專利名稱：用作藥物的能夠恢復(fù)肌肉強(qiáng)度的修飾的聚集蛋白片段的制作方法
用作藥物的能夠恢復(fù)肌肉強(qiáng)度的修飾的聚集蛋白片段
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用作藥物的修飾的聚集蛋白片段。另外，本發(fā)明涉及修飾的聚集蛋白片段用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療不同的、特別是肌肉或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病，也用于治療其它的神經(jīng)胰蛋白酶相關(guān)的疾病。此外，本發(fā)明涉及修飾的聚集蛋白片段用于治療不同的疾病的用途。最后，本發(fā)明涉及包含修飾的聚集蛋白片段的藥物組合物并涉及特別修飾的聚集蛋白片段。60或60歲以上的老年人面臨著不可抗拒的瘦體重(lean body mass)下降的問題。因?yàn)檫@是常見的，所以長期以來沒有值得去研究其根本機(jī)理。目前，瘦體重的年齡相關(guān)下降被稱作少肌癥(sarcopenia)或虛弱(frailty)。就在老年人中的功能性和獨(dú)立性而言，少肌癥和虛弱二者都是高度相關(guān)的實(shí)體。 少肌癥被認(rèn)為是退行性的與年齡相關(guān)的肌肉質(zhì)量和強(qiáng)度的下降，在其晚期導(dǎo)致虛弱和失能。少肌癥患者的肌肉質(zhì)量下降速率顯著高于不受該疾病影響的人。少肌癥不是靜態(tài)病況， 而是隨著年齡而加劇。由于其進(jìn)展緩慢，人們一般不知曉少肌癥，直至其已經(jīng)達(dá)到了晚期。少肌癥的肌肉質(zhì)量的特征在于肌肉纖維數(shù)目的持續(xù)收縮。纖維大小更加異質(zhì)， 并觀察到纖維類型分組。纖維類型分組被認(rèn)為是由重復(fù)性的去神經(jīng)支配/神經(jīng)再支配 (denervation/reinnervation)引起的。另外，老齡化肌肉的特征在于脂肪和結(jié)締組織的浸潤。所有這些引起肌肉強(qiáng)度和移動(dòng)速度的下降。在很多肌肉中觀察到的與年齡相關(guān)的變化被認(rèn)為在某種程度上是由他們的肌肉纖維的神經(jīng)支配中的與年齡相關(guān)的變化引起的。在衰老過程中，觀察到功能運(yùn)動(dòng)單元(MU)的估計(jì)數(shù)目的顯著性和漸進(jìn)性下降。類似地，在患有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病例如肌萎縮側(cè)索硬化(ALQ或較低嚴(yán)重形式的脊髓性肌萎縮(SMA)的個(gè)體中觀察到與MU的大量喪失相關(guān)的明顯的肌肉強(qiáng)度下降。肌肉纖維的去神經(jīng)支配/神經(jīng)再支配循環(huán)需要突觸可塑性。突觸可塑性的過程尚未被詳細(xì)地理解。然而，在過去數(shù)年中，鑒定了神經(jīng)肌肉連接(NMJ)的形成和維持中的幾個(gè)關(guān)鍵參預(yù)者(Song and Balice-Gordon, 2008) 0已經(jīng)良好表征的蛋白，聚集蛋白(Agrin) (Bezakova and Ruegg，2003)，通過輔助發(fā)育中的NMJ的突觸后部件的形成和維持而在突觸形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。聚集蛋白是大的類肝素蛋白聚糖，具有400_600kDa的分子量(數(shù)據(jù)庫登記號(hào) NP_940978)。蛋白核心由大約2000個(gè)氨基酸組成，其質(zhì)量是大約225kDa。其是多結(jié)構(gòu)域蛋白，由9個(gè)K Gomitz型)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)LE (層粘連蛋白-EGF-樣)結(jié)構(gòu)域、1個(gè)SEA (精子蛋白，腸激酶和聚集蛋白)結(jié)構(gòu)域、4個(gè)EG(表皮生長因子樣)結(jié)構(gòu)域和3個(gè)LG(層粘連蛋白球形)結(jié)構(gòu)域組成(圖1)。聚集蛋白是非常重要的蛋白，聚集蛋白缺陷型小鼠由于呼吸衰竭而在出生時(shí)死亡。這是由下列事實(shí)造成的聚集蛋白是肌肉纖維的正確神經(jīng)支配所必需的，這些小鼠不能建立正確的NMJ。聚集蛋白以數(shù)種剪接變體的形式存在，可以以包含N-末端NtA (N-末端聚集蛋白) 結(jié)構(gòu)域的分泌蛋白的形式表達(dá)，這是最豐富的聚集蛋白的形式，是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中表達(dá)的主要形式。聚集蛋白在神經(jīng)元的胞體中產(chǎn)生，沿軸突向下轉(zhuǎn)運(yùn)，并從運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的軸突末端釋放進(jìn)入NMJ的突觸間隙。在那里其作為LRP4的激動(dòng)劑發(fā)揮作用，也可以成為基底層的成分。 在CNS中，多數(shù)聚集蛋白通過在N末端的替代性剪接而表達(dá)為缺少N-末端NtA結(jié)構(gòu)域的II 型跨膜蛋白(Bezakova and Ruegg，2003)。聚集蛋白中的富含絲氨酸/蘇氨酸(S/T)的區(qū)段負(fù)責(zé)高度糖基化，包括數(shù)個(gè)糖基化和葡糖胺聚糖附著位點(diǎn)，產(chǎn)生大質(zhì)量的蛋白聚糖。聚集蛋白的C-末端的、75kDa的部分 (從第一 EG結(jié)構(gòu)域開始)是肌肉細(xì)胞上的乙酰膽堿受體(AChR)簇集活性中的完整活性所需的，雖然最C-末端的20kDa的片段足以誘導(dǎo)AChR聚集(Bezakova and Ruegg，2003)。聚集蛋白的相互作用伴侶(包括α-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、肝素、一些整合素和LRP4)的幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)定位于C-末端區(qū)域。大的硫酸類肝素側(cè)鏈?zhǔn)歉嗡亟Y(jié)合蛋白、例如一些生長因子的結(jié)合位點(diǎn)。在人聚集蛋白的C-末端部分有2個(gè)替代性剪接位點(diǎn)y和ζ。在y位點(diǎn)處可以有 0，4，17或2K4+17)個(gè)氨基酸的插入物，在ζ位點(diǎn)處可以有0，8，11或19(8+11)個(gè)氨基酸的插入物。y位點(diǎn)中的4個(gè)插入的氨基酸的功能是創(chuàng)建肝素結(jié)合位點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元主要表達(dá)y4聚集蛋白。就NMJ的成熟而言，聚集蛋白的最重要的剪接位點(diǎn)是ζ位點(diǎn)，其賦予聚集蛋白作為有活性的乙酰膽堿受體簇集劑的能力。眾所周知，在存在剪接位點(diǎn)y中的4個(gè)氨基酸插入物的情況下，在ζ位點(diǎn)包含8個(gè)氨基酸的插入物的全長聚集蛋白(HzS)產(chǎn)生在培養(yǎng)的肌管簇集測(cè)驗(yàn)中具有35pM的半數(shù)最大AChR簇集活性的聚集蛋白變體。11個(gè)氨基酸的插入引起產(chǎn)生5nM的半數(shù)最大AChR簇集活性，而19個(gè)氨基酸的插入引起產(chǎn)生IlOpM的半數(shù)最大AChR簇集活性。在該位點(diǎn)不具有插入物的聚集蛋白在體外培養(yǎng)的肌管上的乙酰膽堿受體聚集中是無活性的(Bezakova and Ruegg，2003)。因此，簇集測(cè)驗(yàn)中最有活性的聚集蛋白形式是y4z8變體，其由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表達(dá)。發(fā)現(xiàn)包含LG2、EG4和LG3結(jié)構(gòu)域的聚集蛋白的 40kDa的C-末端片段(HzS)在 AChR簇集中有活性，在AChR簇集活性中的EC50為130pM，而較短的片段僅具有較低活性。 具有z8插入物的C-末端LG3結(jié)構(gòu)域顯示出僅13nM的半數(shù)最大AChR簇集活性，是40kDa 片段的 1/100 (Bezakova and Ruegg，2003)。在NMJ的發(fā)育和成熟過程中，聚集蛋白是乙酰膽堿受體的簇集中涉及的分子的重要參預(yù)者。雖然NMJ被神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿去穩(wěn)定化，但是，由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元分泌的聚集蛋白通過MuSK的磷酸化使AChR的聚簇穩(wěn)定化并增加，MuSK是酪氨酸激酶的膜結(jié)合受體。