專利名稱：產生組織的方法和裝置以及所獲得的組織的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織產生(再生、重建、加固(reinforcement)和/或復壯 (rejuvenation))令頁域。更確切地，本發(fā)明涉及使特定組織或細胞再生的方法和裝置(產品和設備)，所述組織或細胞優(yōu)選間充質組織如骨、脂肪、腱、肌肉、軟骨和骨髓基質以及血液學組織或細胞 (RBC、WBC、血小板、淋巴細胞、血液干細胞(hematological stem cell, HSC)、內皮祖細胞 (endothelial progenitor cell, EPC)等。)。本發(fā)明還涉及在哺乳動物對象優(yōu)選人患者中使用通過本發(fā)明方法獲得的(再生) 組織或細胞來重建、再生、復壯或加固受損或患病組織或細胞的方法和裝置(產品和設
背景技術：
對于重建受損或患病組織說，具體地，對骨來說，存在不同的技術。細胞介導的再生技術是其中之一。間充質干細胞(mesenchymal stem cell, MSC)或HSC對應于在被稱為“間充質” 的骨髓基質中存在的并且還在脂肪組織中存在的干細胞。MSC和HSC可以在離體培養(yǎng)中擴增以獲得適當數目的細胞。然而，為了獲得足夠量的干細胞，需要收集大量的骨髓和長時間的培養(yǎng)。干細胞的體外培養(yǎng)改變了它們的增殖能力并且降低了它們的分化潛能。這些細胞表現(xiàn)出分化和增殖的多能性，并且通過使用適當的細胞因子和生長因子以及包括EPC在內的血細胞，可以使它們分化成多種細胞類型，如肌肉、脈管系統(tǒng)、神經元組織、肝、成骨細胞、軟骨細胞、成肌細胞、成角化細胞 (keratinoblast)和成纖維細胞。已經從邏輯上提議在細胞介導的再生技術中使用這些MSC。此外，眾所周知的是衰老改變了干細胞性能和它們的分化能力。實踐中，在骨再生方法中，從患者中提取MSC，使用適當的骨生長因子使其體外增殖并分化成成骨細胞。因此，產生了骨組織，然后在重建方法中將其用作植入物移植給患者。心臟病發(fā)作后，對患者局部麻醉以收集大量骨髓樣品，其全部或部分地或在細胞分選后被再注射。在癌癥療法中，在將它們再注射給患者之前，可以分離并刺激干細胞，并且可能地，進行離體轉染。作為用于治療白血病之移植的輔劑，將大量異源MSC與供體骨髓一起注射。對富血小板血漿(platelet-rich plasma縮寫為“PRP”)在組織再生和組織重建中潛在用途的研究已經開始。已證明PRP能夠引起基質干細胞的體外增殖(Lucarelli E.等人，Biomaterials 24(2003),3095-3100 頁)。最近的科學研究還提供了涉及與MSC—起用作移植材料的富血小板血漿(縮寫為 “PRP”)在骨重建中有益作用的首次結果(Kitoh H.等人，Clin. Oral Implants Res·，第15 卷，第 5 期(2004)，589-597 頁；Yamada Y 等人，J. Biomed. Mater. Res.，第 68A 卷，第 4 期 (2004)，747-755 頁)。然而，目前的使用MSC-HSC以及HSC細胞的組織再生方法存在一些缺點。具體來說，使用這些方法和細胞難以賦予所產生的骨組織以適當的形狀。還難以獲得具有能夠耐受移植的足夠機械強度的骨組織。此外，用于獲得足夠量骨組織的體外培養(yǎng)是非常耗時的。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了改進和替代性方法和裝置，其用于獲得和/或誘導(非人胚胎)干細胞(優(yōu)選MSC和EPC并且可能地不包括HSC)增殖和用于“產生”(再生、重建、加固和/ 或復壯)哺乳動物組織或細胞，所述方法和裝置不存在現(xiàn)有技術的缺點。優(yōu)選地，MSC定義為(在它們的細胞表面)表達1、2或(優(yōu)選地)3種陽性標志物，所述標志物選自⑶105、⑶73、⑶90 ；并且(在它們的細胞表面)缺少1、2、3、4或(優(yōu)選地)5種標志物的表達，所述標志物選自⑶45、⑶34、⑶14、⑶19和HLA-DR。作為替代地(或補充地)，當維持在標準培養(yǎng)條件下時，MSC是塑料粘附細胞。作為替代地(或補充地)，MSC能夠體外分化為成骨細胞、脂肪細胞和/或軟骨細胞。優(yōu)選地，EPC定義為(在它們的細胞表面)表達⑶133和⑶34兩者，并且優(yōu)選地還表達⑶31和/或⑶144，但是可能地不表達⑶45。作為替代地(或補充地)，以體外形成集落的能力來定義EPC，其中優(yōu)選地，集落定義為在外周具有更長的萌發(fā)細胞的圓形細胞的中央核心。作為替代地(或補充地)，以VEGF存在之下在基質膠測定(matrigel assay)中鋪板時其血管生成性質來定義EPC。優(yōu)選地，HSC定義為表達⑶34和⑶45標志物。本發(fā)明提出了方法和裝置，其在哺乳動物對象(包括人患者)中受損或患病組織的組織或細胞再生、重建或加固后降低或避免可能的移植物對宿主和宿主對移植物排斥以及感染的缺陷。