專利名稱：作為用于抗微生物肽產生能力的滋補劑的甘草酸的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種用于抗微生物肽產生能力的滋補劑，其用于預防感染發(fā)生。
背景技術：
受某種類型的疾病折磨的患者或經歷手術的患者通常對致病菌的免疫性降低。同時已知，這些患者極易發(fā)生感染，而所述感染幾乎不會發(fā)生于健康個體。在這種情況下， 所述感染不僅危脅所感染患者本身的生命，而且會導致醫(yī)院內感染，使得在患者中感染流行，由此導致嚴重的醫(yī)療問題。近來，特別是致病菌例如金黃色葡萄球菌(staphylococcus aurens) ^1 !(Enterococcus faecalis)禾口f同參錄{[ΜHfilif (Pseudomonas aeruginosa) 導致的感染特別成為問題。通常，施用抗菌物質來治療感染，并控制體內致病菌的平衡。但是，對抗菌物質具有耐受性的抗菌劑耐藥性細菌的出現(xiàn)限制了抗菌物質的應用，使得現(xiàn)在在各種感染中有效治療方法的選擇的選擇方案十分有限。因此強烈需要確立一種新的治療方法。例如，在燒傷患者中，常常會觀察到由銅綠假單胞菌導致的感染，已知甚至在健康個體中絕對不產生問題的非常少量的銅綠假單胞菌也會引發(fā)膿毒癥等。已經使用小鼠模型詳細地分析了燒傷患者中銅綠假單胞菌感染發(fā)生的機制。已知在發(fā)生燒傷的小鼠中，天然存在于皮膚中的抗微生物肽——鼠β-defencin 1和3 (下文分別縮寫為MBD-I和MBD-3)的量在燒傷位點周圍的皮膚中顯著減少(參見，例如，Kobayashi 等，J. Leukoc. Biol.，(1354-1362)，2008)，人們認為，由此導致的免疫性降低是銅綠假單胞菌感染發(fā)生的原因。MBD-I和MBD-3是由表皮角質化細胞產生的，但是人們認為這些肽由于白細胞介素-10 (IL-IO)和趨化因子CCL2的作用而減少，白細胞介素-10 (IL-10)和趨化因子CCL2是由出現(xiàn)于燒傷位點的未成熟髓樣細胞(Gr-I+CDllb+細胞)產生的。這樣，甚至對于其中抗微生物肽產生量減少作為危機原因之一的感染而言，與相關領域的其他感染情況類似，主要使用的是施用抗菌物質治療。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的問題然而，如上所述，施用抗菌物質的問題在于，可能產生新的抗菌劑耐受性細菌。因此，對于例如具有很高的獲得新藥物耐受性能力的銅綠假單胞菌，這種風險是特別高的。在大多數感染中，問題在于，沒有可以代替施用抗菌物質的有效治療方法。因此，強烈需要研究高安全性和高有效性的感染發(fā)生的預防方法，其可以代替施用抗菌物質。例如，如果患者他/她本身對致病菌的免疫性可以恢復到與健康個體的免疫性水平相當的水平，就認為預防方法有望用于感染發(fā)生。此外，至于其中抗微生物肽的產生量降低是發(fā)病原因的感染，我們認為重要的是將抗微生物肽的產生量提高到與健康個體的水平相當的水平。然而，還未已知有感染發(fā)生的預防方法。本發(fā)明就是在這些情況下完成的，本發(fā)明的一個目的是提供能增加抗微生物肽產生量的藥物。解決問題的方法本發(fā)明人進行了詳盡的研究來解決上述技術問題，結果，他們發(fā)現(xiàn)，用于肝病或變應性疾病且已經被認可其安全性的治療藥物——甘草酸絕對出乎意料地增加小鼠MBD-I和 MBD-3的產生量，由此完成本發(fā)明。也就是說，為了解決上述的問題，根據本發(fā)明的第一個方面，提供一種用于抗微生物肽產生能力的滋補劑，所述滋補劑包含作為活性成分的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽且抑制白細胞介素-10和趨化因子CCL2中的至少一種的產生。所述抗微生物肽優(yōu)選是防御素或組織蛋白酶抑制素(cathelicidin)。根據本發(fā)明的又一個方面，提供抗機會性感染的保護劑，所述保護劑包含作為活性成分的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽且抑制白細胞介素-10和趨化因子CCL2中的至少一種的產生。