聚集蛋白與MuSK之間的相互作用據(jù)推測(cè)是通過LRP4介導(dǎo)的，LRP4是低密度脂蛋白受體(LDLR) 相關(guān)的蛋白。發(fā)現(xiàn)相對(duì)于聚集蛋白(y4z0)而言，聚集蛋白(HzS)與LRP4的親和性高10 倍，這使得在體外培養(yǎng)的肌管測(cè)驗(yàn)中觀察到不同的聚集蛋白剪接變體的差別性AChR簇集活性。在與聚集蛋白結(jié)合之后，LRP4引起MuSK的自我磷酸化，然后其激活乙酰膽堿受體的表達(dá)和簇集的信號(hào)級(jí)聯(lián)。神經(jīng)胰蛋白酶被發(fā)現(xiàn)于脊髓提取物中，是由運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生的。神經(jīng)胰蛋白酶是分泌的、胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，其是由CNS神經(jīng)元以及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元產(chǎn)生的(St印han等人，2008)。神經(jīng)胰蛋白酶包含N-末端的非催化部分，包含富含脯氨酸的堿性(PB)區(qū)段、 kringle(KR)結(jié)構(gòu)域、4個(gè)清道夫受體富含半胱氨酸(SRCR)的結(jié)構(gòu)域和C末端蛋白酶結(jié)構(gòu)域(Gsctwend等人，1997)。在人類中，外顯子7中的4bp的刪除導(dǎo)致嚴(yán)重的非綜合征的精神發(fā)育遲滯。該突變導(dǎo)致產(chǎn)生缺少蛋白酶結(jié)構(gòu)域的神經(jīng)胰蛋白酶的截短形式，因此使該酶失去蛋白水解功能。目前，聚集蛋白是神經(jīng)胰蛋白酶的唯一已知的靶標(biāo)。神經(jīng)胰蛋白酶在2個(gè)被稱作 α位點(diǎn)和β位點(diǎn)的不同位點(diǎn)切割聚集蛋白(圖1)。α位點(diǎn)相對(duì)于SEA結(jié)構(gòu)域位于N-末端，β位點(diǎn)位于聚集蛋白的LG3結(jié)構(gòu)域的前面。在α位點(diǎn)處的切割產(chǎn)生 IOOkDa C-末端聚集蛋白片段，其在4-12%biS-triS SDS凝膠中跑膠為 130kDa。在β位點(diǎn)處的切割釋放C-末端的LG3結(jié)構(gòu)域，其在凝膠中跑膠為 22kDa (Molinari等人，2002 ；Reif等人，
2007)。所有的C-末端片段在小鼠的腦提取物和脊髓提取物中都可檢測(cè)到(St印han等人，
2008)。在神經(jīng)胰蛋白酶敲除的小鼠中，檢測(cè)不到任何所述片段。因此，神經(jīng)胰蛋白酶似乎是在所述兩個(gè)切割位點(diǎn)以顯著的數(shù)量切割聚集蛋白的唯一蛋白酶。神經(jīng)胰蛋白酶對(duì)聚集蛋白的切割促成神經(jīng)肌肉的可塑性和重塑。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)神經(jīng)胰蛋白酶(NT)的小鼠、即所謂的少肌癥小鼠(muslik，M491S) (Stephan等人，2008)顯示出少肌癥的早期發(fā)作。從少肌癥小鼠的全身分析得出的詳細(xì)發(fā)現(xiàn)證明存在與人類數(shù)據(jù)的良好關(guān)聯(lián)。US 12/007，擬8給出了關(guān)于動(dòng)物模型的描述。簡(jiǎn)而言之，少肌癥小鼠(muslik M491S)顯示出(i)小鼠膈的神經(jīng)纖維向著各個(gè)終板生長；(ii)膈肌肉上的片斷化的終板，最終導(dǎo)致各個(gè)終板的消失，即突觸前和突觸后位點(diǎn)的喪失；(iii)在過表達(dá)神經(jīng)胰蛋白酶的動(dòng)物中，小鼠比目魚肌中的纖維數(shù)目的減少和纖維大小的勻質(zhì)性的降低。少肌癥小鼠具有減少的纖維數(shù)目(約30%)和增加的纖維大小的不勻質(zhì)性。在WO 97/21811中提出，在治療影響肌肉的疾病中使用聚集蛋白或聚集蛋白片段。然而，到目前為止，此類嘗試未顯示出成功。本發(fā)明的目標(biāo)是提供用于涉及功能性NMJ和/或運(yùn)動(dòng)單元(MU)的減少的不同的肌肉病癥的治療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一般地提供了新的工程化的人或小鼠聚集蛋白變體，其對(duì)于神經(jīng)胰蛋白酶的蛋白水解活性有抗性并作為生物治療試劑用于治療患有少肌癥或其它與神經(jīng)胰蛋白酶相關(guān)的疾病的人。對(duì)于神經(jīng)胰蛋白酶活性的抗性可以通過例如修飾聚集蛋白片段的切割位點(diǎn)、尤其是β-切割位點(diǎn)或通過從片段中刪除切割位點(diǎn)而獲得。申請(qǐng)人:經(jīng)研究證明，聚集蛋白片段的體內(nèi)活性主要依賴于結(jié)構(gòu)域LG2與LG3 二者的同時(shí)存在。1097/^21811顯示了僅有LG3時(shí)的AChR簇集的體外活性。但是，不能顯示LG3 的體內(nèi)活性。似乎僅有LRP4的激活不足以實(shí)現(xiàn)完全的體內(nèi)活性。所以，本發(fā)明的一個(gè)重要特征是結(jié)構(gòu)域LG2和LG3不會(huì)由于神經(jīng)胰蛋白酶的活性而在體內(nèi)分離。為了避免此種分離，對(duì)根據(jù)本發(fā)明所使用的聚集蛋白片段進(jìn)行了修飾，從而使得其不再包括任何在天然產(chǎn)生的聚集蛋白中的結(jié)構(gòu)域LG2與LG3之間存在的神經(jīng)胰蛋白酶的β-切割位點(diǎn)。本申請(qǐng)中所使用的術(shù)語LG2和LG3應(yīng)該包括如上所提及的這些結(jié)構(gòu)域的所有可能的不同的剪接變體。例如，SEQ ID NO :1顯示了人結(jié)構(gòu)域LG2的序列，其在y-位點(diǎn)具有4個(gè)氨基酸的插入物(SEQ ID NO 5) ；SEQ ID NO :2顯示了結(jié)構(gòu)域LG3的序列，其在ζ-位點(diǎn)具有8個(gè)氨基酸的插入物(SEQ ID NO 8)。在如SEQ ID NO 1所示的結(jié)構(gòu)域LG2中，y-位點(diǎn)位于脯氨酸115與纈氨酸120之間。應(yīng)該理解纈氨酸的位置可以根據(jù)y_剪接位點(diǎn)處的插入物的長度而變化。在如SEQ ID NO 2所示的結(jié)構(gòu)域LG3中，ζ-位點(diǎn)位于絲氨酸19與谷氨酸觀之間。同樣，谷氨酸的位置顯然可以根據(jù)ζ-剪接位點(diǎn)處的插入物的長度而變化。 以下給出了所提及的剪接位點(diǎn)處的插入物序列的另外的實(shí)例。因?yàn)榭赡艽嬖诹硗獾牟挥绊懮锘钚缘男蛄凶凅w，所以本發(fā)明應(yīng)該不限于結(jié)構(gòu)域 LG2和LG3的不同剪接變體的所指明的序列，而是應(yīng)該還包括具有至少90 %、優(yōu)選95 %同一性的其變體。本發(fā)明提供了同時(shí)具有體內(nèi)活性并且在體內(nèi)不被神經(jīng)胰蛋白酶切割的聚集蛋白片段。如本申請(qǐng)所使用的體內(nèi)活性應(yīng)該包括以下效應(yīng)從防止少肌癥小鼠(muslik M491S)的整體體重下降和肌肉強(qiáng)度下降到整體體重和肌肉強(qiáng)度的恢復(fù)。如本申請(qǐng)使用的術(shù)語聚集蛋白片段包括分泌或跨膜形式的聚集蛋白，其中，至少神經(jīng)胰蛋白酶的識(shí)別位點(diǎn)β處以及也有可能位點(diǎn)α處的堿性氨基酸精氨酸和/或賴氨酸突變?yōu)槿魏纹渌被幔瑥亩a(chǎn)生至少部分神經(jīng)胰蛋白酶抗性形式的聚集蛋白。其包括包含聚集蛋白的至少LG3和LG2結(jié)構(gòu)域的片段，還包括另外包含至少一個(gè)在聚集蛋白中天然產(chǎn)生的其它結(jié)構(gòu)域例如LGl和EG1-4結(jié)構(gòu)域的片段。備選地，可以以阻止被神經(jīng)胰蛋白酶或神經(jīng)胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶蛋白水解切割的方式來化學(xué)地修飾聚集蛋白片段。另外，落在本發(fā)明范圍內(nèi)的聚集蛋白片段被指定為包含任何天然或非天然插入至剪接位點(diǎn)y和ζ的氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含至少神經(jīng)胰蛋白酶β -切割位點(diǎn)的C-末端聚集蛋白片段，其中該切割位點(diǎn)以下列方式被修飾使得神經(jīng)胰蛋白酶或神經(jīng)胰蛋白酶樣蛋白酶不能切割它。