/或乙酸。實施方案19 :任何前述實施方案的方法，其中所述酸性緩沖液包含50 mmol乙酸鈉和140 mmol乙酸。實施方案20 :任何前述實施方案的方法，其中平衡化步驟實施在上樣步驟之前實施。實施方案21 :實施方案20的方法，其中所述平衡化步驟包括了 pH在5至7之間的平衡緩沖液的施用。實施方案22 :實施方案20或?qū)嵤┓桨?1的方法，其中第二平衡化步驟在酸性洗滌步驟之前實施。實施方案23 :實施方案20到22中任一項的方法，其中所述平衡化步驟包括pH為6的平衡緩沖液的施用。實施方案24 :實施方案23的方法，其中所述平衡緩沖液是pH為6的包含組氨酸的緩沖液。實施方案25 :實施方案21到24中任一項的方法，其中所述平衡緩沖液包含乙酸鈉和乙酸。實施方案26 :實施方案21到25中任一項的方法，其中所述平衡緩沖液包含10 mM乙酸和90 mM乙酸鈉。實施方案27 :實施方案22到26中任一項的方法，其中所述第三平衡化步驟在酸性洗滌之后但在洗脫之前實施。實施方案28 :前述實施方案中任一項的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為維生素K依賴性蛋白質(zhì)。實施方案29 :實施方案28的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為維生素K依賴性凝血因子。實施方案30 :實施方案28或?qū)嵤┓桨?9的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為包含半乳糖的凝血因子。實施方案31 :實施方案28到30中任一項的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為維生素K依賴性凝血因子，其選自因子II (FII)、因子VII (FVII)、因子IX (FIX)、因子X(FX)、蛋白S和蛋白C。實施方案32 :實施方案28到31中任一項的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為因子 IX (FIX)或因子 VII (FVII)。實施方案33 :實施方案28到32中任一項的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為因子 IX (FIX)。實施方案34 :實施方案28到30中任一項的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)為PEG40k-FIXo實施方案35 :前述實施方案中任一項的方法，其中陰離子交換色譜包括Q-樹脂、季胺、和DEAE樹脂、二乙氨基乙烷。實施方案36 :實施方案35的方法，其中所述陰離子交換樹脂為Mono Q Source15Q 或 30Q (GE-health care) > Poros 20HQ 或 50HQ (Applied Biosystems) > ToyopearlQ650S (Toso Haas)。實施方案37 :實施方案36的方法，其中所述陰離子交換材料包括HQ。實施方案38 :實施方案37的方法，其中所述陰離子交換材料包括Poios HQ。實施方案39 :實施方案38的方法，其中所述陰離子交換材料包括Poios 50 HQ。實施方案40 :純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其可通過前述實施方案中任一項闡述的方法獲得。實施方案41 :純化的聚乙二醇化FIX蛋 白質(zhì)，其可通過實施方案I至39中任一項闡述的方法獲得。實施方案42 :如實施方案40或?qū)嵤┓桨?1中闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其基本上不含ST3Gal3。實施方案43 :如實施方案40到42中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其含有少于 100 ng/mL 的 ST3Gal3。實施方案44 :實施方案40到43中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其基本上不含多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案45 :實施方案40到44中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于20%的多聚乙二醇 化物質(zhì)。實施方案46 :實施方案40到45中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于15%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案47 :實施方案40到46中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于10%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案48 :實施方案40到47中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于5%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案49 :實施方案40到48中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于3%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案50 :實施方案40到49中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于2%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案51 :實施方案40到50中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其包含少于1%的多聚乙二醇化物質(zhì)。實施方案52 :藥物組合物，其包含如實施方案40到51中任一項闡述的如本文闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)。實施方案53 :藥物組合物，其包含純化的聚乙二醇化因子IX蛋白質(zhì)。