根據本發(fā)明的第三個方面，提供一種在個體中恢復抗微生物肽產生能力的方法， 所述方法包括給所述有需要的個體施用有效量的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽且抑制白細胞介素-10和趨化因子CCL2中的至少一種的產生。根據本發(fā)明的第四個方面，提供一種在個體中保護防止機會性性感染的方法，所述方法包括給所述有需要的個體施用有效量的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽且抑制白細胞介素-10和趨化因子CCL2中的至少一種的產生。發(fā)明效果根據本發(fā)明，可以增加抗微生物肽的產生量，并可以預防感染發(fā)生。此外，可以提供預防感染發(fā)生的方法，所述方法產生新的抗菌劑耐受性細菌的風險較低，而且高度安全。附圖簡述

圖1的圖，顯示的是實施例1和比較例1中小鼠的存活率。圖2的圖，顯示的是參照例1-3中小鼠的存活率。圖3的圖，顯示的是參照例4-6中小鼠的存活率。圖4的圖，顯示的是在實施例2和比較例2中獲得的小鼠血液樣本和小鼠脾勻漿樣本中銅綠假單胞菌的量。圖5的圖，顯示的是在實施例3和比較例3中獲得的小鼠皮膚組織勻漿液中MBD-I的量。圖6的圖，顯示的是在實施例4，比較例4和參照例7-9中獲得的小鼠表皮角質化細胞和/或Gr-I+CDllb+細胞的培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。圖7的圖，顯示的是在實施例5，比較例5和參照例10-12中獲得的小鼠LPS-處理的表皮角質化細胞和/或Gr-Γ⑶Ilb+細胞的培養(yǎng)液的上清液中MBD-3的量。圖8的圖，顯示的是在實施例6-9、比較例6以及參照例7和8中獲得的小鼠表皮角質化細胞和Gr-I+CDllb+細胞的培養(yǎng)液的上清液中、或者小鼠的表皮角質化細胞的培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。圖9的圖，顯示的是在參照例13-15中獲得的小鼠Gr-I+⑶lib+細胞的培養(yǎng)液的上清液中IL-4、IL-13、IL-10和CCL2的量。圖10的圖，顯示的是在參照例13-17中獲得的小鼠表皮角質化細胞的培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。圖11的圖，顯示的是在參照例17和參照例18-20中獲得的小鼠表皮角質化細胞的培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。圖12的圖，顯示的是在實施例10和比較例7中獲得的小鼠Gr-I+CDllb+細胞的培養(yǎng)液的上清液中CCL2的量。圖13的圖，顯示的是在實施例10和比較例7中獲得的小鼠Gr-I+CDllb+細胞的培養(yǎng)液的上清液中IL-10的量。本發(fā)明的實施方案本發(fā)明的用于抗微生物肽產生能力的滋補劑(下文簡稱為滋補劑)包含作為活性成分的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽并抑制白細胞介素-10 (下文縮寫為IL-10)和趨化因子CCL2(下文縮寫為CCL2)中的至少一種的產生。我們認為通過作用于產生IL-10和CCL2中的至少一種的細胞并抑制產生這些肽的能力，本發(fā)明的滋補劑能夠恢復抗微生物肽產生能力。本發(fā)明的滋補劑可以恢復抗微生物肽產生能力，所述抗微生物肽是其產生受到 IL-10或CCL2抑制的肽。其中防御素例如α-防御素、β -防御素和組織蛋白酶抑制素是適當的。β -防御素的適當例子包括人β -防御素類(HBDs)例如人β -防御素-1 (HBD-I)、 人β -防御素-2 (HBD-2)、人β -防御素-3 (HBD-3)和人β -防御素_4 (HBD-4)。α -防御素的適當例子包括人嗜中性防御素(HNP s)例如人嗜中性防御素-I(HNP-I)、人嗜中性防御素-2 (ΗΝΡ-2)和人嗜中性防御素-3 (ΗΝΡ-3)。組織蛋白酶抑制素的適當例子包括組織蛋白酶抑制素抗微生物肽-18 (CAP-18)。