被稱作神經(jīng)胰蛋白酶抗性的C44Hz8K/A的特別優(yōu)選的修飾的聚集蛋白片段包括如圖2b所示的根據(jù)SEQ ID NO :3的氨基酸序列。簡(jiǎn)寫K/A代表β -切割位點(diǎn)處的K (賴氨酸)突變?yōu)锳 (丙氨酸)。被稱作C44 y0z8K/A (人)、C44 y0z8K/A (小鼠)、C44 HzOK/A(人)和C44 Hz8K/A(小鼠)的另外的優(yōu)選的修飾的聚集蛋白片段包括如圖7_10 所示的根據(jù)SEQ ID NO :11-14的氨基酸序列。此類聚集蛋白片段可以通過常規(guī)的重組工程獲得，如在實(shí)施例中就聚集蛋白片段 C44 Hz8K/A所描述。在實(shí)驗(yàn)中，申請(qǐng)人使用了，通過使用在N-末端導(dǎo)入了 HisS而純化的片段。在文本中被稱作C44K/A的片段具有根據(jù)SEQ ID NO :4的序列。神經(jīng)胰蛋白酶抗性的C44 y4z8K/A與C44K/A之間的唯一區(qū)別是后者蛋白另外包括在測(cè)試該片段之前未被除掉的HisS-標(biāo)簽。如實(shí)施例所示，根據(jù)本發(fā)明的修飾的聚集蛋白片段能夠在患有少肌癥的小鼠中誘導(dǎo)肌肉發(fā)育。所以，本發(fā)明的一個(gè)重要的方面是要求保護(hù)的聚集蛋白片段作為藥物的用途。本發(fā)明的另一個(gè)方面是修飾的聚集蛋白片段用于治療下列疾病的用途，或用于制備用于治療下列疾病的藥物的用途神經(jīng)肌肉疾病或神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉連接 (neuromuscular junction)的疾病，包括但不限于少肌癥、肌肉虛弱、虛弱、肌萎縮和肌營養(yǎng)不良癥、肌無力、肌強(qiáng)直、脊髓性肌萎縮、肌萎縮側(cè)索硬化和原發(fā)性側(cè)索硬化。除了上述疾病之外，修飾的聚集蛋白片段可用于一般性治療所有的其中神經(jīng)胰蛋白酶水平升高的疾病，其中神經(jīng)胰蛋白酶水平的升高是由于例如過表達(dá)。另一方面是治療具有質(zhì)量和強(qiáng)度下降的肌肉的廢用性萎縮(肌萎縮)，其可能在延長的不能移動(dòng)(prolonged immobility)之后發(fā)生。延長的不能移動(dòng)的實(shí)例有長期臥床休息，身體的一部分(例如四肢)處于石膏中，或患有肺病的患者的機(jī)械通氣。也有很多疾病和病況引起肌肉質(zhì)量的萎縮。例如，諸如癌癥和AIDS的疾病誘導(dǎo)被稱作“惡病質(zhì) (cachexia) ”的身體消耗綜合征，這對(duì)于所見到的嚴(yán)重肌萎縮是值得注意的。這種類型的萎縮可以通過鍛煉得以逆轉(zhuǎn)，除非病況是嚴(yán)重性的。已知廢用性萎縮在神經(jīng)肌肉連接處引起重塑。所觀察到的神經(jīng)肌肉變化和可塑性不僅對(duì)于衰老(少肌癥的)NMJ是特征性的，而且對(duì)于廢用性萎縮是特征性的。本發(fā)明提供了包含處于藥學(xué)上可接受的載體中的根據(jù)本發(fā)明的修飾的聚集蛋白片段的藥物組合物，其用于治療少肌癥和肌肉疾病。此類治療可以與治療方法例如主動(dòng)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練或營養(yǎng)優(yōu)化相結(jié)合。一種優(yōu)選的施用模式是皮下注射。因此，優(yōu)選地，藥物組合物包含允許此類注射的載體。然而，也可以通過肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)或鞘內(nèi)或口服或經(jīng)真皮或經(jīng)上皮或肺內(nèi)或鼻內(nèi)施用所述片段?？梢允褂靡韵轮苿┗蜓b置微囊化、微注射脂質(zhì)體、聚集蛋白片段的聚乙二醇化或聚乙二醇化衍生物，或納米顆粒。此類藥物組合物也包括在本發(fā)明內(nèi)。


圖1顯示了聚集蛋白的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的示意圖。圖加是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的agrinC44的示意圖。圖2b是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y4z8的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。圖3是SDS-PAGE凝膠的代表圖示，顯示了通過IMAC純化C44K/A (SEQ ID NO 4)。圖4是SDS-PAGE凝膠的代表圖示，顯示了 C44K/A和人agrinC44y4z8被人神經(jīng)胰蛋白酶的有限的蛋白水解消化。圖5的圖顯示了以C44K/A或介質(zhì)處理的小鼠的體重進(jìn)展。圖6a、b顯示了以C44K/A或介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠和少肌癥小鼠在實(shí)驗(yàn)第13天時(shí)的前肢和后肢握力。圖7是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y0z8K/A(h)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。圖8是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y0z8K/A(m)的氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。圖9是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44 y4z0的氨基酸序列(SEQ ID NO 13)。圖10是神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白C44Hz8K/A(m)的氨基酸序列(SEQ ID NO 14)。圖11是SDS-PAGE凝膠的代表圖示，顯示了 C44K/A片段的有限的蛋白水解消化。圖12顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或人C44K/A(0. 8)或小鼠C44K/A(0. 8)處理的少肌癥小鼠G91S)和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠(野生型介質(zhì))的總體重進(jìn)展。
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圖13a、b顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或人C44K/A(0. 8)或小鼠C44K/A(0. 8)處理的少肌癥小鼠和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠(野生型介質(zhì))的前肢和后肢握力。圖1顯示了聚集蛋白的示意圖。聚集蛋白具有大約225kDa的核心蛋白質(zhì)量。其是多結(jié)構(gòu)域蛋白，由9個(gè)K Gomitz型)結(jié)構(gòu)域、2個(gè)LE (層粘連蛋白-EGF-樣)結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)SEA (精子蛋白，腸激酶和聚集蛋白)結(jié)構(gòu)域、4個(gè)EG (表皮生長因子樣)結(jié)構(gòu)域和3個(gè) LG(層粘連蛋白球形)結(jié)構(gòu)域組成。在SEA結(jié)構(gòu)域的兩側(cè)存在富含絲氨酸/蘇氨酸(S/T)的區(qū)域。聚集蛋白以幾種同種型存在。分泌的同種型包含被切掉的信號(hào)序列(SS)，后跟N-末端聚集蛋白結(jié)構(gòu)域(NtA)。II型跨膜結(jié)合形式包含跨膜(TM)區(qū)，后面直接跟著第一 kimitz 型結(jié)構(gòu)域。起始于第一 EG結(jié)構(gòu)域的聚集蛋白的C-末端的75kDa部分是肌細(xì)胞上的乙酰膽堿受體(AChR)簇集活性的完整活性必需的，雖然多數(shù)C-末端20kDa片段足以以低效力誘導(dǎo)AChR聚集。聚集蛋白的相互作用伴侶(包括α-肌營養(yǎng)不良蛋白聚糖、肝素、一些整合素和LRP4)的幾個(gè)結(jié)合位點(diǎn)定位于C-末端區(qū)域。大的硫酸類肝素側(cè)鏈(巨頭噬菌體鏈) 是肝素結(jié)合蛋白、例如一些生長因子的結(jié)合位點(diǎn)。巨頭噬菌體表示糖基化位點(diǎn)。x、y、z分配聚集蛋白的C-末端區(qū)域中的替代性剪接位點(diǎn)。