本發(fā)明還提出了改善和簡化的方法和裝置，其可以不需要對老年患者或患有心臟病或損傷的患者來說特別有害的任何全身麻醉。有利地，本發(fā)明所述的產品、方法和裝置用于使組織或細胞再生。具體地，本發(fā)明提供了使得能夠獲得對(骨)重建來說具有滿意的結構和物理特性的新(骨)組織的方法和裝置。這些物理特性即包括形狀、機械強度和彈性。生物特性即包括在一些成熟組織(如骨、皮膚、脂肪或肌肉)中具有高增殖、定型和分化潛能的未成熟細胞的高比率和濃度。本發(fā)明還提供了治療心臟病的方法和裝置，其通過在骨髓中誘導高濃度的未成熟干細胞(包括MSC并且可能包括EPC (可能不包括HSC))和/或通過在血液中誘導高濃度的EPC細胞來動員干細胞。在實踐中，所有炎癥狀態(tài)(如外科手術或炎性疾病之后)也可以受益于本發(fā)明的方法和裝置，這是因為炎癥天然地動員干細胞，并且因為干細胞的增加可以天然地轉化為所需要的分化細胞。
本發(fā)明還提供了簡化的方法和裝置，其將降低或減少體外培養(yǎng)時間并減少所需的收獲骨髓的量。本發(fā)明涉及用于獲得干細胞(優(yōu)選MSC-EPC，可能地不包括HSC)以及可能地用于哺乳動物對象組織或細胞(優(yōu)選人患者的組織或細胞)的再生、重建、加固和/或復壯的方法和裝置，該方法包括以下步驟a)從該哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)中收集(流體)血液樣品； b)從該(流體)血漿樣品制備自體PRP，其中PRP的血小板率的濃度優(yōu)選地在該哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的全血的約100%至約1000%之間，更優(yōu)選地，在約200%至約500%之間；c)用有效量的(活性)哺乳動物(優(yōu)選人)化合物活化該自體PRP，所述化合物選自-凝血酶(異源、自體或者重組人或牛凝血酶)，其包括重組凝血酶(FII)(活化或未活化的)。-能夠產生凝血酶的化合物(凝血因子)，尤其是促凝血酶原激酶(thromboplastin)(組織因子)，優(yōu)選地重組促凝血酶原激酶(recombinant thromboplastin, rTF)，更優(yōu)選地人組織因子(hTF)，更優(yōu)選地重組人組織因子(rhTF)，更具體地為重組可溶性人組織因子(rshTF)，其可能與加入磷脂(phospholipid，PL)相組合， 所述磷脂如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，-CaCl2,-(重組)人因子VII或因子VIIa(如化合物N0V0SEVEN )，_(重組)人因子X (a),-(重組)組織因子和(重組)因子VII或(重組)因子Vila，-(重組)組織因子和因子)(a，-(重組)組織因子/因子-VIIa/因子Xa，-(重組)因子VIII;_(重組)因子IX，或-上述化合物的組合；從而獲得第一流體(溶液)，其含有濃縮的經活化自體富血小板血漿；d)在同一哺乳動物對象(優(yōu)選同一人患者)中選擇富含非胚胎(優(yōu)選MSC、EPC) 干細胞(優(yōu)選胸骨或髂嵴(sternum or iliac crest)的骨髓)或脂肪組織的目標注射區(qū)；e)將該第一流體(溶液)注射進哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的該目標注射區(qū)， 從而在該哺乳動物對象(優(yōu)選該人患者)中局部誘導干細胞(優(yōu)選MSC-EPC)的體內增殖；f)(可能地)在足夠的孵育時間后，從同一哺乳動物對象(優(yōu)選同一人患者)中該目標注射區(qū)收集富含(MSC、EPC)細胞的骨髓(流體)樣品，或者從該哺乳動物收集血液 (流體)樣品，或者從該哺乳動物收集脂肪樣品，以及從該樣品中回收干細胞；可能地，以確定的時間間隔(優(yōu)選每星期)將步驟a)至步驟e)或步驟a)至步驟 f)重復數次，優(yōu)選重復至少2次、3次或4次；g)可能地，收集第二血液(流體)樣品；h)可能地，從該第二血液(流體)樣品制備第二自體富血小板血漿；
i)可能地，通過添加有效量的步驟C)中所添加的上述活化化合物來活化該自體富血小板血漿，從而從該第二血液(流體)樣品中獲得含有濃縮的經活化自體富血小板血漿的第二流體(溶液)；j)可能地，將該第二流體(溶液)與富含干細胞的并且先前已收集的骨髓或血液 (流體)或脂肪樣品混合，從而獲得包含濃縮的經活化自體富血小板血漿和干細胞的組合物；k)可能地，將分化輔劑添加到這些干細胞中，優(yōu)選地添加到所述組合物(包含濃縮的經活化自體PRP和干細胞)中，其中這些輔劑包含在步驟c)中使用的上述活化化合物和/或用于細胞錨定的至少一種基質和用于獲得(誘導)干細胞向特定細胞分化的一種或多種成分，所述特定細胞如成骨類細胞(骨細胞、成骨細胞，……)、肌細胞、內皮細胞、 