實施方案54 :實施方案41到51中任一項闡述的純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)或?qū)嵤┓桨?3中闡述的藥物組合物，其用于治療通過給予凝血因子(例如FIX)而減輕的疾病，例如出血障礙,例如血友病、血液病、關(guān)節(jié)積血、血腫、粘膜出血、遺傳性血液病、家族性出血障礙、家族性血液病或因子替代療法。實施方案55 :實施方案41到51中任一項闡述的純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)或?qū)嵤┓桨?3中闡述的藥物組合物，其用于治療血友病。實施方案56 :實施方案41到51中任一項闡述的純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)或?qū)嵤┓桨?3中闡述的藥物組合物，其用于治療血友病B或克里斯馬斯病。實施方案57 :治療血友病的方法，其包括給予患者實施方案41到51中闡述的治療有效量的純化凝血因子。實施方案58 :實施方案41到51中闡述的純化凝血因子在制備用于治療血友病的藥物中的用途。本文引用的所有參考，包括出版物、專利申請和專利通過引用以其整體結(jié)合到本文中，其程度與逐一并且特別地指明每一參考以通過引用結(jié)合以及在本文中以其整體闡述每一參考相同(至法律允許的最大程度)，而與本文其它地方對特定文獻(xiàn)的任何單獨(dú)提供的結(jié)合無關(guān)。在描述本發(fā)明背景下，用語“a”和“an”和“所述”以及相似對象的使用應(yīng)理解為涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)兩者，除非本文另外指出或明顯與上下文相矛盾。例如，短語“所述化合物”應(yīng)理解為是指本發(fā)明的多種“化合物”或描述的特定方面，除非另外指出。除非另外指出，本文提供的所有精確值代表相應(yīng)的近似值(例如關(guān)于特定因子或測量提供的所有示例性精確值可被認(rèn)為是亦提供了相應(yīng)的近似測量，在適當(dāng)?shù)那闆r下，以“約”來修飾)。 使用用語“包含”、“具有”、“包括”或“含有”提及某一元素或多個元素的本發(fā)明任一方面或方面的本文描述意欲給“由…組成”、“基本上由…組成”，或“基本上包含”該特定元素或多個元素的本發(fā)明相似方面或方面提供支持，除非另外說明或明顯與上下文相矛盾 (例如本文所描述的包含特定元素的組合物應(yīng)理解為亦描述了由該元素組成的組合物，除非另外說明或明顯與上下文相矛盾)。
權(quán)利要求
1.純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)的方法，其包括用洗脫緩沖液的陰離子交換色譜，其特征在于，所述色譜包括洗脫前的雜質(zhì)去除步驟，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括用酸性緩沖液對所述陰離子交換柱進(jìn)行洗滌。
2.權(quán)利要求I闡述的方法，其中所述雜質(zhì)為ST3Gal3。
3.權(quán)利要求I或權(quán)利要求2闡述的方法，其中所述雜質(zhì)去除步驟包括使用pH3. 9至4.5、4. O至4. 5或4. O至4. 4之間的酸性緩沖液洗滌。
4.前述權(quán)利要求中任一項闡述的方法，其中所述酸性緩沖液包含乙酸鈉和/或乙酸，例如50 mmol乙酸納和140 mmol乙酸。
5.前述權(quán)利要求中任一項闡述的方法，其中平衡化步驟在酸性洗滌步驟之前實施。
6.權(quán)利要求5闡述的方法，其中所述平衡化步驟包括pH在5至7之間的平衡緩沖液的施用。
7.權(quán)利要求5或權(quán)利要求6闡述的方法，其中所述平衡緩沖液包含乙酸鈉和乙酸，例如10 mM乙酸和90 mM乙酸鈉。
8.前述權(quán)利要求中任一項闡述的方法，其中所述聚乙二醇化蛋白質(zhì)選自因子II(FII)、因子VII (FVII)、因子IX (FIX)、因子X (FX)、蛋白S和蛋白C，例如因子IX (FIX)或因子VII (FVII)，特別是因子IX (FIX)，例如PEG40k-FIX。
9.前述權(quán)利要求中任一項闡述的方法,其中所述陰離子交換材料包括HQ，例如Poros HQ，例如 Poros 50 HQ。
10.可通過前述權(quán)利要求中任一項闡述的方法獲得的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，例如純化的因子IX。
11.權(quán)利要求10闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其基本上不含ST3Gal3。
12.權(quán)利要求10或權(quán)利要求11中闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)，其基本上不含CMP-NAN。
13.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求10到12中任一項闡述的純化的聚乙二醇化蛋白質(zhì)。
14.治療血友病的方法，其包括給予患者權(quán)利要求10到12中任一項闡述的治療有效量的單-聚乙二醇化因子IX。
15.權(quán)利要求10到12中任一項闡述的純化的因子IX，其用于治療血友病。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過從含有聚乙二醇化蛋白質(zhì)的樣品中去除雜質(zhì)來純化聚乙二醇化蛋白質(zhì)(特別是，但不專指維生素K依賴性凝血因子例如因子IX(FIX))的方法，涉及用所述方法純化的蛋白質(zhì)，以及涉及所述純化后的蛋白質(zhì)在治療中的用途，特別但并非唯一地涉及所述純化后的蛋白質(zhì)在用于治療由凝血因子減輕的疾病中的用途，所述治療例如血友病的預(yù)防性治療。
文檔編號A61P7/04GK102639553SQ201080053284
公開日2012年8月15日 申請日期2010年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月24日
發(fā)明者A.博格斯內(nèi)斯, L.塞耶斯加爾德, M.K.D.韋恩達(dá)爾 申請人:諾沃—諾迪斯克保健股份有限公司