在χ-位點(diǎn)(在雞和青蛙中缺失)，可以插入0、3或12個(gè)氨基酸，在y位點(diǎn)可以插入O或4個(gè)氨基酸，在ζ位點(diǎn)可以插入0、8、11或 19(8+11)個(gè)氨基酸?！唉?和β-切割”表示兩個(gè)保守性的神經(jīng)胰蛋白酶切割位點(diǎn)。以上指明了在神經(jīng)胰蛋白酶切割之后蛋白水解片段的大概的蛋白核心質(zhì)量。圖1中使用的縮寫具有以下含義SS 信號(hào)序列；NtA :N-末端聚集蛋白結(jié)構(gòu)域； TM 跨膜區(qū)段；K :kunitz型結(jié)構(gòu)域；LE 層粘連蛋白EGF樣結(jié)構(gòu)域；S/T 富含絲氨酸/蘇氨酸的區(qū)段；SEA 精子蛋白、腸激酶和聚集蛋白結(jié)構(gòu)域；EG 表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域；LG 層粘連蛋白球形結(jié)構(gòu)域。圖加顯示了根據(jù)本發(fā)明所使用的修飾的聚集蛋白片段的示意圖。該片段包含聚集蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域LG2、EG4和LG3。神經(jīng)胰蛋白酶的β-切割位點(diǎn)被刪除。圖2b顯示了聚集蛋白的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的C44Hz8K/A片段的氨基酸序列(SEQ ID NO :3)。該片段包含聚集蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域LG2、EG4和LG3。通過使賴氨酸突變?yōu)楸彼岫鴦h除了神經(jīng)胰蛋白酶的β-切割位點(diǎn)。圖2中使用的縮寫具有以下含義LG 層粘連蛋白球形結(jié)構(gòu)域；EG 上皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域；y和ζ表示聚集蛋白的C-末端部分的替代性剪接位點(diǎn)。刪除的β-切割在神經(jīng)胰蛋白酶的β-切割位點(diǎn)處的突變使得產(chǎn)生神經(jīng)胰蛋白酶抗性的聚集蛋白片段。圖3是Sypro ruby染色的SDS-PAGE凝膠，其顯示了固定的金屬親和色譜中的 C44K/A的純化過程。以包含C44K/A基因的pEAK8載體轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液被載入以Ni2+標(biāo)記的IOmlIMAC柱。以合適的緩沖液洗滌該柱后，以含有500mM咪唑的緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白(5-9)。道1 :Biorad Prescission plus蛋白標(biāo)準(zhǔn)物；道2 濃縮的培養(yǎng)物上清液；道3 流過的級(jí)份；道4 洗滌級(jí)份；道5-9 洗脫級(jí)份。圖 4 =Sypro ruby 染色的 SDS-PAGE 凝膠，顯示了 C44K/A 和人 agrinC44 y4z8 被人神經(jīng)胰蛋白酶的蛋白水解消化。C44K/A或人agrinC44 y4z8與人神經(jīng)胰蛋白酶在37°C溫育3. 5小時(shí)(1+3)，然后進(jìn)行SDS-PAGE。作為對(duì)照，聚集蛋白片段與緩沖液在相同的條件下溫育0+4)。切割位點(diǎn)處的K至A的突變有效消除了聚集蛋白片段的切割。道1 :C44K/ A+人神經(jīng)胰蛋白酶；道2 :C44K/A，不加人神經(jīng)胰蛋白酶；道3 人agrinC44 Hz8+人神經(jīng)胰蛋白酶；道4 人agrinC44 Hz8，不加人神經(jīng)胰蛋白酶。圖5顯示了以介質(zhì)或C44K/A處理的少肌癥小鼠091S)和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠(野生型介質(zhì))的總體重的進(jìn)展。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中每日測(cè)定小鼠的重量， 直至第22天。小鼠重量表達(dá)為相對(duì)于以介質(zhì)處理的野生型同窩出生小鼠的百分率。處理在第1天開始，在第13天結(jié)束。在第13天測(cè)定握力。圖6a和b顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或C44K/A(C44K/A)處理的少肌癥小鼠的前肢和后肢握力。在第13天測(cè)定握力。不同處理組的握力表示為相對(duì)于以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠的百分率。以誤差條標(biāo)示了標(biāo)準(zhǔn)偏差(對(duì)于每個(gè)組，N = 5)。圖7顯示了神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白C44 y0z8K/A(h)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11)。圖8顯示了神經(jīng)胰蛋白酶抗性的小鼠聚集蛋白C44 y0z8K/A(m)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 12)。圖9顯示了神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白C44 y4zOK/A的氨基酸序列(SEQ ID NO 13)。圖10顯示了神經(jīng)胰蛋白酶抗性的小鼠聚集蛋白C44 y4z8K/A(m)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 14)。圖7-10中顯示的所有片段都包含聚集蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域LG2、EG4和LG3。通過賴氨酸至丙氨酸的突變刪除了神經(jīng)胰蛋白酶的β-切割位點(diǎn)。圖11是Sypro ruby染色的SDS-PAGE凝膠，其顯示了神經(jīng)胰蛋白酶測(cè)驗(yàn)中的其它的C44片段的蛋白水解消化。圖7-10中所示的不同的C44片段和人聚集蛋白C44 y4z8K/ A(圖2b)在測(cè)驗(yàn)中與人神經(jīng)胰蛋白酶一起溫育(hNT+)或不與之溫育(hNT-)，在37°C持續(xù)3. 5小時(shí)，然后進(jìn)行SDS-PAGE。作為對(duì)照，在相同的條件下溫育precission標(biāo)志物和在β-切割位點(diǎn)不含突變的人聚集蛋白C44y0z0。β-切割位點(diǎn)中K至A的突變?cè)俅蚊黠@地有效消除了突變的聚集蛋白片段被神經(jīng)胰蛋白酶的切割。道1 =Precission標(biāo)志物； 道2 不含突變的C44 yOzO(hNT-)；道3 具有突變的C44 yOzO (hNT+)；道4 人agrinC44 y4zOK/A (hNT-)；道 5 人 agrinC44 y4zOK/A (hNT+)；道 6 人 agrinC44 y0z8K/A (hNT-)；道 7:人 agrinC44 y0z8K/A (hNT+)；道 8 小鼠 agrinC44 y0z8K/A (hNT-)；道 9 小鼠 agrinC44 y0z8K/A (hNT+)；道 10 人 agrinC44 y4z8 (hNT-)；道 11 人 agrinC44 y4z8 (hNT+) -M 12 小鼠 agrinC44 y4z8K/A (hNT-)；道 13 小鼠 agrinC44 y4z8K/A (hNT+) 圖12顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或人C44 y0z8K/A或小鼠C44 y0z8K/A處理的少肌癥小鼠G91S)和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠(野生型介質(zhì))的總體重的進(jìn)展。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中每日測(cè)定小鼠的重量，直至第22天。小鼠重量表達(dá)為相對(duì)于以介質(zhì)處理的野生型同窩出生小鼠的百分率。處理在第1天開始，在第13天結(jié)束。圖13a和b顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或人C44 y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A處理的少肌癥小鼠和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠(野生型介質(zhì))的的前肢和后肢握力。 在第13天測(cè)定握力。不同處理組的握力表示為相對(duì)于以介質(zhì)處理的野生型同窩出生的小鼠的百分率。以誤差條標(biāo)示了標(biāo)準(zhǔn)偏差(對(duì)于每個(gè)組，N = 5)。詳細(xì)描述本申請(qǐng)人首次揭示了除了已知的缺陷以外，少肌癥小鼠相對(duì)于健康的野生型小鼠