神經元細胞、肝細胞或成纖維細胞和角化細胞，其中這些成分優(yōu)選地選自維生素(維生素 C (L-抗壞血酸)、維生素D3 (1，25 (OH) 2D3維生素)、可的松(或可的松衍生物，如地塞米松、 氫化可的松、潑尼松龍、甲潑尼龍、地塞米松、曲安西龍、倍他米松)和可能的甘油磷酸酯(這些成分優(yōu)選地存在于聚DL-乳酸共聚乙醇酸(poly DL-lactic-co-glycolic acid, PLGA)、聚乙醇酸和/或聚L-乳酸(poly-L-lactic acid, PLLA)、海藻酸鹽支架(如微珠) 中，從而使得所述成分能夠緩慢釋放)和/或BMP2 (可能地，得自MEDTR0NICQ，或表皮生長因子，或神經生長因子，或本領域技術人員所知的任何其它細胞因子、生長或分化因子，從而誘導(MSC、EPC，可能不包括HSC)干細胞分化為“預定”已分化組織細胞并且可能地獲得所需組織的再生，和1)可能地，向包含濃縮的經活化自體富血小板血漿和干細胞的組合物中添加適當的膠凝劑(該膠凝劑優(yōu)選地得自步驟c)中添加的足夠量活化化合物)以獲得凝膠，和m)可能地，將所獲得的凝膠用作植入物，其通過可能地將因此所獲得的凝膠應用到哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)目標重建部位(如自體收獲的骨、同種異體移植物、異源移植物或膠原葉(collagen leaf))中/上實現(xiàn)，使得可在該重建部位發(fā)生組織重建。可以以確定的時間間隔(優(yōu)選每星期)將步驟a)至m)重復數次(優(yōu)選至少2、3 或4次)，從而獲得足夠量的干細胞。本發(fā)明還涉及用于獲得富含經活化MSC的(單個核)細胞(MSC)群體的方法，其包括以下步驟-任選地，活化骨髓干細胞，優(yōu)選地通過本發(fā)明的方法和/或通過添加PRP和凝血因子實現(xiàn)；-獲得經活化骨髓樣品；-任選地，富集該樣品的干細胞。優(yōu)選地，在用于獲得富含經活化MSC的(單個核)細胞(MSC)群體的該方法中， (當體外生長時)這些MSC形成集落的能力得到提高，更優(yōu)選地，提高至少約30% (至少約 50%，更優(yōu)選地提高至少約100% )。有利地或另外地，在用于獲得富含經活化MSC的(單個核)細胞(MSC)群體的該方法中，體外培養(yǎng)從來自該經活化骨髓的樣品中獲得的1000000個單個核細胞后，形成至少約13個(更優(yōu)選地至少約15個，更優(yōu)選地至少約20個)集落(CFU-F)。有利地或另外地，在用于獲得富含經活化MSC的(單個核)細胞(MSC)群體的該方法中，(體外)培養(yǎng)MSC后形成的集落(CFU-F)中至少約35% (更優(yōu)選地至少約40%， 更優(yōu)選地至少約50% )表達成骨標志物(如堿性磷酸酶)。優(yōu)選地，在用于獲得富含經活化MSC的(單個核)細胞(MSC)群體的該方法中，干細胞的富集是通過骨髓樣品的離心(得到流體上清，富含非MSC細胞和碎片的沉淀以及富含(經活化)MSC細胞的中間級分)以及通過回收該中間級分進行的。本發(fā)明的另一個方面涉及骨髓樣品，其包含(增加的)經活化MSC群體，其中(當體外生長時)優(yōu)選地該(經活化)MSC形成集落(CFU-F)的能力提高，更優(yōu)選地提高至少約 30% (更優(yōu)選地提高至少約50%，更優(yōu)選地提高至少約100% )。有利地(或另外地)，在包含(增加的)經活化MSC群體的該骨髓樣品中，體外培養(yǎng)從該樣品(優(yōu)選地，得自該經活化骨髓)獲得的1000000個單個核細胞后，形成至少約13 個(至少約15個，更優(yōu)選地至少約20個)集落(CFU-F)。有利地(或另外地)，在富含經活化MSC群體的該骨髓樣品中，MSC培養(yǎng)所形成的集落(CFU-F)中至少35% (更優(yōu)選地至少約40%，更優(yōu)選地至少約50%)表達成骨標志物 (如堿性磷酸酶)?？赡艿?，在獲得富含經活化MSC的MSC群體的該方法中和/或在富含經活化MSC 的該骨髓樣品中，EPC的(相對)含量未提高和/或HSC的含量降低。有利地，將通過本發(fā)明方法獲得的MSC細胞注射到哺乳動物對象(優(yōu)選人患者) 中，優(yōu)選地在靠近(或位于)再生部位處，或者作為替代地，通過血液輸注進行。根據本發(fā)明的方法可用于再生受損或患病組織或者用于回收特定干細胞，以用作表征毒性化合物作用的篩選細胞或者儲存(在庫中)備用，其是自體或異源的。根據本發(fā)明，術語“組織再生”表示從干細胞再生出新組織，術語“重建”或“加固” 定義為將該獲得的再生組織移植或整合到哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)中，其中需要組織修復或組織生長刺激。由于損傷、疾病或衰弱(衰老狀態(tài))影響患者組織或影響患者的一般全身健康狀況，因此可能需要組織修復或刺激。