專利名稱：復(fù)合物和生產(chǎn)過程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療性蛋白復(fù)合物的制備過程，以及用于該過程的裝置和試劑。
背景技術(shù)：
重組α-乳清蛋白的突變形式在本技術(shù)中是已知的，而且，雖然折疊和熔球形式的許多已找到的性質(zhì)已顯示是與天然蛋白類似，但一般認為該些突變形式的穩(wěn)定性一般有所降低。部分展開態(tài)或熔球態(tài)的α-乳清蛋白本身之前一直被用以來形成生物活性復(fù)合物 (斯文森等人。美國國家科學(xué)院院刊0000)97(8)4221-42 )。然而，本申請人發(fā)現(xiàn)可使用某特定類型的重組蛋白來生產(chǎn)具有獨特組成特征和結(jié)構(gòu)的治療性活性復(fù)合物，如被n. m. r所顯示。盡管有這些差異，該些復(fù)合物仍保留有用的生物活性，而且可被高效地制備。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明提供了生產(chǎn)生物活性復(fù)合物的方法，所述方法包含使帶有 α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵或交聯(lián)的重組蛋白在形成生物活性復(fù)合物的條件下與油酸接觸，并隔離該復(fù)合物。通過保證該重組蛋白缺少分子內(nèi)二硫交聯(lián)，該分子會是三維非天然的，并在其原有的內(nèi)源性生物活性方面是完全非活性的。雖然這可透過其他途徑，例如通過添加硫醇化合物或改變該蛋白的PH值而達成，但是也可通過例如使天然α -乳清蛋白中的半胱氨酸殘基被改變?yōu)槠渌麣埢貏e是丙氨酸殘基而達成。優(yōu)選地，所有半胱氨酸殘基被改變?yōu)槠渌麣埢?，例如丙氨酸殘基。本文所使用的詞語“生物活性”是指該復(fù)合物能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡，特別是通過腫瘤細胞的凋亡，和/或具有在天然單體α -乳清蛋白形式時看不到的殺菌效果。術(shù)語“其片段”是指會形成具有與包括完整的α -乳清蛋白氨基酸序列的復(fù)合物類似的活性復(fù)合物的該給定氨基酸序列的任何部分。片段可包含來自全長蛋白之內(nèi)的不止一個部分，其連在一起。部分可適當(dāng)?shù)匕辽?個，更優(yōu)選的是至少10個來自該基本序列的連續(xù)氨基酸。合適的片段會包含長度為至少20個氨基酸，更優(yōu)選的是至少100個氨基酸的缺失突變體。其包括來自該蛋白的小區(qū)域或這些區(qū)域的組合。合適的片段會包括形成α和β結(jié)構(gòu)域之間相交的區(qū)域，該區(qū)域在人α-乳清蛋白中由結(jié)構(gòu)中的氨基酸34-38和82-86限定。因此，合適的片段會包括這些區(qū)域，更優(yōu)選的包括該天然蛋白的氨基酸34-86的整個區(qū)域。然而，其他活性片段也可被找到。特別是該重組蛋白為基于人α-乳清蛋白的序列，但也可使用其他來源的α-乳清蛋白，包括?；蜓颚?乳清蛋白來導(dǎo)出該重組蛋白?？捎脕硎怪亟M蛋白和油酸轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物的方法與例如在第W099/26979 號和第W02008/138348號專利中所述的方法類似，其內(nèi)容以引用的方式并入本文中。然而，按照本發(fā)明的方法，明顯的生物活性產(chǎn)物可更容易地獲得好的產(chǎn)量。特別是在使用本發(fā)明的方法時，可方便地得到高產(chǎn)量的生物活性復(fù)合物，特別是由從柱洗脫出來的單一組分得到而無需特別長的折疊過程。以上所界定的該重組蛋白在允許離子交換的條件下，特別是當(dāng)其發(fā)生在離子交換柱上，尤其是陰離子交換柱，例如DEAE-Trisacryl M柱(可購自Biokpra，，維勒納夫，法國)，與油酸適當(dāng)?shù)亟佑|。在將該重組蛋白應(yīng)用于該柱之前，用油酸將該柱適當(dāng)?shù)亍邦A(yù)先老化(pre-conditioned) ”。這可通過首先用油酸洗脫或老化該柱而達成。適當(dāng)?shù)?，該油酸在?jīng)過含有新的未被使用的離子交換材料例如DEAE Trisacryl的柱時被洗脫。合適的洗脫緩沖液包括PH值為8. 5的Tris-HCl。以這種方式應(yīng)用于該柱的油酸組合物的量可以是少的，視乎柱的尺寸和需要被轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物的重組蛋白的體積等因素而定。例如，已發(fā)現(xiàn)能使用僅IOmg的油酸來老化14cm χ 1. 6cm的柱。在將該重組蛋白應(yīng)用于該柱(例如在合適的緩沖劑的溶液中)之后，接著用線性鹽梯度將其洗脫，并隔離在高鹽(1M NaCl或相等物)下洗脫的組分。使用本發(fā)明的方法， 大體上所有的產(chǎn)物都能從這一個峰獲得，但先前總是需要隔離兩個峰。由于無需使表達的蛋白折疊成天然態(tài)并且無需獲得并匯集多個組分，所以這大大提高了生產(chǎn)效率和產(chǎn)物的純度。因此，在某特定實施例中，本發(fā)明提供了生產(chǎn)生物活性復(fù)合物的方法，所述方法包含使帶有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵(交聯(lián))的重組蛋白在陰離子交換柱形成生物活性復(fù)合物的條件下與油酸接觸，用鹽梯度對該柱進行洗脫，并使該復(fù)合物從在高鹽濃度下洗脫的單一組分隔離出來。詞語“高鹽濃度”是指帶有陽離子的鹽，例如鹵化物和特別是氯化物，的濃度超過 0. 5Μ，例如超過0. 75Μ，特別是約1Μ。所需的濃度可視乎所用的鹽而不同，但在某個特定實施例中，該鹽為NaCl，并適當(dāng)?shù)貫镮M NaCl。