9還具有瘦體重的下降(圖5)和降低的握力(圖6)。從該事實(shí)開始，本申請(qǐng)人能夠證明在例如圖2中所示的并包含如圖2b所示的序列的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的agrinC44K/A能夠增加少肌癥小鼠即過表達(dá)神經(jīng)胰蛋白酶的小鼠的體重和握力，如圖5 ；圖6a、b所示。在皮下施用C44K/A片段之后達(dá)到了恢復(fù)性效應(yīng)。該效應(yīng)不是局部地限于注射位點(diǎn)，而是對(duì)于整個(gè)體重和肌肉強(qiáng)度具有有益效應(yīng)。經(jīng)治療的少肌癥小鼠更加強(qiáng)壯并且前肢和后肢均具有增強(qiáng)的握力。C44K/A的施用也促進(jìn)異位AChR聚簇處的肌肉纖維的神經(jīng)再支配，并導(dǎo)致新形成的NMJ的穩(wěn)定化和成熟。因此，C44K/A的施用在需要肌肉纖維或肌肉的神經(jīng)再支配的康復(fù)過程中也是有益的。與在本文中要求保護(hù)的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白不同，具有針對(duì)神經(jīng)胰蛋白酶的完整切割位點(diǎn)的聚集蛋白片段(如在W097/21811中所描述)將沒有益處，因?yàn)樗鼈冄杆俦簧窠?jīng)胰蛋白酶降解并將喪失它們的AChR簇集活性。聚集蛋白在兩個(gè)位點(diǎn)被神經(jīng)胰蛋白酶切割(圖1)。α-切割位點(diǎn)位于精氨酸 1102(R1102)與丙氨酸1103(A1103)之間。β -切割位點(diǎn)位于賴氨酸1859 (K1859)與絲氨酸1860(S1860 ；編號(hào)對(duì)應(yīng)于人聚集蛋白ΝΡ_940978)之間。神經(jīng)胰蛋白酶在β-位點(diǎn)切割聚集蛋白會(huì)產(chǎn)生大約20kDa的片段(agrinC22)，該片段為從S1860至C-末端。根據(jù)本發(fā)明所使用的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白是C-末端聚集蛋白片段， 其由聚集蛋白的LG2、EG4和LG3結(jié)構(gòu)域組成，并具有神經(jīng)胰蛋白酶的失活的β _切割位點(diǎn)。 其Pl賴氨酸殘基(Κ1859)突變?yōu)楸彼?，這使得神經(jīng)胰蛋白酶不再能夠在該位點(diǎn)切割聚集蛋白(圖3)。在本發(fā)明中定義的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44Hz8是SEQ ID NO :3的 44kDa C-末端聚集蛋白片段，其中堿性氨基酸賴氨酸1859(NP_940978)(或SEQ ID NO 3中的賴氨酸227)突變?yōu)楸彼幔@引起產(chǎn)生不可被神經(jīng)胰蛋白酶切割的聚集蛋白片段。該片段還可以在位于氨基酸P1751與V1752(NP_940978)之間的y位點(diǎn)不包含插入， 或在位于氨基酸S1884與E1885(NP_940978)之間的ζ位點(diǎn)不包含插入或包含8、11或 19個(gè)氨基酸的插入，或其組合。在y位點(diǎn)處插入的序列可以是KSRK(y4，SEQ ID NO :5)、 VLSASHPLTVSGASTPR(y17, SEQ ID NO 6)和 KSRKVLSASHPLTVSGASTPR(y21，SEQ ID NO 7)； 在 ζ 位點(diǎn)處插入的序列可以是 ELANEIPV(z8，SEQ ID NO 8), PETLDSGALHS (z 11, SEQ ID NO: 9)或 ELANEIPVPETLDSGALHS (ζ 19, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO :8 與 SEQ ID NO :9 的組合)。如果在本申請(qǐng)中被稱作人聚集蛋白C44Hz8，此類聚集蛋白片段應(yīng)該對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3所示的片段，唯一區(qū)別是所示序列的位置227處的丙氨酸被替換為人聚集蛋白 C44 y4z8中的賴氨酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 Hz8”還包括SEQ ID NO 3 定義的蛋白的聚集蛋白變體，其中在1位點(diǎn)沒有導(dǎo)入插入，或在ζ位點(diǎn)沒有導(dǎo)入插入，或者在ζ位點(diǎn)不是插入8個(gè)氨基酸的插入，而是插入了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :10的 11或19個(gè)氨基酸的插入。這包括通過在y和ζ位點(diǎn)導(dǎo)入可能的氨基酸而產(chǎn)生的所有可能的變體組合。術(shù)語“神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8"還包括在N-末端或C-末端包含另外的氨基酸的SEQ ID NO :3的聚集蛋白片段。N-末端處的此類另外的氨基酸的存在是由于例如，通過重組合成和在適當(dāng)細(xì)胞中表達(dá)的制備方法。落在“神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人 agrinC44 Hz8”的定義內(nèi)的此類蛋白的實(shí)例是根據(jù)實(shí)施例1制備的蛋白C44K/A SEQ ID NO :4，其包含His8標(biāo)簽，具有prescission蛋白酶切割位點(diǎn)以簡(jiǎn)化純化(圖4)。也包括不能被神經(jīng)胰蛋白酶切割的、在N-末端包含一個(gè)或多個(gè)聚集蛋白的結(jié)構(gòu)域的延伸、直至聚集蛋白的天然N-末端的蛋白，以及神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的糖基化的或以其它方式進(jìn)行翻譯后、酶促或化學(xué)修飾的蛋白變體。如實(shí)施例中所示，神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8具有使由于神經(jīng)胰蛋白酶的過表達(dá)而引起的少肌癥表型恢復(fù)的能力。由于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的非天然高分泌神經(jīng)胰蛋白酶會(huì)引起與LRP4復(fù)合的聚集蛋白的過度消化，所以通過MuSK誘導(dǎo)AChR簇集的正確信號(hào)傳導(dǎo)被消除。這導(dǎo)致NMJ的喪失以及隨后的相應(yīng)的肌肉纖維的喪失并導(dǎo)致少肌癥。神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8能夠作為LRP4的激動(dòng)劑，刺激MuSK途徑。由于不能發(fā)生被神經(jīng)胰蛋白酶的切割，所以在長時(shí)間內(nèi)復(fù)合物保持穩(wěn)定并維持信號(hào)傳導(dǎo)。這導(dǎo)致AChR的表達(dá)和NMJ的維持。神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8對(duì)于治療由于過量的神經(jīng)胰蛋白酶引起的少肌癥是有價(jià)值的，并且在那些存在NMJ的一般性去穩(wěn)定化的疾病中也具有輔助意義。用于治療少肌癥的神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的有效性的根本新機(jī)理是治療神經(jīng)衍生的失調(diào)，而非嘗試影響肌肉纖維或整個(gè)肌肉的代謝。本發(fā)明還涉及神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白用于脊髓損傷后的恢復(fù)性治療的用途，例如，用于增強(qiáng)用途依賴性治療。此類治療法可以被神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8增強(qiáng)，這是因?yàn)槠湎铝心芰Υ龠M(jìn)AChR簇集、維持完整的NMJ或促進(jìn)長出的神經(jīng)末梢向肌肉纖維上的異位性聚簇的附著、促進(jìn)運(yùn)動(dòng)所需的新的NMJ的產(chǎn)生。