在以下情況下特別需要組織再生癌、 心肌病、先天性心臟病、冠狀動脈病、局部缺血、舒張功能不全、心內膜炎、心肌梗死、帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、泰-薩病(Tay-Sachs disease)、脊髓損傷、中風、腦血管意外 (cerebrovascular accident)、再生障礙性貧血、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、干燥綜合征(Sjorgen syndrome)、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫(Graves’ disease)、紅斑狼瘡、骨重建、骨萎縮、骨質疏松癥和骨加固以及可能的動脈粥樣硬化和心肌炎。因此，術語“重建部位”表示出于修復或加固的目的需要組織重建的哺乳動物內部的特定組織部位。根據本發(fā)明，“富血小板血漿(PRP) ”表示流體(溶液)，其中血小板濃度相對于所治療的哺乳動物對象(人患者)的基線靜脈計數提高了至少約100%，優(yōu)選地在約200%至 1000%之間，并且血小板濃度達到至少600，000個(每微升μ L)、至少800，000個/μ 1或至少1，000，000個血小板/ μ L，優(yōu)選地在約800，000個/ μ L (或約1，500，000個血小板) 至約6，000, 000個/ μ L (或約8，000, 000個血小板)之間，更優(yōu)選地在約2，000, 000個血小板/ μ L至約5，000, 000個血小板/ μ L之間。有利地，使用離心設備獲得PRP，如文獻US 671990UW002/08099UUS 6855119、W003/106040、W000/61256 和 W02004/024198 中所述的設備。
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在 Graziani F.等人’ Clinical oral implant research,第 17 卷，第 2 期， 212-219頁Q006)中測試了不同PRP濃度對細胞增殖的影響。似乎在2. 5倍濃度下實現(xiàn)了最大影響，更高的濃度則導致細胞增殖減少。在約72小時，鑒定出PRP對細胞增殖的影響最顯著。該血小板濃度為可以獲得的最大濃度的約一半。然而，對于一些細胞增殖來說，更高的PRP濃度可以是優(yōu)選的。凝血酶可以有利地為自體、異源或重組凝血酶，優(yōu)選地為重組凝血酶，如 ZYM0GENETICS公司所生產的凝血酶(www, zgi. com)。優(yōu)選地將約10至約200單位的(重組、牛或自體)凝血酶，更優(yōu)選地約10至約75 單位的(重組)凝血酶添加到6至20ml抗凝血(失活的)PRP中。因此，為了誘導非常緩慢的PRP凝固，將約0. 5單位/毫升至約33單位/毫升，優(yōu)選地約0. 5單位/毫升至約3. 75單位/毫升，更優(yōu)選地約1. 5單位/毫升至約3. 75單位 /毫升的(重組、?；蜃泽w)凝血酶添加到抗凝血(失活的)PRP中。作為替代地，為了誘導緩慢的PRP凝固，將約0. 5單位/毫升至約10單位/毫升， 優(yōu)選地約1.5單位/毫升至約10單位/毫升的(重組、?；蜃泽w)凝血酶添加到抗凝血 (失活的)PRP中。凝血酶單位是在37°C下30秒內使Iml草酸鹽血漿凝固的物質。還可使用參與哺乳動物凝血的其它凝血因子(因子VII、因子VIIa(NoVc^eVen ， 得自Novonordisk)、因子VIII、因子IX、因子X、因子)(a等)或參與凝血(或能夠產生凝血酶)的任何化合物。然而，優(yōu)選促凝血酶原激酶(人組織因子hTF或hTf)，這是因為它安全，可以以可溶性形式存在，并且與凝血酶不同，可控制凝血級聯(lián)并且獲得凝血的速度不太快。在EP 1239894中說明了所述組合物中可能存在的相關脂肪和其它分子的實例。優(yōu)選地，在向患者注射前(不久)，混合PRP和凝血因子(更優(yōu)選地，為可溶性人組織因子；shTf)。有利地，(優(yōu)選約20°C至約37°C之間的溫度)將PRP和凝血因子(更優(yōu)選可溶性人組織因子shTf)混合，并且(在約20°C至約37°C之間的溫度)保持可溶(優(yōu)選地幾分鐘)。更優(yōu)選地，當與凝血因子(更優(yōu)選shTf)混合時，PRP非常緩慢地凝固，優(yōu)選地，當混合時，(在約20°C至約37°C之間的溫度)保持(或能夠保持)液體(可溶的)超過1分鐘，更優(yōu)選地超過2、3、4或甚至5分鐘。更優(yōu)選地，當與凝血因子(更優(yōu)選shTf)混合時，PRP非常緩慢地凝固，優(yōu)選地，當注射到哺乳動物對象(人患者)中時，保持(或能夠保持)液體(可溶的)超過30秒，更優(yōu)選地超過1、2、3、4或甚至5分鐘。