按照本發(fā)明，該“帶有α-乳清蛋白序列的重組蛋白”包含帶有天然成熟的α-乳清蛋白序列的蛋白，但在成熟的人^1-乳清蛋白的全長序列中的位置6、28、61、73、77、91、 111和120找到的所有半胱氨酸被突變成為其他氨基酸，例如丙氨酸，其不產(chǎn)生二硫橋。因此，可利用于按照本發(fā)明的蛋白特別的包含蛋白SEQ ID NO 1。KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQS RNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL(SEQ ID NO 1)在這里粗體顯示天然人α -乳清蛋白中的半胱氨酸的突變位置。本申請人發(fā)現(xiàn)有一些氨基酸殘基，例如多達20個氨基酸，可附在該蛋白質(zhì)的末端，如需要的話，例如用于表達(expression)。因此，特別在本發(fā)明的方法中使用如SEQ IDNO 1所示但在N端帶有另外的蛋氨酸(以下所示的SEQ ID NO 2)的重組蛋白。使用這個序列而獲得的復(fù)合物被稱為Cys5670A。該復(fù)合物在用n. m. r檢測時顯示了獨特的性質(zhì)， 從而形成了本發(fā)明的一特定方面。使用傳統(tǒng)的重組表達方法，本方法中所使用的重組蛋白以純的形態(tài)合適地產(chǎn)生。 特別的是，編碼了該所需要的重組α -乳清蛋白的DNA可被插入于合適的表達載體，例如質(zhì)粒，然后可使用傳統(tǒng)方法利用該表達載體，來轉(zhuǎn)化宿主細胞，例如原核細胞如大腸桿菌或真核細胞，如特定的昆蟲細胞。
通過使用上述的重組蛋白，就無需透過預(yù)處理步驟，例如通過用鈣鰲合劑，如 EDTA(乙二胺四乙酸)處理，使該物質(zhì)經(jīng)受低pH值或高溫，以去除鈣和增加所存在的熔球似的物質(zhì)的量。在使用天然人α-乳清蛋白或修飾形式時，這種步驟通常是優(yōu)選的，在該修改形式中，為產(chǎn)生生物活性復(fù)合物而剩下一些半胱氨酸殘基。適當(dāng)?shù)氖牵m然人乳的含酪蛋白組分能提供該物質(zhì)的便利來源，并可被用于先前展示的過程，但是用于該過程中的油酸是純的。預(yù)處理后的柱能夠被重復(fù)地使用，以使帶有α -乳清蛋白的序列或其片段的重組蛋白的眾多組分轉(zhuǎn)化為上述的生物活性復(fù)合物。該柱一旦耗盡或轉(zhuǎn)化率降至不可接受的水平，重復(fù)該預(yù)處理步驟就能恢復(fù)復(fù)合物生產(chǎn)活動。使用本發(fā)明的過程所獲得的產(chǎn)物是新穎的，并從而形成本發(fā)明的另一方面。因此，本發(fā)明進一步提供了如上所述的帶有α-乳清蛋白的序列或其片段的重組蛋白的生物活性復(fù)合物，和油酸。特別的是，本發(fā)明提供了包含SEQ ID NO 2的重組蛋白和油酸的生物活性復(fù)合物，其被稱為Cys5670A。MKQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQ SRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL (SEQ ID NO 2)該復(fù)合物已被找到是具有生物活性的其具有誘發(fā)腫瘤細胞死亡的活性，例如透過凋亡和/或具有至少等同于用其他生物活性復(fù)合物例如HAMLET所得到的殺菌效果。因此，可通過用傳統(tǒng)的方式，把其與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合來配制成有用的藥物組合物。這種組合物形成本發(fā)明的另一方面。按照本發(fā)明的這個方面的組合物是適于外用的形式的合適藥用組合物，例如為乳膏、軟膏、凝膠或者水性或油性溶液或懸浮液。這些可包括通常已知的載體、填充劑和/或賦形劑(expedients)，其為藥學(xué)上可接受的。外用溶液或乳膏適當(dāng)?shù)睾袑⒌鞍讖?fù)合物與稀釋劑或乳膏基質(zhì)在一起的乳化劑。該復(fù)合物的每日劑量各異，取決于按照正常的臨床治療實踐，患者和疾病的性質(zhì)等等。一般規(guī)則是每次給藥使用2至200mg/劑的該生物活性復(fù)合物。本發(fā)明的另一方面提供了用于治療癌癥的方法，其包含給予需要的患者如上所述的生物活性復(fù)合物。特別的是，該復(fù)合物可被用于治療癌癥，如人的皮膚乳頭狀瘤、人的膀胱癌和成膠質(zhì)細胞瘤。在后者的情況下，可通過本技術(shù)已知的注射來給藥。本發(fā)明進一步提供了用于療法的以上所限定的生物活性復(fù)合物，特別是用于治療癌癥。半胱氨酸殘基的消除會導(dǎo)致生物活性復(fù)合物的產(chǎn)量提高，這是未料到的。因此，本發(fā)明的又一方面提供了用于提高生物活性復(fù)合物的產(chǎn)量的方法，該生物活性復(fù)合物可通過包含在離子交換條件下使α-乳清蛋白或其片段與油酸接觸的過程而得，所述方法在所述過程中包含使用帶有α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少至少一些在該天然蛋白中找到的分子內(nèi)二硫交聯(lián)的組合蛋白。如前所述，該些二硫交聯(lián)通過使半胱氨酸殘基改變?yōu)槠渌被岫贿m當(dāng)?shù)叵?。特別的是，所有二硫交聯(lián)例如通過使所有半胱氨酸殘基改變?yōu)椴煌陌被?，例如丙氨酸來將其消除?br> 此外，本發(fā)明提供了在生物活性復(fù)合物的制備中，使用帶有α-乳清蛋白序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵或交聯(lián)的重組蛋白。特別是該重組蛋白帶有人α-乳清蛋白的序列或其片段，其中半胱氨酸殘基特別是所有半胱氨酸殘基被改變?yōu)椴煌陌被帷?