還描述了神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的制備，其中在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)編碼神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z8的DNA，然后純化所得到的蛋白。有數(shù)種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)適合于產(chǎn)生和分泌神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 y4z80原核表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于在大腸桿菌中表達(dá)。真核表達(dá)系統(tǒng)包括在小鼠骨髓瘤細(xì)胞中表達(dá)、在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行桿狀病毒介導(dǎo)的表達(dá)，以及在人胚胎腎(HEK)細(xì)胞中的表達(dá)，在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中的短暫表達(dá)和在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中的穩(wěn)定表達(dá)。這些系統(tǒng)具有下列優(yōu)點(diǎn)它們能夠容易地適應(yīng)于無血清的條件以減少上清液中的污染性蛋白的量，并且能夠適應(yīng)于大規(guī)模生產(chǎn)。另外，可以使用多種細(xì)胞系，包括HEK293T和HEK293-細(xì)胞、COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、H9細(xì)胞、Jurkat細(xì)胞、NIH3T3細(xì)胞、C127細(xì)胞、CVl細(xì)胞、CAP細(xì)胞或SF細(xì)胞。為了純化神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44 Hz8，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化技術(shù)。可以使用IMAC純化His標(biāo)簽化的蛋白，但是也可以使用離子交換色譜或使用肝素柱的親和純化。也可以使用通過針對(duì)聚集蛋白的C-末端部分所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行的純化。然后可以使用羥磷灰石柱或通過凝膠過濾進(jìn)一步純化洗脫的蛋白。以下實(shí)施例例示了本發(fā)明而非限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀了這些實(shí)施例之后將能夠應(yīng)用其它相關(guān)的條件，這些也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例 實(shí)施例1 神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人聚集蛋白的44-kd的C-末端片段(C44K/A)的克隆 首先，通過合適的限制性位點(diǎn)和引物，通過PCR將缺少N末端NtA結(jié)構(gòu)域的全長人聚集蛋白yOzO(人聚集蛋白yOzOANTA起始于登記號(hào)NP_940978的蛋白序列的位置K156) 克隆進(jìn)入PEAK8載體，該載體包含人calsyntenin-Ι的分泌信號(hào)的編碼序列(Reif等人， 2007)。作為人聚集蛋白的模板，使用載體pCMV-XL5-Agrin (購自O(shè)rigene USA)。在接下來的兩個(gè)步驟中，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過定點(diǎn)誘變導(dǎo)入y4z8插入物所需的對(duì)應(yīng)的密碼子，得到包含全長人聚集蛋白y4z8 ANtA的pEAK8載體。使用該載體作為模板，擴(kuò)增了編碼人聚集蛋白的44-kd C-末端片段的基因，在翻譯的蛋白的N-末端導(dǎo)入了 His8標(biāo)簽的編碼區(qū)和prescission蛋白酶切割位點(diǎn)。使用引物在迅速改變誘變步驟中產(chǎn)生人聚集蛋白C44K/A的神經(jīng)胰蛋白酶抗性形式，所述引物在聚集蛋白的切割位點(diǎn)的賴氨酸的密碼子的位置處導(dǎo)入丙氨酸的密碼子。該質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液中產(chǎn)生具有SEQ ID NO :4的序列的蛋白(無信號(hào)序列)，其中聚集蛋白部分的氨基酸起始于亮氨酸21。實(shí)施例2 人聚集蛋白C44和神經(jīng)胰蛋白酶抗性的C44K/A的表達(dá)和純化通過在Sorvall RC5C離心機(jī)中在100 χ g離心30分鐘而使在Excell293培養(yǎng)基中生長至密度為1 X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的500ml HEK293細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞重懸于預(yù)溫?zé)嶂?37°C的500ml RPMI1640培養(yǎng)基中。將含有用于表達(dá)神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人AgrinC44 y4z8 的 1. 25mg pEAK8 在 25ml 150mM NaCl 中稀釋。將 3. 75mg 的 25kDa 聚乙烯亞胺(PEI)在 25ml 150mM NaCl中稀釋。匯合這兩種溶液并在室溫溫育10分鐘。然后，將該溶液加入到細(xì)胞懸浮液中，然后將該細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至1000ml的旋轉(zhuǎn)瓶中。將細(xì)胞懸浮液在置于具有 5% CO2、溫度37°C的潮濕空氣的溫育箱中的攪拌臺(tái)上在75rpm下溫育7天。7天后，通過在Sorvall RC5C離心機(jī)中以5000rpm離心而收獲培養(yǎng)上清液。通過經(jīng)由0. 22um Millipore無菌過濾設(shè)備過濾而除掉剩余的顆粒。使用Pellicon PLCGC IOkDa 截留切向流筒將經(jīng)過濾的培養(yǎng)物上清液濃縮10倍，并以20mM MOPS pH8. 5,400mM NaCl進(jìn)行至少1 1000的透析。透析液進(jìn)行固定化金屬親和色譜(IMAC)，其利用了 HisS標(biāo)簽， 使用以Ni2+標(biāo)記的IOml臺(tái)式His選擇柱。在裝載了經(jīng)濃縮和透析的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液之后，以100ml透析緩沖液洗滌該柱并以含有500mM咪唑的IOml透析緩沖液洗脫結(jié)合的蛋白 5次。純化成功之后進(jìn)行SDS-PAGE (圖D)。匯集陽性級(jí)份并以AMIC0N30kDa截留過濾裝置在 3000x g 在 Sigma 4K15 離心機(jī)中濃縮 10 倍，并以 20mM MOPS pH8. 5，200mM NaCl 進(jìn)行 1 10000透析。使用0.725cm7mg的消光系數(shù)通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定純化的C44K/A的濃度。實(shí)施例3 通過prescission蛋白酶切割除掉His8標(biāo)簽。在需要除掉Hi S8標(biāo)簽的情況下，將0. 5ml蛋白溶液的緩沖液交換為50mM Tris-HCL,pH7. 2，150mM NaCl，ImM DTT, ImMNa2EDTA,使用以該緩沖液預(yù)平衡的 NAP-5 柱。在 Iml相同的緩沖液中洗脫蛋白溶液。向蛋白溶液中加入Iul IM DTT，并通過倒轉(zhuǎn)管數(shù)次而使之混勻。加入20ul Prescission蛋白酶(lU/ul)并通過倒轉(zhuǎn)管數(shù)次而使之混勻。反應(yīng)