優(yōu)選地，將約600至約120000單位的(經活化的)因子VIIa(約12 μ g至約 M00 μ g)，更優(yōu)選地約600至約60000單位的(經活化的)因子VIIa(約12 μ g至約 1200 μ g)，更優(yōu)選地約600至約6000單位的(經活化的)因子VIIa (約12 μ g至約120 μ g) 添加到6至20ml抗凝血(失活的)PRP中。因此，(為了誘導PRP的緩慢凝固)，將約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml)至約20000 單位/毫升Goo μ g/ml)，優(yōu)選地約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml)至約10000單位/毫升 (200 μ g/ml)，更優(yōu)選地約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml)至約1000單位/毫升(20 μ g/ml)的(經活化的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。作為替代地，(為了引起PRP非常緩慢的凝固)，將約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml) 至約6000單位/毫升(120 μ g/ml)，優(yōu)選地約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml)至約3000單位 /毫升(60 μ g/ml)，更優(yōu)選地約30單位/毫升(0. 6 μ g/ml)至約300單位/毫升(6 μ g/ ml)；更優(yōu)選地約100單位/毫升O μ g/ml)至約300單位/毫升(6 μ g/ml)的(經活化的)因子VIIa添加到抗凝血(失活的)PRP中。人促凝血酶原激酶表示添加(不同)磷脂(磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和/或磷脂酰絲氨酸)的人組織因子(human tissue factor，hTF)。該hTf可以由263個氨基酸的 (完整)hTf、243個氨基酸之多肽的截短hTf (組織因子的胞質外尾和膜部分)或者僅219 或206個氨基酸之多肽的(截短)(可溶性)組織因子(僅胞質外尾)或它們的任何變體形式。優(yōu)選地，將100 μ g至3000 μ g,更優(yōu)選地約300 μ g至約900 μ g的可溶性組織因子添加到約6至約20ml抗凝血(失活的)PRP中。因此，(為了誘導非常緩慢的凝固)將約2 μ g/ml至約150 μ g/ml，優(yōu)選地約 15 μ g/ml至約150 μ g/ml，更優(yōu)選地約15 μ g/ml至約45 μ g/ml的可溶性組織因子添加到抗凝血(失活的)PRP中。作為替代地，(為了誘導PRP的緩慢凝固)，將約15 μ g/ml至約500 μ g/ml，優(yōu)選地約50 μ g/ml至約150 μ g/ml的可溶性組織因子添加到抗凝血(失活的)PRP中。(未修飾的)hTf的變體可包括不影響未修飾分子的功能活性(PRP活化)的一個或多個氨基酸的缺失、添加或取代。還可以通過參與凝血級聯(lián)的其它分子，優(yōu)選地，通過上述方法的步驟C)中所使用的活化化合物之一來獲得PRP活化。這些多種活化化合物，特別是凝血因子，可經受一個或多個失活步驟以避免一種或多種污染物(特別是細菌或病毒)的傳播。這種失活步驟可以是基于溶劑/去污劑的添加、干熱、UVC失活等的。在本發(fā)明方法中，特別是在上述方法的步驟k)中，將微珠用作藥物遞送系統(tǒng)，其中表層含有可的松，其中中間層含有抗壞血酸以及其中內層涂層包含β甘油磷酸酯。可以在根據本發(fā)明的方法中使用這些微珠的其它修飾以改善干細胞分化，特別地，用于它們在選中部位的募集以及它們的定型、向所需細胞的分化，如肌細胞、血管細胞、 神經元細胞、肝細胞、破骨細胞、成纖維細胞等。在一個優(yōu)選的實施方案中，在根據本發(fā)明的方法中，未實施步驟a)、b)和c)，并且如下所述改變了步驟d)和e)d)在哺乳動物對象中，優(yōu)選地在人患者的骨髓中，選擇富含干細胞的目標注射區(qū) (優(yōu)選地，哺乳動物的胸骨或髂嵴)，e)在哺乳動物對象(人患者)的該目標注射區(qū)中注射足夠量的在步驟c)中使用的干細胞活化流體或活化化合物，從而在不添加自體PRP的情況下在哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)中局部誘導(間充質)干細胞的直接體內增殖。所述方法該優(yōu)選實施方案的其它步驟f)至m)可對應于上述的那些。在另一個優(yōu)選的實施方案中，未實施步驟f)至m)，步驟a)至e)用于在哺乳動物對象(人患者)體內獲得干細胞增殖，特別是在干細胞濃度較低的老年人(50歲以上，優(yōu)選地，約60歲或65歲以上)中。優(yōu)選地，在對(人)患者身體進行可能的外科手術之前，實施通過干細胞刺激的該復壯步驟，從而改善組織或細胞的再生、重建、加固或復壯，特別是該人患者身體中受損或患病組織或細胞的再生、重建、加固或復壯。