用于本發(fā)明的這些方面的重組蛋白可含有如上所述的額外的氨基酸。


現(xiàn)參照所附的簡圖通過例子對本發(fā)明進行特別地描述，在附圖中圖1涉及α-乳清蛋白的結(jié)構(gòu)，以及如上所述的重組蛋白和天然α-乳清蛋白在已被油酸老化的介質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物。(A)顯示了含有8個半胱氨酸的α-乳清蛋白的結(jié)構(gòu)，該8個半胱氨酸形成四個貫穿該蛋白的二硫鍵。該些二硫鍵以黑色顯示，相關(guān)的半胱氨酸的殘基數(shù)亦被標(biāo)明。鈣離子以黑色顯示。帶狀結(jié)構(gòu)從PDB登陸號IHML(IO)得到， 并以MOLMOL修改(安德森等人，生物化學(xué)199736(39) 11648-11654。(B)這是顯示在低鹽 (組分1)和高鹽(組分2)下隨時間洗脫復(fù)合物的圖。為形成該復(fù)合物，將SEQ ID NO 2的重組蛋白應(yīng)用于已被油酸老化的離子交換柱，并用NaCl梯度(電導(dǎo)率追跡線為淡灰色)洗脫該復(fù)合物。以帶有EDTA或不帶EDTA的人α-乳清蛋白作為對照。(C)這是顯示轉(zhuǎn)化產(chǎn)量的列表，而這些產(chǎn)量被測定為(B)中0-110分鐘(組分1)和110-140分鐘(組分2)的曲線以下的面積。圖2顯示了 α-乳清蛋白和不同復(fù)合物的圓二色光譜的結(jié)果。㈧用近-UV⑶ 光譜檢測重組蛋白(黑色實線)和從其獲得的生物活性復(fù)合物(稱為Cys5670A)(黑色虛線)的三級結(jié)構(gòu)，該重組蛋白帶有α-乳清蛋白的序列，該序列中的所有半胱氨酸都被轉(zhuǎn)化為丙氨酸。該光譜在5mM Tris, pH 8. 5中被記錄在70 μ M，以天然α-乳清蛋白(灰色實線)、阿樸(apo) α -乳清蛋白(灰色十字)和HAMLET(灰色虛線)作為對照。先前已對人α-乳清蛋白、α-乳清蛋白A11_Ala和HAMLET的光譜進行過描述。(B)用遠-UV⑶光譜檢測HAMLET (灰色虛線)和Cys5670A (黑色虛線)的二級結(jié)構(gòu)。該些對照、α-乳清蛋白 (灰色實線)和α -乳清蛋白A11_Ala(黑色實線)錄得的光譜與先前的報告一致。該光譜在 5mMTris, pH 8. 5 中被記錄在 28 μ Μ。圖3對比了 HAMLET和本發(fā)明的生物復(fù)合物在殺死腫瘤細胞上的效果。把(A) L1210、(B) Jurkat, (C)HeLa 禾Π (D)Α549 細胞暴露于 HAMLET 或 Cys5670A 6 小時。用 7、14 禾口 21 μ M的HAMLET處理淋巴瘤細胞(L1210和Jurkat)，以及用14J8和42 μ M處理癌細胞 (Α549和HeLa)。左面板顯示利用臺盼藍排除法以未處理的細胞的百分比測定細胞死亡。右面板顯示HAMLET (黑色三角形)和Cys5670A (黑色圓形)所造成的以培養(yǎng)基對照(medium control)的百分比的ATP含量的減少。顯示兩至五個實驗的平均值，以標(biāo)準(zhǔn)差為誤差棒。以 α-乳清蛋白(灰色三角形)和α-乳清蛋白An_Ala (灰色圓形)蛋白作為對照。Cys5670A 與HAMLET顯示出具有同樣的生物活性，尤其在HeLa和A549細胞系中活性更大。圖4說明了以Alexa標(biāo)記的復(fù)合物的細胞內(nèi)化。用共軛焦顯微鏡使用以 Alexa-fluor標(biāo)記的復(fù)合物來檢測A549細胞對本發(fā)明的生物復(fù)合物(Cys5670A)的內(nèi)化。 以α-乳清蛋白、帶有所有半胱氨酸被丙氨酸取代的α-乳清蛋白的序列的重組蛋白和 HAMLET作為對照。以35 μ M用15分鐘和3小時處理細胞。(A)HAMLET 15分鐘后被腫瘤細胞迅速地內(nèi)化，3小時后發(fā)生進一步內(nèi)化。(B)Cys5670A的內(nèi)化要比HAMLET慢，但3小時后類似的量都存在于該些細胞中。(C) α-乳清蛋白或⑶α-乳清蛋白A11‘不被該些細胞內(nèi)化。圖5顯示了用包括本發(fā)明的復(fù)合物的生物活性復(fù)合物處理過的人的肺癌細胞的 TUNEL染色的結(jié)果。利用TUNEL染色來檢測暴露于HAMLET和Cys5670A后，(A)L1210、(B) Jurkat, (C)HeLa和(D)A549細胞中的DNA損傷的證據(jù)。HAMLET和Cys5670A(淋巴瘤細胞中14μΜ，癌細胞中^μΜ)導(dǎo)致四個細胞系的核DNA損傷，其由陽性的TUNEL染色所指示。 α-乳清蛋白和α-乳清蛋白A11_Ala(淋巴瘤細胞中21μΜ，癌細胞中42μΜ)沒有導(dǎo)致DNA 損傷。圖6和7顯示了人α-乳清蛋白(HLA)、如下所述的重組人α -乳清蛋白 (rHLAall_Ala)和蛋白油酸復(fù)合物的NMR譜的結(jié)果。