12在4°c過夜進(jìn)行。以補(bǔ)充了 ImM DTT的5mlPBS平衡0. 5ml重力流動(dòng)谷胱甘肽瓊脂糖柱。載入經(jīng)消化的蛋白溶液，并收集流過物。以補(bǔ)充了 ImM DTT的Iml PBS洗滌該柱3次，在與之前的流過的級(jí)份相同的管中收集流過物。將收集的流過的級(jí)份針對(duì)5升20mM MOPS pH8. 5， 400mM NaCl透析2次2小時(shí)，以除掉DTT和EDTA。為了除掉切割的 His8 標(biāo)簽，進(jìn)行第二次 IMAC。以 5ml 20mMM0PS pH8. 5,400mM NaCl平衡之前經(jīng)Ni2+離子標(biāo)記的Iml螯合性瓊脂糖FF柱。將經(jīng)透析的蛋白溶液應(yīng)用至柱上并收集流過物。以lml20mM MOPS pH8. 5,400mM NaCl洗滌該柱3次并在相同的管中收集流過物。使用AMICON 30kDa截留濃縮器將匯集的級(jí)份濃縮至0.5ml，使用以20mM MOPS pH8. 5，200mM NaCl預(yù)平衡的NAP-5柱交換緩沖液。使用0. 725cm2/mg的消光系數(shù)通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。將新鮮制備的蛋白用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)或儲(chǔ)存于_80°C直至使用。相應(yīng)的蛋白的蛋白序列對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3的從甘氨酸19開始的部分。實(shí)施例4 人神經(jīng)胰蛋白酶對(duì)于C44和C44K/A的體外消化a)為了證明神經(jīng)胰蛋白酶不能消化神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人agrinC44Hz8K/A，將該蛋白進(jìn)行神經(jīng)胰蛋白酶測(cè)驗(yàn)。作為對(duì)照，使用人agrinC44 y4z80在該測(cè)驗(yàn)中使用濃度為IuM的agrinC44底物，并加入人神經(jīng)胰蛋白酶。在2OmM MOPS pH8. 3,150mM NaCl,5mM CaCl2,0. 1% PEG 6000中進(jìn)行反應(yīng)。在37°C消化6小時(shí)。將物質(zhì)載入4-12% NuPAGE SDS 凝膠上并以Sypro ruby染色(圖4)。b)在類似于a)的另外的測(cè)驗(yàn)中，顯示了如圖2b和7-10所示的C44K/A片段不被神經(jīng)胰蛋白酶消化(圖11)。實(shí)施例5 在小鼠中施用神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人C44K/A實(shí)驗(yàn)中使用的少肌癥小鼠模型是C57BL/6NCRL背景中thy-Ι驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)胰蛋白酶過表達(dá)者(Stephan等人，2008)和它們的野生型同窩出生的小鼠。其中包括了雄性和雌性動(dòng)物，因?yàn)樵谠撃挲g的幼鼠中，在性別之間不存在體重和肌肉強(qiáng)度上的差異。小鼠在P8(出生后8天)時(shí)參加實(shí)驗(yàn)。使用3組小鼠，每組3只1 以介質(zhì)處理的野生型小鼠；2 以C44K/A處理的少肌癥小鼠(M491S) ；3 以介質(zhì)處理的少肌癥小鼠。以C44K/A或介質(zhì)皮下注射小鼠，總劑量為6.%ig/kg/天。在第1天開始給藥，持續(xù)至第13天。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的所有小鼠，每天測(cè)定一次體重。對(duì)于每個(gè)處理組，取體重的平均值并針對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)天數(shù)作圖(圖5)。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，已經(jīng)在少肌癥小鼠中見到了輕微的體重下降。相對(duì)于以介質(zhì)處理的小鼠，以C44K/A處理少肌癥小鼠引起體重的顯著升高。以 C44K/A處理的少肌癥小鼠完全恢復(fù)并取得了如在野生型同窩出生的小鼠中所觀察到的相同的進(jìn)展。在人類中，虛弱患者遭受每年^g以上的體重下降(Bauer and Sieber,2008 ； Lauretani等人，2003)。這對(duì)應(yīng)于大約7 %的總體重下降。以介質(zhì)對(duì)照處理的少肌癥小鼠顯示出明顯的體重下降。在實(shí)驗(yàn)過程中，少肌癥小鼠經(jīng)歷大約5%的體重下降。實(shí)施例6:握力的測(cè)定在實(shí)施例5描述的實(shí)驗(yàn)的第13天，使用數(shù)碼力量表(Columbus Instruments, Columbus OH)測(cè)定前肢和后肢的握力，該數(shù)碼力量表通過精確的力量計(jì)保留所施加的峰值力量。將力量表固定于固體基底并以力傳導(dǎo)器連接至直徑大約為Imm的三角形的牽引桿。通過RS232連接使用電腦在線收集數(shù)據(jù)，通過Grip Strength Meter軟件(ColumbusInstruments)存儲(chǔ)為.dat文件，并轉(zhuǎn)移至excel進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計(jì)分析。用于測(cè)量最大力量的單位是克(g)。在測(cè)定之前，將小鼠轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)房并允許其習(xí)慣10分鐘。允許每只小鼠以其前爪握住直徑為大約3mm的金屬桿。然后，小鼠靠近牽引桿，背對(duì)力量表并允許以其前爪或后爪握住牽引桿的線。小鼠被其尾巴(與牽引桿平行)拉向力量表，速度為大約 IOcm/sec ο保持在恒定速度牽弓I，直至小鼠的前肢分別與后肢分別釋放開。一個(gè)實(shí)驗(yàn)部分由5 次后肢握力測(cè)試構(gòu)成。在測(cè)試之間，允許小鼠休息約1分鐘的時(shí)間段。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)部分開始前的至少一天，以所述的程序訓(xùn)練小鼠。每個(gè)實(shí)驗(yàn)部分均以不知情方式進(jìn)行以避免不想要的實(shí)驗(yàn)偏倚。按照以下方式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析對(duì)于每只小鼠，排除最高值和最低值，對(duì)剩余的3個(gè)數(shù)值取平均值。隨后，對(duì)于每個(gè)處理組的數(shù)據(jù)取平均值并根據(jù)介質(zhì)處理的野生型組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在第13天，相對(duì)于野生型而言，以介質(zhì)處理的少肌癥小鼠具有大約20%的肌肉強(qiáng)度下降；而C44K/A處理的小鼠與介質(zhì)處理的野生型具有相似的握力。對(duì)于人類而言，相對(duì)于大約20歲的成年人，大約70歲的個(gè)體的肌肉強(qiáng)度的下降是大約 20% -40%,90 歲的個(gè)體則增加至 50% 以上(Bauer and Sieber，2008 ；Lauretani 等人，2003)。在本實(shí)施例中，申請(qǐng)人證明在大約第14天防止了 20%的握力下降。這是首次顯示聚集蛋白的片段在體內(nèi)是有活性的。在皮下施用之后，蛋白C44K/A 在體內(nèi)分布，并在患有少肌癥樣癥狀的小鼠中發(fā)揮出有益效應(yīng)。實(shí)施例7 神經(jīng)胰蛋白酶抗性的人C44 y0z8K/A和小鼠-AgrinC44y0z8K/A在小鼠中的施用在實(shí)驗(yàn)中使用的少肌癥小鼠模型(如實(shí)施例5中)仍然是C57BL/6NCRL背景中 Thy-I驅(qū)動(dòng)的神經(jīng)胰蛋白酶過表達(dá)者(Stephan等人，2008)和它們的野生型同窩出生的小鼠。其中包括了雄性和雌性動(dòng)物，因?yàn)樵谠撃挲g的幼鼠中，在性別之間不存在體重和肌肉強(qiáng)度上的差異。小鼠在P8(出生后8天)時(shí)參加實(shí)驗(yàn)。使用4組小鼠，每組4只1 以介質(zhì)處理的野生型小鼠；2 以C44K/A(0，8)處理的少肌癥小鼠(M491S) ；3 以小鼠-AgrinC44(0，8)K/A處理的少肌癥小鼠(M491S) ；4.以介質(zhì)處理的少肌癥小鼠。皮下注射小鼠，總劑量為20mg/kg/天。在第1天開始給藥，持續(xù)至第13天。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中的所有小鼠，每天測(cè)定一次體重。對(duì)于每個(gè)處理組，取體重的平均值并針對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)天數(shù)作圖。給出了每個(gè)處理組的相對(duì)于介質(zhì)處理的野生型小鼠的百分率相對(duì)體重(圖 12)。相對(duì)于以介質(zhì)處理的少肌癥小鼠，以人C44y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A處理少肌癥小鼠引起顯著的體重升高。以C44y0z8K/A處理的少肌癥小鼠完全恢復(fù)并取得了如野生型同窩出生的小鼠中所觀察到的相同的進(jìn)展。在人類中，虛弱患者遭受每年^g以上的體重下降(Bauer and Sieber，2008 ;Lauretani等人，2003)。這對(duì)應(yīng)于大約7%的總體重的下降。 以介質(zhì)對(duì)照處理的少肌癥小鼠顯示出明顯的體重下降。在實(shí)驗(yàn)過程中，少肌癥小鼠經(jīng)歷大約5%的體重下降。實(shí)施例8:握力的測(cè)定根據(jù)實(shí)施例6的描述進(jìn)行測(cè)定。