如果需要，可以如上述實施方案中所述，不使用步驟a)至c)并且如以上所建議的，通過選擇步驟d)和e)而不添加PRP來獲得所述刺激。在根據本發(fā)明的方法中，在足夠的孵育時間后，本領域技術人員可收集富含干細胞的骨髓(流體)樣品，(優(yōu)選地)來自目標注射區(qū)，或者收集也富含(EPC、MSC)干細胞的血液(流體)樣品。由于干細胞的體內增殖還誘導這些干細胞擴展到哺乳動物對象血液中，因此可以對血液(流體)樣品進行該回收步驟(f)。因此，通過本領域技術人員熟知的方法，如經典的去血漿透析法和裝置，有可能直接從血液(流體)樣品回收干細胞。本發(fā)明提供了作為藥物的(非凝固的和/或可溶性)PRP和(足夠量的)凝血因子或包含它們的(藥物)組合物，優(yōu)選地，其處于PRP和凝血因子的非凝固和/或可溶性混合物的形式。優(yōu)選地，在向患者注射前(不久)，將PRP和凝血因子(更優(yōu)選地，為shTf)混合。更優(yōu)選地，當與凝血因子(更優(yōu)選地，為shTf)混合時，PRP非常緩慢地凝固，優(yōu)選地，保持(或能夠保持)液體(非凝固和/或可溶)超過1分鐘，更優(yōu)選地，超過2、3、4或甚至5分鐘。凝血因子的足夠量表示使(失活的)PRP能夠(非常)緩慢地凝固的量。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了作為藥物的PRP和凝血因子(參與凝血的化合物)(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它們的(藥物)組合物，所述凝血因子選自(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(TF))、因子)Ca、因子VIIa或它們的混合物。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了 PRP和該凝血因子(參與凝血的化合物)(的非凝固和/ 或可溶混合物)或者包含它們的(藥物)組合物，其用作藥物用以富集哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的干細胞群，優(yōu)選EPC和/或MSC，更優(yōu)選地，不改變HSC群也不改變止血性。作為替代地，本發(fā)明提供了凝血因子，其優(yōu)選地選自(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(Tf))、因子Xa、因子VIIa或它們的混合物(更優(yōu)選可溶性組織因子(sTF)， 再優(yōu)選可溶性人組織因子(shTf))，其用作藥物以富集哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的干細胞群，優(yōu)選EPC和/或MSC，更優(yōu)選地，不改變HSC群也不改變止血性。本發(fā)明提供了用作藥物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它們的(藥物)組合物，所述凝血因子優(yōu)選地選自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子和因子Vila，更優(yōu)選可溶性hTf，特別地它們在制備用于治療和/或預防心血管(心臟相關或心臟)疾病的藥物中的用途，所述心血管疾病優(yōu)選地選自(退行性)心肌病、(先天性心臟病)、冠狀動脈病、局部缺血、舒張功能不全、動脈粥樣硬化、心肌炎、心內膜炎和心肌梗死。作為替代地，本發(fā)明提供了用作治療和/或預防心血管(心臟相關或心臟)疾病之藥物的凝血因子，其優(yōu)選地選自(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(Tf))、因子敘、因子VIIa或它們的混合物(更優(yōu)選可溶性組織因子(STf)，再優(yōu)選可溶性人組織因子(ShTf))，所述心血管疾病優(yōu)選地選自(退行性)心肌病、(先天性心臟病)、冠狀動脈病、 局部缺血、舒張功能不全、動脈粥樣硬化、心肌炎、心內膜炎和心肌梗死。本發(fā)明提供了用作治療和/或預防神經疾病之藥物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶混合物)或者包含它們的(藥物)組合物，所述凝血因子優(yōu)選地選自(可溶性) 促凝血酶原激酶(hTf)、因子fe和因子Vila，更優(yōu)選可溶性hTf，所述神經疾病優(yōu)選地選自帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、泰-薩病、脊髓損傷、中風和腦血管意外和肌萎縮性側索硬化(ALS)。