具體實施例方式例 1蛋白表達和純化野生型α-乳清蛋白在位置6、觀、61、73、77、91、111和120含有八個半胱氨酸， 形成四個二硫鍵，其穩(wěn)定了天然狀態(tài)(圖1Α)。有兩個二硫鍵存在于α-結(jié)構(gòu)域[6-120， 28-111]中，一個存在于β-結(jié)構(gòu)域W1-77]中，一個存在于兩個結(jié)構(gòu)域[73-91]之間的相交處中。該蛋白同樣由鈣離子穩(wěn)定，若除去該鈣離子，則使α-乳清蛋白失去其明顯的三級結(jié)構(gòu)并采用熔球態(tài)。使用將帶有其中所有半胱氨酸被改變?yōu)楸彼岬娜甩?乳清蛋白的序列的重組蛋白編碼的載體PALAALA，該載體通過將點突變并進野生型載體pALA而獲得，該α _乳清蛋白基因被克隆到以Τ7-聚合酶為基礎(chǔ)的表達載體pAED4中(哈夫Μ.Ε.結(jié)構(gòu)生物學(xué)新觀點 (200313(6),674-682).該載體被轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL-21*，該重組蛋白被如先前所述般表達和純化(Peng Ζ. Y.等人，生物化學(xué)(1995) 34 (104)，3241-3252 ；舒爾曼B.等人，分子生物學(xué)期刊253,651-657)但帶有一些修改。將包涵體溶解在尿素緩沖液(IOmM Tris、8M尿素、5mM已還原谷胱甘肽，pH 8. 0)中并且載到用20mM Tris, pH 8. 0進行平衡的DEAE-纖維素(Whatman，布倫特福德，英國)柱。用25mM TrisUOmM已還原谷胱甘肽、0. 25M NaCl, WpH 8. 0沖洗該柱，并用25mM Tris、7M尿素、0. 5MKC1，以pH 8.0洗脫該蛋白。將組分匯集并將其以靜止的自來水透析M小時，并以流動的自來水透析至少48小時(Spectra/ Pore，拉格那希爾，加利福尼亞州，截留分子重量為3. 5kDa)。如果在透析過程中發(fā)生沉淀， 則將沉淀物溶在5M尿素中，然后將其以流動的自來水透析并凍干。將透析后的樣本載到用 25mM Tris、0. 2mM CaCl2，以 pH 7. 8 進行平衡的 DEAE-葡聚糖纖維素(S印hacel) (Amersham Biosciences，烏普薩拉，瑞典)柱，然后用線性的鹽梯度05mM Tris、0. 2mM CaCl2,0-0. 4M NaCl,pH 7.8)洗脫。將組分匯集，在pH 7以蒸餾水(截留分子重量為3. 5kDa)透析，并凍干。純化后的突變蛋白是SEQ ID No 2，其為人α-乳清蛋白的序列但含有附加的N-末端蛋氨酸殘基，該殘基未被除去。該重組蛋白相對高產(chǎn)量(100mg/L的培養(yǎng)物)的被表達在大腸桿菌BL21*中并被純化至均一程度。由于該重組蛋白將所有半胱氨酸取代為丙氨酸，所以其不含有二硫鍵。然而，已知道天然樣的拓撲要被保存。該突變體采用了熔球樣的構(gòu)象，如近-UV CD光譜和NMR所示，以及保留下來的二級結(jié)構(gòu)，如遠-UV⑶光譜所示。這種蛋白被稱為rHLAall_Ala。例 2用油酸通過離子交換層析法形成復(fù)合物如前所述，用IOml的DEAE-Trisacryl M(BioSepra,維勒納夫，法國)填塞柱 (14cmx 1.6cm)，并用油酸(C18:l:9cis) (Larodan，馬爾默，瑞典)將其老化(斯文森等人。 美國國家科學(xué)院院刊0000)97 (8) 4221-42 和彼得森J.等人，生物化學(xué)與生物物理研究通訊0006)345(1060-270)?；旧?，用超聲處理將十毫克油酸溶在500 μ 1的99. 5 %的乙醇中。在加入IOmM Tris-HCl ph 8. 5 (IOml)之后，將該溶液應(yīng)用于該柱。將五毫克蛋白 (如例1中所述而得的重組蛋白rHLAall_Ala)，或者包含天然α -乳清蛋白或用過量EDTA預(yù)培養(yǎng)的天然α-乳清蛋白的對照溶在緩沖液(50mM Tris/HCl pH 8.5,0. IM NaCl)中，并個別地將其加至該柱。在應(yīng)用NaCl梯度之后收集組分。用NaCl梯度洗脫該柱，(用包含IOmM Tris HCL (pH 8. 5)的緩沖液A，接著是緩沖液B，其為含有IM NaCl的緩沖液A)，并檢測高鹽之前洗脫的組分(組分1，t = 0-110分鐘)或高鹽之后洗脫的組分(組分2，t = 110-130分鐘)(圖1B)。將使用例1的重組蛋白rHLAa11‘所得的復(fù)合物(Cys5670A)洗脫為與HAMLET相同的位置的尖峰。相反，野生型 α -乳清蛋白不生成任何在應(yīng)用高鹽后洗脫的重要復(fù)合物(圖IB和C)。事實上，例1的重組蛋白rHLAa11‘被找到比以EDTA處理的α -乳清蛋白更高效地轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物， 而已被應(yīng)用的蛋白的回收率分別為99% (范圍87-99%，SD 4. 5，η = 6)相比71 % (范圍 67-94%, SD 11. 3,η = 5)(圖1C)。這可反映出該突變蛋白的構(gòu)象的結(jié)構(gòu)均一程度較大，在這里較大部分的例1的重組蛋白rHLAall_Ala更容易在層析轉(zhuǎn)化為脂肪酸結(jié)合的復(fù)合物的條件下采用熔球態(tài)。通過以蒸餾水(Spectra/Pore，膜截留3. 