甘草酸或其藥學可接受的鹽可以通過例如從甘草(licorice)中提取來獲得，但是也可以使用市售產品。市售產品的一個適當例子是由Minophagen Pharmaceutical Co., Ltd制造的產品。甘草酸的藥學可接受的鹽的例子包括通過允許甘草酸和無機或有機堿以一定摩爾比反應可獲得的那些鹽。其特別優(yōu)選的例子包括銨鹽例如甘草酸單銨鹽和甘草酸二銨鹽；堿金屬鹽例如甘草酸單鈉鹽、甘草酸二鈉鹽、甘草酸單鉀鹽和甘草酸二鉀鹽；甘草酸膽堿鹽；甘草酸鈣鹽；甘草酸鎂鹽；甘草酸鋁鹽；等。其中，甘草酸單銨鹽是特別優(yōu)選的。甘草酸或其藥學可接受的鹽可以單獨使用，或者可以一起使用兩種或更多種類型。在一起使用兩種或更多種類型的情況下，可以根據目的適當調節(jié)組合和比例。本發(fā)明的滋補劑的劑型并沒有特別的限制，根據目的可以適當地選自口服制劑例如片劑、粉末劑、顆粒劑、膠囊、細顆粒劑和液體(溶液)；胃腸外用制劑例如吸入劑、栓劑和注射劑；等。這些劑型形式的滋補劑都可以通過已知方法來制備。在配制口服制劑等形式的藥劑的情況下，可以向所述口服制劑中加入制備這些制齊IJ常用的賦形劑、潤滑劑、增塑齊 、表面活性齊 、粘合劑、崩解劑、潤濕齊 、穩(wěn)定齊 、矯味齊 、著色劑、調味劑、緩沖劑等。賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、D-甘露醇、果糖、糊精、淀粉、食鹽、碳酸氫鈉、碳酸鈣、海藻酸鈉、乙基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、硅酐、高嶺土等。潤滑劑的例子包括硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸、滑石、玉米淀粉、聚乙二醇等。增塑劑的例子包括聚乙二醇、丙二醇、甘油、三醋汀、中鏈脂肪酸甘油三酯、乙酰甘油脂肪酸酯、檸檬酸三乙酯等。粘合劑的例子包括明膠、阿拉伯膠、纖維素酯、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉糖漿、甘草的提取物、西黃蓍膠、單糖漿、明膠等。崩解劑的例子包括淀粉、瓊脂、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素、微晶纖維素等。潤濕劑的例子包括阿拉伯膠、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素等。矯味劑的例子包括糖、蜂蜜、糖精鈉、薄荷、桉油、桂皮油等。著色劑的例子包括氧化鐵、β -胡蘿卜素、葉綠素、水溶性食用焦油染料等。調味劑的例子包括檸檬油、橙皮油、dl-或1-薄荷醇等。。在配制胃腸外用制劑例如吸入劑或注射劑形式的藥物的情況下，可以使用的溶劑的例子包括注射用蒸餾水、滅菌非水溶劑、懸浮劑等。非水溶劑或懸浮劑的基質的優(yōu)選例子包括丙二醇、聚乙二醇、甘油、橄欖油、玉米油、油酸乙酯等。如果必要，除了加入其中的上述組分以外，本發(fā)明的滋補劑還可以含有藥學可接受的任選組分，只要這些組分不妨礙本發(fā)明的效果即可。所述任選組分的例子包括緩沖劑、防腐劑、抗氧化劑等。本發(fā)明的滋補劑的施用方法可以包括任意的口服或胃腸外施用。根據患者的年齡、癥狀等，可以適當改變所述滋補劑的劑量，但是在口服的情況下，就甘草酸或其藥學可接受的鹽的量而言，成人的每日劑量通常優(yōu)選是50-3000mg/人， 更優(yōu)選300-2500mg/人，而在胃腸外施用的情況下，就甘草酸或其藥學可接受的鹽的量而言，成人的每日劑量通常優(yōu)選是25-2500mg/人，更優(yōu)選150-2000mg/人。施用本發(fā)明的滋補劑，以便一日一次或分為數份來施用預定量。甘草酸和其藥學可接受的鹽用作肝病和變應性疾病的治療劑已經有長期的使用記錄，由于它們的高度安全性而聞名。由于本發(fā)明的滋補劑是由甘草酸或其藥學可接受的鹽形成的，因此所述滋補劑是非常安全的。此外，所述滋補劑具有補充生物體固有功能的作用，所述功能涉及恢復抗微生物肽產生能力，因此所述滋補劑產生新的抗菌劑耐受性細菌的風險低。因此，本發(fā)明的滋補劑提供了一種高度安全的預防感染發(fā)生的方法。本發(fā)明的滋補劑可以適用于燒傷患者，但是由于所述滋補劑通過抑制IL-10和 CCL2中的至少一種產生來恢復抗微生物肽產生能力，因此有需要的患者并不限于燒傷患者，有需要的患者可以擴展到任何需要預防感染發(fā)生的那些患者。