作為替代地，本發(fā)明提供了用作治療和/或預防(哺乳動物對象的)神經疾病之藥物的凝血因子，其優(yōu)選地選自(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(Tf))、因子 Xa、因子VIIa或它們的混合物(更優(yōu)選可溶性組織因子(sTf)，更優(yōu)選可溶性人組織因子 (ShTf))，所述神經疾病優(yōu)選地選自帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、泰-薩病、脊髓損傷、中風和腦血管意外和肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。本發(fā)明提供了用作治療和/或預防退行性(自體免疫性)疾病之藥物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)，所述凝血因子優(yōu)選地選自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子Xa、因子Vila，更優(yōu)選可溶性hTf，所述疾病優(yōu)選地選自再生障礙性貧血、 多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫和紅斑狼瘡。作為替代地，本發(fā)明提供了用作治療和/或預防退行性(自體免疫性)疾病之藥物的(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(Tf))、因子)Ca、因子VIIa或它們的混合物(更優(yōu)選可溶性組織因子(sTf)，更優(yōu)選可溶性人組織因子(ShTf))，所述疾病優(yōu)選地選自再生障礙性貧血、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫和紅斑狼瘡。本發(fā)明提供了用作治療癌癥(白血病)和/或傳染性疾病(AIDQ之藥物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)或包含它們的(藥物)組合物，所述凝血因子優(yōu)選地選自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子fe和因子Vila、更優(yōu)選地可溶性hTf。作為替代地，本發(fā)明提供了用作治療癌癥(白血病)之藥物的(優(yōu)選可溶性)促凝血酶原激酶(或組織因子(Tf))，因子Xa，因子VIIa或它們的混合物(更優(yōu)選可溶性組織因子(sTf)，更優(yōu)選可溶性人組織因子(shTf))。本發(fā)明提供了用作治療和/或預防骨退行性相關疾病以及可能地用于骨重建或骨加固之藥物的PRP和凝血因子(的非凝固和/或可溶性混合物)或包含它們的(藥物) 組合物，所述凝血因子優(yōu)選地選自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf)、因子fe和因子Vila， 更優(yōu)選可溶性hTf，所述疾病優(yōu)選地選自骨萎縮、骨質疏松癥。有利地，將本發(fā)明的PRP和凝血因子(以非凝固和/或可溶性混合物的形式)(或分開地)同時注射到哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的髂嵴、胸骨和/或脂肪組織中，更優(yōu)選地，注射到所述人患者的髂嵴的骨髓中。有利地，在本發(fā)明的藥物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)約6至約 20ml PRP中約2 μ g/ml至約500 μ g/ml (可溶性)hTf的混合物，優(yōu)選地，將其注射到對象或患者的髂嵴、胸骨和/或脂肪組織中。作為替代地，在本發(fā)明的藥物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)約6 至約20ml PRP中約5單位至約500單位的因子的混合物，優(yōu)選地，將其注射到對象或患者的髂嵴或胸骨和/或脂肪組織中。作為替代地，在本發(fā)明的藥物中使用(非凝固和/或可溶性混合物形式的)約6 至約20ml PRP中約30單位/毫升至約20000單位/毫升的因子VIIa的混合物，優(yōu)選地， 將其注射到對象或患者的髂嵴或胸骨和/或脂肪組織中。本發(fā)明的另一個方面是(非凝固和/或可溶性的)藥物組合物，其可能地包含適當的藥物載體或稀釋劑、有效量的PRP和有效量的凝血因子，其選自-促凝血酶原激酶(組織因子)，優(yōu)選重組促凝血酶原激酶(rTf)，優(yōu)選地人組織因子(hTf)，更優(yōu)選重組人組織因子(rhTf)，更優(yōu)選重組可溶性人組織因子(rshTf)，更優(yōu)選添加了磷脂(PL)，更具體地為磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，或者，-因子VII (a)、-因子X (a)、-組織因子-因子VII(a)、-組織因子-因子VII(a)_因子X(a)、-因子VIII (a)、-因子IX(a)或上述化合物的組合，這些因子是活化或未活化的，其用于選自治療和/或預防下列的疾病心血管疾病、神經疾病、自身免疫性疾病、炎癥、肝損傷和/或骨質疏松癥。