5kDa)透析接著凍干來將鹽除去。例 3α-乳清蛋白變體的圓二色光譜在25°C下對α -乳清蛋白、例1的重組蛋白rHLAall_Ala、HAMLET和使用例1的該重組蛋白rHLAall_Ala得到的Cys5670A收集遠-和近-UV⑶光譜。凍干后的物質(zhì)為近-和遠-UV ⑶光譜被分別溶在5mM Tris, pH 8. 5中至70和28 μ M。近-UV光譜在240和320nm之間獲得，而遠-UV光譜則在190和250nm之間獲得。波長間距是lnm，反應(yīng)時間是8秒，掃描率是IOnm/分鐘。將六次掃描的平均值展示出來，當(dāng)中平均殘基橢圓率θ m如先前所述計算出來，單位為deg .cm2 .dmorH斯文森M.等人。生物化學(xué)雜志(1999) 274 (10)，6388-6396)。近-UV⑶光譜檢測到例1的重組蛋白rHLAall_Ala中的三級相互作用的大幅弱化 (圖2A)，這與α-乳清蛋白的熔球情況相符。事實上，在室溫下，阿樸-α-乳清蛋白并非呈完全熔球(圖2Α)，反而找到蛋白分子總體明顯地分開成天然和熔球態(tài)，平衡的共存，并且使光譜平均。因此，在相同的條件下，較大部分的例1的重組蛋白rHLAall_Ala的分子處于真正的熔球態(tài)，可有助于所觀察到的如上所述的例1的重組蛋白rHLAall_Ala與油酸被提高的的轉(zhuǎn)化產(chǎn)量。在轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物之后，該復(fù)合物的近-UV光譜與該唯突變蛋白光譜幾乎相同，顯示了油酸的結(jié)合并未增加可檢測的三級結(jié)構(gòu)的量(圖2A)。關(guān)于二級結(jié)構(gòu)，例1的該重組蛋白rHLAall_Ala和從其獲得的生物活性復(fù)合物(Cys5670A)都保留了在遠-UV⑶光譜所顯示的野生型蛋白在定性上類似的二級結(jié)構(gòu)(圖 2B)，又一次與先前的研究密切相關(guān)。例 4細胞死亡檢定使用老鼠的淋巴瘤細胞(L1210、ATCC、CCL_219)、人的淋巴瘤細胞(Jurkat、ATCC、 TIB-152)、人的肺癌細胞(AM9、ATCC、CCL-185)和人的子宮頸癌細胞(HeLa、ATCC、CCL-2) 來檢測Cys5670A的抗腫瘤的作用。獲取、清洗這些細胞并使其再次懸浮在缺乏胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基(PAA Laboratories GmbH，柏斯澄，奧地利)中。對于粘附細胞，使用維爾烯(140mM NaCl,2. 4mM KCl、8mM Na2HPO4U. 6mM ΚΗ2Ρ04、0· 5mM EDTA，pH 7. 2)進行分離。 可將這些細胞以IxlO6細胞/孔(TPP，特拉薩丁根，瑞士)接種到M個孔板中。將凍干后的物質(zhì)以0.7mM(MW 14, 200g/mol)溶在磷酸鹽緩沖鹽水(PBQ中，并將其加至孔中，使其最后濃度為7和42 μ M之間。所述的HAMLET和Cys5670A的濃度指蛋白質(zhì)構(gòu)造的摩爾濃度。將細胞置于在5% CO2的大氣中在37°C下培養(yǎng)，1小時后將胎牛血清加至各孔中至最后濃度為 5 %。6小時后利用臺盼藍排除法以干涉差顯微術(shù)來測定細胞活力。使用ATP Lite (熒光ATP 檢測檢定系統(tǒng)，PerkinElmer，波士頓，馬薩諸塞州)檢測ATP含量并使用光度計(LUMIstar， BMG Labtech，奧芬堡，德國)檢測熒光。6小時后的失活定量會被量化為ATP含量的減少和臺盼藍染色的增加(圖3)。已顯示出，Cys5670A以劑量依賴方式殺死腫瘤細胞。在暴露于已測試的最高濃度(淋巴瘤細胞為21 μ M，癌細胞為42 μ M) 6小時之后，所有細胞中超過80%被殺死。用HAMLET得到類似的結(jié)果在暴露于最高濃度6小時之后，超過60%的細胞被殺死。在抗腫瘤的作用上，該兩個復(fù)合物之間無統(tǒng)計上的顯著差異(P >0.05，單因素方差分析(one way ANOVA))。該結(jié)果顯示了 Cys5670A與HAMLET —樣活躍。此外，與天然的唯蛋白對照類似，僅例1的重組蛋白rHLAall_Ala沒有減少細胞活性 (圖3)。觀察到用如上所述得到的復(fù)合物和例1的無脂肪酸的重組蛋白rHLAall_Ala處理的細胞活性無統(tǒng)計上顯著差異(P < 0.005，單因素方差分析)。很多研究表明蛋白的部分展開，及接著的低聚反應(yīng)和聚集產(chǎn)生了帶有細胞毒性的淀粉樣結(jié)構(gòu)。在α-乳清蛋白的酸性熔球形式(“Α-形態(tài)”)的情況下，已確實知道淀粉樣原纖維會在高鹽濃度存在時形成。然而，這種溶液條件在這里不與例1的重組蛋白rHLAall_Ala—并使用，從而顯示出僅部分展開至該熔球形式不會使該蛋白有細胞毒性。利用單因素方差分析(ANOVA)，接著利用Bonferroni多重比較檢驗測試來比較對細胞活性的效果的差異。使用GraphPad InStat3for Macintosh version 3. Ob進行分析。