實施例下面，參考具體實施例來進一步詳細描述本發(fā)明。但是，并非通過任何方法將本發(fā)明限定于下列實施例。<施用銅綠假單胞菌的小鼠的存活率比較>[實施例1]使正常小鼠背側燒傷，以100CFU (菌落形成單位)的量將銅綠假單胞菌應用于燒傷位點。然后在發(fā)生燒傷后2小時、M小時和72小時時將甘草酸腹膜內施用于小鼠，每次的量為每kg小鼠體重IOmg (即量為10mg/kg)，并檢查小鼠存活或死亡。在10只小鼠上進行相同的操作，檢查小鼠的存活率。結果如圖1所示。圖1的圖的橫軸代表銅綠假單胞菌感染后的天數(天)。[比較例1]以與實施例1相同的方式進行實驗，不同的是腹膜內施用生理鹽水來代替甘草酸。檢查小鼠的存活率。結果如圖1所示。從圖1可以清楚地看出，在施用甘草酸的小鼠(實施例1)中直至第7天沒有任何個體死亡，與未施用甘草酸的小鼠(比較例1)相比，2天后和2天時的存活率明顯更高。[參照例1-3]以量為每只小鼠IO6CFU(參照例1)，IO7CFU(參照例2)或IO8CFU(參照例3)的銅綠假單胞菌分別感染正常小鼠的背側，并檢查小鼠存活或者死亡。在每組10只小鼠上進行相同的操作，檢查小鼠的存活率。結果如圖2所示。圖2的圖的橫軸代表(應用銅綠假單胞菌)感染后的天數(天)。從圖2可以清楚地看出，銅綠假單胞菌的劑量較大，則小鼠的存活率較低。[參照例4-6]使正常小鼠各自背側燒傷，在燒傷位點以每只小鼠50CFU (參照例4)，IO3CFU (參照例5)或104CFU(參照例6)的銅綠假單胞菌量進行皮內感染，并檢查小鼠存活或者死亡。 在每組10只小鼠上進行相同的操作，檢查小鼠的存活率。結果如圖3所示。圖3的圖的橫軸代表銅綠假單胞菌感染后所經歷的時間(天)。從圖3可以清楚地看出，小鼠的存活率降低，使得與參照例1-3相比，用較小劑量銅綠假單胞菌即發(fā)生了多次的銅綠假單胞菌感染。<在感染銅綠假單胞菌的小鼠的試驗樣本中銅綠假單胞菌的量的比較>[實施例2]使正常小鼠背側燒傷，以用量為100CFU的銅綠假單胞菌在燒傷位點感染。然后在用銅綠假單胞菌感染后2小時和12小時時將甘草酸腹膜內施用于小鼠，每次的量為每kg 小鼠體重10mg(即量為10mg/kg)。然后在用銅綠假單胞菌感染48小時后，收集小鼠的血液和脾并通過菌落計數法測定血液樣本和脾勻漿樣本中銅綠假單胞菌的量。結果如圖4所示。圖4的圖的垂直軸代表Iml的樣本中銅綠假單胞菌的量(CFU的量)。[比較例2]以與實施例2相同的方式進行實驗，不同的是腹膜內施用生理鹽水來代替甘草酸，并測定血液樣本和脾勻漿樣本中銅綠假單胞菌的量。結果如所示圖4。從圖4可以清楚地看出，與沒有施用甘草酸的小鼠(比較例2)相比，施用甘草酸的小鼠(實施例幻的血液樣本和脾勻漿樣本中銅綠假單胞菌的量都顯著減少。<皮膚組織中MBD-I的量的比較>[實施例3]使正常小鼠背側燒傷，在發(fā)生燒傷后2小時，以每kg小鼠體重IOmg (即量為IOmg/ kg)的量腹膜內施用甘草酸。在發(fā)生燒傷0.5小時、6小時、12小時、18小時和M小時后從燒傷位點周圍收集皮膚組織，將所收集的皮膚組織勻化。通過ELI SA測定勻漿中MBD-I的量。結果如圖5所示。圖5的圖的橫軸代表發(fā)生燒傷后的時間(小時)。[比較例3]以與實施例3相同的方式進行實驗，不同的是腹膜內施用生理鹽水來代替甘草酸，并測定勻漿液中MBD-I的量。結果如圖5所示。從圖5可以清楚地看出，施用甘草酸的小鼠(實施例3)中MBD-I的量大于未施用的小鼠(比較例3)。<培養(yǎng)的細胞中MBD-I的量的比較>[實施例4]從正常小鼠的皮膚收集表皮角質化細胞(EK)，使用補充有10%滅活胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基，制備細胞溶液至濃度為2X IO6細胞/ml。此外，使正常小鼠背側燒傷，12 小時后，從燒傷位點周圍的皮膚組織收集Gr-I+CDllb+細胞。