圖13a和b顯示了以介質(zhì)(介質(zhì))或人C44y0z8K/A或小鼠C44y0z8K/A處理的少肌癥小鼠和以介質(zhì)處理的野生型同窩出生小鼠(野生型介質(zhì))的前肢和后肢的握力。在第 13天測(cè)定握力。不同處理組的握力表示為相對(duì)于以介質(zhì)處理的野生型同窩出生小鼠的百分率。標(biāo)準(zhǔn)偏差表示為誤差條(對(duì)于每個(gè)組，N = 5)。參考文獻(xiàn)1. Bauer, J. Μ. and Sieber, C. C. (2008). Sarcopenia and frai 1 ty :a clinician' s controversial point of view.Exp. Gerontol. 43,674-678.2. Bezakova, G. and Ruegg，M. A. (2003). New insights into the roles of agrin. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4，295-308.3. Gschwend，T. P.，Krueger, S. R.，Kozlov, S. V.，Wolfer, D. P. and Sonderegger, P. (1997). Neurotrypsin, a novel multidomain serine protease expressed in the nervous system. Mol. Cell Neurosci. 9,207-219.4. Lauretani, F.，Russo，C. R.，Bandinelli，S.，Bartali, B.，Cavazzini, C.，Di, I. Α.，Corsi，A.M. , Rantanen, Τ. , Guralnik, J. Μ. and Ferrucci，L (2003). Age-associated changes in skeletal muscles and their effect on mobility :an operational diagnosis of sarcopenia. J Appl.Physiol 95,1851-1860.5. Molinari, F.，Rio, M.，Meskenaite，V.，Encha-Razavi, F.，Auge, J.，Bacq， D.，Briault，S.，Vekemans, Μ.，Munnich，Α.，ttie-Bitach，Τ·等人(2002). Truncating neurotrypsin mutation in autosomal recessive nonsyndromic mental retardation. Science 298,1779-1781.6. Reif，R.，Sales，S.，Hettwer，S.，Dreier，B.，GisIer，C.，Wolfel，J.，Luscher， D.，Zurlinden, A.，Stephan, A.，Ahmed，S·等人(2007). Specific cleavage of agrin by neurotrypsin, a synaptic protease linked to mental retardation. FASEB J 21， 3468-3478.7. Song, Y. and Balice-Gordon，R. (2008). New dogs in the dogma : Lr ρ 4 and Tidl in neuromuscular synapse formation. Neuron60,526-528.8. Stephan, A.，Mateos，J.M. ,Kozlov, S. V.，Cinelli，P.，Kistler，A. D. , Hettwer, S.，Rulicke，T.，Streit，P.，Kunz, B. and Sonderegger, P. (2008). Neurotrypsin cleaves agrin locally at the synapse. FASEB J.
權(quán)利要求
1.用作藥物的具有體內(nèi)活性的修飾的聚集蛋白片段，其至少包含共價(jià)互聯(lián)形式的人或小鼠聚集蛋白的LG2和LG3結(jié)構(gòu)域并按照使所述片段不能被神經(jīng)胰蛋白酶切割的方式被修飾。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的聚集蛋白片段，其特征在于其切割位點(diǎn)被刪除或修飾。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的聚集蛋白片段，其特征在于其包含根據(jù)SEQID Ν0:3的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的聚集蛋白片段在制備用于治療影響肌肉的神經(jīng)肌肉疾病或神經(jīng)、 肌肉和神經(jīng)肌肉連接的疾病的藥物中的用途。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用途，其特征在于所述影響肌肉的神經(jīng)肌肉疾病或神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉連接的疾病包括少肌癥、肌肉虛弱、虛弱、肌萎縮和肌營養(yǎng)不良癥、肌無力、肌強(qiáng)直、脊髓性肌萎縮、肌萎縮側(cè)索硬化和原發(fā)性側(cè)索硬化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的聚集蛋白片段，其用于治療神經(jīng)胰蛋白酶相關(guān)的疾病、特別是具有升高的神經(jīng)胰蛋白酶水平的疾病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6的修飾的聚集蛋白片段，其用于治療神經(jīng)肌肉疾病或神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉連接的疾病。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的修飾的聚集蛋白片段，其特征在于所述神經(jīng)肌肉疾病或神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉連接的疾病包括少肌癥、肌肉虛弱、虛弱、肌萎縮和肌營養(yǎng)不良癥、肌無力、 肌強(qiáng)直、脊髓性肌萎縮、肌萎縮側(cè)索硬化和原發(fā)性側(cè)索硬化。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的修飾的聚集蛋白片段，其用于治療廢用誘導(dǎo)的肌萎縮或身體消耗綜合征。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1或2的聚集蛋白片段和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
11.具有體內(nèi)活性的修飾的聚集蛋白片段，其至少包含共價(jià)互聯(lián)形式的人聚集蛋白的 LG2和LG3結(jié)構(gòu)域并按照使所述片段不能被神經(jīng)胰蛋白酶切割的方式被修飾。
全文摘要
用作藥物的具有體內(nèi)活性的修飾的聚集蛋白片段，其至少包含共價(jià)互聯(lián)形式的人聚集蛋白的LG2和LG3結(jié)構(gòu)域并按照使所述片段不能被神經(jīng)胰蛋白酶切割的方式修飾。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102481339SQ201080039028
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月4日
發(fā)明者J·W·弗里杰布勒德, S·庫瑟拉, S·黑特韋爾 申請(qǐng)人:紐羅圖恩股份公司