例 5腫瘤細胞中Cys5670A的攝取利用以 AlexaFluor 568 標(biāo)記的蛋白(Molecular Probes, hvitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)研究該重組蛋白和從其獲得的Cys5670A的細胞攝取。將人的肺癌細胞 (A549)接種到8孔腔室玻片(Nunc，羅切斯特，紐約州)上至密度為50，000個細胞/孔，并置于5% CO2中在37°C下培養(yǎng)一夜。將以ALEXA標(biāo)記的和未標(biāo)記的蛋白混合至1 10的比例，并在缺乏胎牛血清的情況下應(yīng)用于該些細胞至最后濃度為35 μ M。在37°C下，5% CO2 中培養(yǎng)細胞，15分鐘后將其固定在3. 7%的甲醛中。當(dāng)在培養(yǎng)3小時間，在一小時后加入胎牛血清至最后濃度為5%。用共軛焦顯微鏡(LSM510META confocal system，卡爾蔡司，耶拿，德國)分析細胞的攝取，結(jié)果如圖4所示。使用以如例2中所述的天然α-乳清蛋白得到的HAMLET作為對照。一如所料，HAMLET被腫瘤細胞快速地內(nèi)化(圖4A)，如在暴露15分鐘后所示。在3 小時后發(fā)生進一步提高。Cys5670A顯示類似模式快速內(nèi)化后易位至核心(圖4B)。雖然攝取在15分鐘后與HAMLET相對比是弱的，但在3小時后已攝取了 Cys5670A的細胞數(shù)量是差不多。攝取動力學(xué)上有微小差異的原因并不是立即顯而易見的，然而人們認為Cys5670A 復(fù)合物內(nèi)重組蛋白相對較大的靈活性可能在延遲初始攝取方面有些關(guān)系。不帶有油酸的突變蛋白的內(nèi)化亦與Cys5670A(35 μ M的Cys5670A或例1的重組蛋白rHLAall_Ala)進行對比(圖4C和D)。該突變蛋白與細胞表面結(jié)合，但不被腫瘤細胞內(nèi)化。 該重組蛋白的大聚集體形成，而其中一些保持粘附在細胞表面15分鐘和3小時(圖4D)。該結(jié)果顯示了內(nèi)化進入腫瘤細胞是HAMLET和Cys5670A的一般特征，表明需要脂肪酸輔因子來攝取入腫瘤細胞，以及用于抗腫瘤的作用。而且，沒有證據(jù)表明該重組蛋白本身可被內(nèi)化。例 6TUNEL 染色透過利用TUNEL檢定已顯示出，HAMLET會導(dǎo)致腫瘤細胞系和體內(nèi)人的腫瘤的DNA 受損(莫斯伯格等人。國際腫瘤期刊0007) 121 (6) 1352-1359)。為檢測對Cys5670A反應(yīng)的DNA受損程度，把例4中使用的四個腫瘤細胞系暴露于該復(fù)合物6小時(淋巴瘤細胞為 14 μ Μ,癌細胞為觀μ Μ)。以HAMLET、例1的重組蛋白rHLAa11‘和α -乳清蛋白作為對照。利用離心分離法獲取細胞并將其固定在PBS稀釋了的4%的多聚甲醛。將這些細胞離心分離到涂了 L-賴氨酸的顯微鏡玻片0 g，5分鐘，Cytospin 3，Siandon,柴郡，英國)，并儲存在_20°C下。用TUNEL檢定法(Roche，巴塞爾，瑞士)識別帶有核DNA損傷的細胞。簡言之，將這些玻片放在室溫下解凍，在PBS中沖洗兩次，并用0. 1 %的檸檬酸鈉，0. 1 % 的Triton X-100滲透。應(yīng)用TUNEL反應(yīng)混合物，并將該些玻片在37°C下在5%的(X)2中培養(yǎng)1小時。用PBS沖洗載玻片三次，用蓋玻片和封片劑(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密蘇里州，美國)將其封住并用共軛焦顯微鏡檢測。Cys5670A導(dǎo)致的DNA損傷在所有細胞類型中以TUNEL染色檢測到(圖5)。TUNEL陽性細胞的頻率與以HAMLET處理的細胞中的頻率類似。相比之下，例1的重組蛋白rHLAall_Ala 和α-乳清蛋白并未影響TUNEL染色。該結(jié)果顯示了油酸/熔球復(fù)合物的細胞毒性效應(yīng)都包括核DNA的損傷?？傊?，例1中帶有α-乳清蛋白的序列的重組蛋白rHLAall_Ala在油酸存在的情況下，容易被轉(zhuǎn)化為生物活性復(fù)合物，該α-乳清蛋白的序列中所有八個半胱氨酸殘基都被取代為丙氨酸，使得該蛋白在所有條件下為非天然的。事實上，該生產(chǎn)過程好得令人吃驚， 其在單峰中并產(chǎn)量亦被提高。這在生產(chǎn)中是特別有利的。此外，所獲得的復(fù)合物展示了對淋巴瘤和癌細胞系的強大的抗腫瘤活動。通過共軛焦顯微鏡，顯示了在腫瘤細胞的核內(nèi)聚集，從而繁殖出具有相同抗腫瘤活動的HAMLET的細胞運輸模式。因此，Cys5670A代表了特別優(yōu)選的候選藥物。例 7