使用補充有10%滅活胎牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基制備所收集細胞的濃度為5 X IO5細胞/ml的細胞溶液。在量為IOyg/ ml的甘草酸共存在下，將表皮角質化細胞和Gr-I+CDllb+細胞在37°C下在同一 Transwell 中培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)48小時后，通過ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果圖 6如所示。[比較例4]以與實施例4相同的方式進行實驗，不同的是不允許共存甘草酸，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖6所示。[參照例7]以與實施例4相同的方式進行實驗，不同的是在不允許共存甘草酸的同時僅培養(yǎng)表皮角質化細胞Ox IO6細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖6 所示。[參照例8]以與實施例4相同的方式進行實驗，不同的是在共存在量為10 μ g/ml甘草酸的同時僅培養(yǎng)表皮角質化細胞Ox IO6細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖6所示。[參照例9]以與實施例4相同的方式進行實驗，不同的是在不允許共存在甘草酸的同時僅培養(yǎng)Gr-I+CDllb+細胞(5 X IO5細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖 6所示。從圖6可以清楚地看出，與不共存在有甘草酸的比較例4相比，使甘草酸共存在的實施例4中MBD-I的量更高。同時，甘草酸不具有對表皮角質化細胞的MBD-I產生能力促進效果(參照例7和8)。然而，Gr-I+CDllb+細胞具有對表皮角質化細胞的MBD-I產生能力抑制效果，但是甘草酸降低了該抑制效果。因此，其可以證明，甘草酸發(fā)揮MBD-I產生能力的滋補劑的作用。<培養(yǎng)的細胞中MBD-3的量的比較>[實施例5]從正常小鼠的皮膚收集表皮角質化細胞(EK)，使用補充有10%滅活胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)基，制備細胞溶液至濃度為2X IO6細胞/ml。為誘導MBD-3，用量為1 μ g/ml 的脂多糖類(LPS)處理所述細胞6小時。此外，使正常小鼠背側燒傷，12小時后，從燒傷位點周圍的皮膚組織收集Gr-Γ⑶Ilb+細胞。使用補充有10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，制備所收集細胞的細胞溶液至濃度為5X IO5細胞/ml。在量為10 μ g/ml的甘草酸共存在下，將LPS-處理過的表皮角質化細胞和Gr-I+CDllb+細胞在37°C下在同一 Transwell 中培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)48小時后，通過ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-3的量。結果圖 7如所示。[比較例5]以與實施例5相同的方式進行實驗，不同的是不允許共存在甘草酸，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-3的量。結果如圖7所示。[參照例10]以與實施例5相同的方式進行實驗，不同的是在不允許共存在甘草酸的同時僅培養(yǎng)LPS-處理過的表皮角質化細胞O X IO6細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-3的量。結果如圖7所示。[參照例11]以與實施例5相同的方式進行實驗，不同的是在量為10 μ g/ml甘草酸共存在的同時僅培養(yǎng)LPS-處理過的表皮角質化細胞QX IO6細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中 MBD-3的量。結果如圖7所示。