Cys5670A的結(jié)構(gòu)研究(實驗程序)1HNMR光譜法使用2. Oml kba離心式脫鹽柱(Thermo Scientific)將例1中所述的重組人α -乳清蛋白rHLAall-Ala、HAMLET和Cys5670A溶劑交換為具pH 7. 0和帶有2. OM 尿素的磷酸鈉緩沖液。將人HLA，其含有結(jié)合Ca2+離子，在蒸餾水中溶劑交換為2. OM尿素， PH值被調(diào)整至7。在所有情況下，該溶劑含有10%的1)20。使用間接偵測微量探頭(Bruker BioSpin)，在600MHz Ultrashield光譜儀上獲得該四個樣本的一維1H NMR光譜。使用變溫單元來保持溫度為20°C、30°C、4(rC、5(rC和55°C。除HLA之外，該rHLAall-Ala、HAMLET和Cys5670A的一維1H NMR光譜不被充分地解析， 而且寬度很大，如α-乳清蛋白的熔球種類中所見(圖6A-D)。α-乳清蛋白中的天然或天然樣三維結(jié)構(gòu)的其中一個關(guān)鍵的光譜特征是與Ile95的δ CH3質(zhì)子(在30°C下為-0. 7ppm) 和Val92的YCH3質(zhì)子(在30°C下為-0. 5ppm)對應(yīng)的往高磁場位移的強烈的甲基共振(圖 6B和7A)。使用這一標(biāo)準(zhǔn)，盡管HAMLET的峰一般是寬而遍布光譜的，其仍含有相當(dāng)多的天然樣結(jié)構(gòu)(圖7A)，即使比折疊的HLA少得多。這與近-UV⑶光譜一致，在當(dāng)中HAMLET的橢圓率幅度是阿樸-HLA和rHLAall_A17CyS5670A之間。作為進一步區(qū)別這些樣本的方法，各蛋白或蛋白脂肪酸復(fù)合物在2. OM尿素存在的情況下經(jīng)受逐漸升高的溫度。添加尿素的原因是兩面的首先是幫助該些蛋白尤其是rHLAall_Ala溶解，第二是微妙地增強分子的動態(tài)性質(zhì)，以從較快的時間尺度(用展開的高度動態(tài)的分子所觀察到的)區(qū)分微秒至毫秒的時間尺度(在熔球中觀察到的)的構(gòu)象漲落。已注意到的是添加2M尿素不會使油酸從蛋白剝離，其存在也不會對HAMLET和Cys5670A的細胞毒性活動有負面影響(用2M尿素和磷酸鹽緩沖鹽水培養(yǎng)30分鐘，未顯示數(shù)據(jù))。對于HLA的情況，從因完全折疊的天然結(jié)構(gòu)而致的廣泛分散的化學(xué)位移和明顯的峰開始(20°C和30°C)，該峰逐漸地變寬，同時，該化學(xué)位移的分散看起來在范圍內(nèi)變窄 (40°C至55°C )(圖6B)。特有的往高磁場位移的甲基共振在高溫下仍舊存在，然而，峰高隨其變寬而變得為越來越低(圖7A，B)，表明在55°C下而2. OM的尿素存在的情況下有大量的熔球分子。作為對比，α-乳清蛋白的傳統(tǒng)高溫熔球態(tài)的條件為大約90°C (pH 7，無化學(xué)變性劑)。相比之下，rHLAa11‘的光譜以差的化學(xué)分散的位移和寬峰開始(20°C和30°C)，但在較高溫度下，即使該些化學(xué)位移進一步變窄，該些峰也逐漸變得尖銳(40°C至55°C )(圖 6A)。這表示了該蛋白正在經(jīng)歷從該熔球態(tài)變?yōu)橛鷣碛缮⒌?、展開狀態(tài)的轉(zhuǎn)型。一個重要的方面是在該變體中，在任何溫度下都完全無往高磁場位移的甲基共振(圖7A，B)，表明 rHLAa11‘在所有溫度下都缺少強勁的殘基間側(cè)鏈相互作用，近-UV⑶光譜(未顯示)中的特征同樣表明這個情況。如以上所指出，HAMLET的光譜(20°C和30°C ；圖7)顯示了 Ile95的δ CH3質(zhì)子(在 30°C下為-0. 7ppm)和Val92的Y CH3質(zhì)子(在30°C下為-0. 5ppm)，標(biāo)示天然樣三維結(jié)構(gòu)的存在，盡管其數(shù)量比HLA少。提高溫度時，由于很多峰變得尖銳(圖6D)，所以這些高磁場共振消失(圖7B)，表明了雖然HAMLET在較低溫度下為部分天然樣，但其總體表現(xiàn)與天然HLA 的總體表現(xiàn)明顯地不同。事實上，發(fā)現(xiàn)在下HAMLET的高磁場NMR譜與Cys5670A的高磁場NMR譜是相同的，當(dāng)中無高磁場共振，除了在0. 05ppm處有非常小的峰。令人吃驚的是， 對于Cys5670A，當(dāng)溫度升高和峰如對熔球的預(yù)期一樣變得尖銳(圖6C)，在高磁場區(qū)中沒有
11變化(圖7A，B)。 在這系列的實驗中，利用了溫度可變化的IH NMR光譜來區(qū)分(i)在光譜上分散得很好及展現(xiàn)窄峰的天然狀態(tài)，(ii)在光譜上分散得差和展現(xiàn)寬峰的熔球狀態(tài)，以及(iii) rHLAall-Ala、HLA、HAMLET和Cys5670A在光譜上分散得差和展現(xiàn)窄峰的展開狀態(tài)。在α-乳清蛋白和其各種的熔球態(tài)以及其他原型蛋白，例如脫輔基肌紅蛋白，更詳細地對主鏈動力學(xué)作了大量的工作。這些工作的主體顯示了在不同的實驗條件下，主鏈動力學(xué)關(guān)于不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域的錯綜復(fù)雜和細微之處。從該工作中得到的其中一個關(guān)鍵的結(jié)論首先是Cys5670A 與HAMLET在生理條件下結(jié)構(gòu)明顯不同。此外，雖然HAMLET含有天然樣分子，Cys5670A卻完全沒有天然樣側(cè)鏈組裝，但也展現(xiàn)了與HAMLET相等的細胞毒性活動。因此，與淀粉樣原纖維的例子不同，特意設(shè)計的、非天然和部分展開的結(jié)構(gòu)性總體可依據(jù)環(huán)境對該些細胞給與獨立的有利效果。