[參照例12]以與實施例5相同的方式進行實驗，不同的是在不允許共存在甘草酸的同時僅培養(yǎng)Gr-I+CDllb+細胞(5 X IO5細胞/ml)，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-3的量。結果如圖 7所示。從圖7可以清楚地看出，與不共存在有甘草酸的比較例5相比，使甘草酸共存在的實施例5中MBD-3的量更高。同時，甘草酸不具有對LPS-處理過的表皮角質化細胞的 MBD-3產生能力促進效果(參照例10和11)。然而，Gr-I+CDllb+細胞具有對LPS-處理過的表皮角質化細胞的MBD-3產生能力抑制效果，但甘草酸降低了這種抑制效果。因此，其可以證明，甘草酸發(fā)揮MBD-3產生能力的滋補劑的作用。<甘草酸對MBD-I產生能力恢復的量依賴性的證明>[實施例6_9]從正常小鼠的皮膚收集表皮角質化細胞QXlO6細胞/ml)。此外，使正常小鼠背側燒傷，12小時后，從燒傷位點周圍的皮膚組織收集Gr-I+CDllb+細胞(5X IO5細胞/ml)。 使用用于角質化細胞培養(yǎng)的介質基作為培養(yǎng)基并使甘草酸以1 μ g/ml (實施例6)，10 μ g/ ml (實施例7)，100 μ g/ml (實施例8)或300g/ml (實施例9)的量共存在，將表皮角質化細胞和Gr-Γ⑶Ilb+細胞在37°C下在同一 Transwell中培養(yǎng)。在開始培養(yǎng)48小時后，通過 ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖8的半對數圖所示。[比較例6]以與實施例6-9相同的方式進行實驗，不同的是不允許共存在甘草酸，并測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖8的條形圖所示。圖8也顯示了參照例7和8的結果。此外，這兩個圖共享垂直軸(MBD-1的量)。從圖8可以清楚地看出，其可以證明，當甘草酸以10 μ g/ml (實施例7)，100 μ g/ ml (實施例8)和300 μ g/ml (實施例9)的量存在時，MBD-I產生能力恢復的效果特別優(yōu)良。〈對表皮角質化細胞的MBD-I產生能力的抑制因素的證明(1)>[參照例13-15]
使正常小鼠背側燒傷，12小時后，從燒傷位點周圍的皮膚組織收集Gr-Γ⑶Ilb+細胞(5X105細胞/ml)。使用補充有10%滅活胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，制備所收集細胞的細胞溶液至濃度為5 X IO5細胞/ml。在開始培養(yǎng)48小時后回收上清液，通過ELISA測定上清液樣本中IL-4、IL-13、IL-10和CCL2的量。結果如圖9所示。然后在37°C下，用量分別為2. Syg/ml的CCL2中和抗體(參照例13)、IL-10中和抗體(參照例14)或者CCL2中和抗體和IL-10中和抗體處理所述培養(yǎng)液的上清液1小時。 將處理后的培養(yǎng)液的上清液加入至最終濃度相當于培養(yǎng)基的15體積％。該培養(yǎng)基用于在 37°C下培養(yǎng)從正常小鼠的皮膚組織中分離的表皮角質化細胞O X IO6細胞/ml)。在開始培養(yǎng)48小時后，回收上清液，通過ELISA測定上清液樣本中MBD-I的量。結果如圖10所示。[參照例16]以與參照例13-15相同的方式進行實驗，不同的是不使用CCL2中和抗體和IL-10 中和抗體，測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖10所示。[參照例17]將中禾口抗體的同種型對照抗體(Anisotype control antibody to a neutralizing antibody)用于在37°C下培養(yǎng)從正常小鼠的皮膚收集的表皮角質化細胞 QXlO6細胞/ml)。在開始培養(yǎng)48小時后，通過ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖10所示。從圖10可以清楚地看出，其證明了，當一起加入CCL2中和抗體和IL-10中和抗體時，最大程度地抑制了表皮角質化細胞的MBD-I產生能力(參照例16)。此外，其證明了當加入CCL2中和抗體和IL-10中和抗體中的至少一種時，恢復了表皮角質化細胞的MBD-I產生能力(參照例13-15)。此外，其證明了當入CCL2中和抗體和IL-10中和抗體(參照例 15)時，MBD-I產生能力的恢復效果高于僅加入一種肽的情況(參照例13和14)。上述結果表明，源自Gr-Γ⑶Ilb+細胞的CCL2和IL-10抑制表皮角質化細胞的 MBD-I產生能力的恢復效果。<對表皮角質化細胞的MBD-I產生能力的抑制因素的證明[參照例18-20]在37 V 下，在 CCL2 (5ng/ml)(參照例 18)，IL-10 (lng/ml)(參照例 19)或者 CCL2(5ng/ml)和IL-10 (lng/ml)(參照例20)共存在下，培養(yǎng)從正常小鼠的皮膚收集的表皮角質化細胞O X IO6細胞/ml)，所述CCL2和IL-10 (lng/ml)是使用重組體，通過已知的重組DNA技術制備的。在開始培養(yǎng)48小時后，通過ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中MBD-I的量。結果如圖11所示。圖11也顯示了參照例17的結果。從圖11可以清楚地看出，其證明了通過加入CCL2和IL-10中的至少一種(參照例18-20)抑制了表皮角質化細胞的MBD-I產生能力。其證明了與僅加入一種肽的情況(參照例18和19)相比，當加入CCL2和IL-10 (參照例20)這兩者時，對MBD-I產生能力的抑
制效果更高。上述結果表明，源于Gr-Γ⑶Ilb+細胞的CCL2和IL-10抑制表皮角質化細胞的 MBD-I產生能力。<甘草酸對CCL2和IL-10產生的抑制效果的證明>[實施例10]
使正常小鼠背側燒傷，12小時后，從燒傷位點周圍的皮膚組織收集Gr-Γ⑶Ilb+細胞QX IO6細胞/ml)。使用角質化細胞培養(yǎng)基作為培養(yǎng)基，在量為10yg/ml的甘草酸共存在下，在37°C下在96-孔板中培養(yǎng)所述Gr-Γ⑶Ilb+細胞。在開始培養(yǎng)48小時后，通過 ELISA測定該培養(yǎng)液的上清液中CCL2和I L-IO的量。結果如圖12和13所示。圖12顯示了 CCL2的量，圖13顯示IL-IO的量。[比較例7]以與實施例10相同的方式進行實驗，不同的是不使甘草酸共存在，并測定該培養(yǎng)液的上清液中CCL2和IL-IO的量。結果如圖12和13所示。從圖12和13可以清楚地看出，其可以證明，甘草酸抑制Gr-I+CDlIb+細胞的CCL2 和IL-IO產生能力。工業(yè)實用性本發(fā)明可以用于預防燒傷患者的感染。
權利要求
1.一種用于抗微生物肽產生能力的滋補劑，其包含甘草酸或其藥學可接受的鹽作為活性成分。
2.根據權利要求1的用于抗微生物肽產生能力的滋補劑，其中所述抗微生物肽是防御素或組織蛋白酶抑制素。
3.根據權利要求1的用于抗微生物肽產生能力的滋補劑，其為選自片劑、粉末、膠囊、 細顆粒、液體、吸入劑、栓劑和注射劑的形式。
4.一種用于機會性感染的保護劑，其包含甘草酸或其藥學可接受的鹽作為活性成分。
5.甘草酸或其藥學可接受的鹽在制備用于抗微生物肽產生能力的滋補劑中的應用。
6.甘草酸或其藥學可接受的鹽在制備用于機會性感染的保護劑中的應用。
7.甘草酸或其藥學可接受的鹽，用于抗微生物肽產生能力的滋補劑的應用。
8.甘草酸或其藥學可接受的鹽，用于機會性感染的保護劑的應用。
全文摘要
提供一種能夠增強抗微生物肽產生能力的藥物。該藥物包含作為活性成分的化合物，所述化合物是甘草酸或其藥學可接受的鹽并且能夠抑制白細胞介素-10(IL-10)和趨化因子CCL2中的至少一種的產生。所述抗微生物肽優(yōu)選是防御素或組織蛋白酶抑制素。
文檔編號A61K31/00GK102470141SQ20108003522
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權日2009年7月9日
發(fā)明者吉田昇平, 吉田毅, 宇都宮德一郎, 小林真紀子, 鈴木富士夫 申請人:日本米諾發(fā)源制藥株式會社