權(quán)利要求
1.用于生產(chǎn)生物活性復(fù)合物的方法，所述方法包含使帶有α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵的重組蛋白在形成生物活性復(fù)合物的條件下與油酸接觸并隔離該復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該重組蛋白包含α-乳清蛋白，在該α-乳清蛋白中所有半胱氨酸殘基被改變?yōu)槠渌被帷?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該α-乳清蛋白中的半胱氨酸殘基被改變?yōu)楸彼釟埢?br> 4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中該α-乳清蛋白是人α-乳清蛋白。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中帶有在權(quán)利要求1中所限定的α-乳清蛋白序列或其片段的重組蛋白與油酸在離子交換柱特別是陰離子交換柱上接觸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中用線性鹽梯度將該柱進行洗脫，并使生物活性復(fù)合物從在高鹽濃度下洗脫的單一組分隔離出來。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中該高鹽濃度是IM的NaCl或?qū)Φ任铩?br> 8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項權(quán)利要求所述的方法，其中該重組蛋白包含SEQIDN0. 1 KQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQSRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL(SEQ ID NO 1)， 可選地有多達20個氨基酸附在該蛋白質(zhì)的末端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該重組蛋白為SEQID No 2 MKQFTKAELSQLLKDIDGYGGIALPELIATMFHTSGYDTQAIVENNESTEYGLFQISNKLWAKSSQVPQSRNIADISADKFLDDDITDDIMAAKKILDIKGIDYffLAHKALATEKLEQffLAEKL (SEQ ID NO 2)。
10.生物活性復(fù)合物，包含帶有α-乳清蛋白的序列但缺少分子內(nèi)二硫鍵的重組蛋白， 或其片段，和油酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的生物活性復(fù)合物，其中該重組蛋白是SEQID NO 1或SEQ ID NO 2。
12.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的復(fù)合物與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的生物活性復(fù)合物，其用于治療。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物活性復(fù)合物，其用于治療癌癥。
15.提高生物活性復(fù)合物的產(chǎn)量的方法，該生物活性復(fù)合物可通過包含在離子交換條件下使α -乳清蛋白或其片段與油酸接觸的過程而得，所述方法在所述過程中包含使用帶有α-乳清蛋白的該序列或其片段但缺少至少一些分子內(nèi)二硫鍵的重組蛋白。
16.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中至少一些半胱氨酸殘基被改變?yōu)椴煌陌被帷?br> 17.帶有α-乳清蛋白的該序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵的重組蛋白的使用，例如在該使用中，半胱氨酸殘基特別是所有半胱氨酸殘基在生物活性復(fù)合物的制備中被改變?yōu)椴煌陌被帷?br> 全文摘要
本發(fā)明描述了用于制備生物活性復(fù)合物的方法和過程，并要求其權(quán)利，所述方法包含帶有α-乳清蛋白，例如人α-乳清蛋白的序列或其片段但缺少分子內(nèi)二硫鍵的重組蛋白，以及油酸。該重組蛋白適當(dāng)?shù)貛в性谔烊坏鞍字姓业降陌腚装彼幔浔桓淖優(yōu)槠渌被崂绫彼?。本發(fā)明還描述了生物活性復(fù)合物的重組表達、過程合理化和產(chǎn)量上的改進，以及獲得的復(fù)合物，并要求其權(quán)利。
文檔編號A61K38/38GK102348721SQ201080011265
公開日2012年2月8日 申請日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者凱塞納·斯萬保格, 安-克里斯汀·莫新伯格, 珍妮·彼得森-凱斯伯格, 肯尼思H·莫 申請人:哈姆雷特藥品Ab