優(yōu)選地，在心臟病學中使用根據本發(fā)明的(非凝固和/或可溶性)藥物組合物，其中心血管(心臟或心臟相關)疾病優(yōu)選地選自動脈粥樣硬化、心肌病、先天性心臟病、心肌炎、冠狀動脈病、腦血管意外、舒張功能不全、心內膜炎、局部缺血和心肌梗塞。優(yōu)選地，在神經病學中使用根據本發(fā)明的(非凝固和/或可溶性)藥物組合物， 其中所述神經疾病優(yōu)選地選自帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、泰-薩病、脊髓損傷、中風、腦血管意外、再生障礙性貧血、肌萎縮性側索硬化(ALQ和/或多發(fā)性硬化。本發(fā)明的另一個方面是(非凝固(可溶性))PRP和凝血因子(優(yōu)選hTf)的(混合物)在干細胞體外增殖中的用途。本發(fā)明最后一個方面涉及包含多個元件和裝置的成套部件，以實施本發(fā)明方法的不同實施方案，具體地-用于收集自體PRP的離心設備以及可能地用于從哺乳動物的血漿中獲得自體凝血酶或異源凝血酶的裝置，-上述方法的步驟C)中所使用的一種或多種哺乳動物(優(yōu)選人)活化化合物(凝血因子)或包含這種(這些)化合物的流體(溶液)，可能地其存在于一個或多個小瓶中，-可能地，用于從哺乳動物對象中收集血液樣品和/或骨髓樣品和/或脂肪樣品的裝置，和-可能地，用于在富含MSC的目標注射區(qū)向所述哺乳動物對象再注射該自體PRP和 /或該活化化合物的裝置(注射器、針頭、管等)。優(yōu)選地，這些裝置適用于(自體)PRP和MSC活化化合物(凝血因子)或者包含它們的流體的注射，并且還適用于從富含干細胞的該目標注射區(qū)收集包含這些干細胞的骨髓液體樣品。有利地，這些裝置還適用于獲得與離心設備之間的連接，適用于收集所獲得的自體PRP (和可能的自體凝血酶)以及(同時)適用于將所收集的富血小板血漿流體(和可能的自體凝血酶)注射到同一患者的富含(間充質)干細胞的目標部位(胸骨、髂嵴或脂肪(脂肪性)組織)。這些裝置還用于從該目標注射區(qū)收集來自同一哺乳動物的骨髓流體樣品，該骨髓流體樣品在體內增殖后富含干細胞，并且可能地用于將這些干細胞與其雜質分離，優(yōu)選地通過離心(可能地，通過成套部件的離心設備)或通過US 2007/0276352中所述的裝置進行分離。這些裝置還可以包含適合的元件，其適于收集富含(間充質)干細胞的血液(流體)樣品和通過本領域技術人員熟知的手段將這些干細胞與血液(流體)樣品分離，以及可能地用于(優(yōu)選地)通過離心(可能地，通過成套部件的離心設備)將這些干細胞與其雜質分離。優(yōu)選地，這些裝置包括注射用注射器和收集用注射器，或者用于向骨髓或血液注射流體和/或從中收集流體的專用設備，優(yōu)選地，根據上述本發(fā)明的設備有利地與離心設備連接，優(yōu)選地，與文獻WO 03/106040,US 6855119,WO 02/080991 和 US 6719901 中所述的
離心設備連接。在根據本發(fā)明的成套部件中，所述干細胞活化化合物有利地存在于小瓶或注射器中，或者存在于用于向骨髓注射流體和/或從中收集流體的專用設備中，優(yōu)選地，根據上述本發(fā)明的設備與包含PRP的注射用注射器分開以避免快速凝固。還可能使用雙注射用注射器，其使得能夠在富含干細胞的目標注射區(qū)同時注射PRP和活化化合物(凝血因子)(即由Harvest USA出售的Smar jet 液體和噴霧遞送系統(tǒng)，用于產生PRP和凝血酶的其它系統(tǒng)，Harvest USA 的 SMARTPREP 、Medtronic 的自體血小板分離器 Magellan 、Depuy 的 Symphony 血小板濃縮系統(tǒng)、Johnson and Johnson 的 Acromed 設備、S0RIN-DIDEC0 的 Angel 、3i血小板濃縮設備或血庫中使用的其它設備)。成套部件還可包含不同的小瓶，其具有用于注射的不同活化化合物或流體，包括緩沖劑和分化化合物，或者包含這些化合物的流體，等等。根據本發(fā)明的注射用注射器或設備適用于在哺乳動物對象(優(yōu)選人受試者)的胸骨或髂嵴中注射。成套部件還可包含其它元件，如管、泵、閥，其用于允許適當的注射，用于從哺乳動物體充分收集以及用于使得根據本發(fā)明的方法能夠自動化進行。這些元件有利地集成在自動輸液系統(tǒng)中，該系統(tǒng)用于通過本領域技術人員熟知的適當自動輸液程序從手術部位向患者收集和再注射生物化合物。該成套部件還可包含執(zhí)行根據本發(fā)明的順序步驟的指令裝置，該裝置可以通過適合的計算機和適當的軟件來執(zhí)行和/或控制。


圖1示出了在通過本發(fā)明方法注射之前或之后，患者血液或患者骨髓中存在的每 IO6個非粘附細胞的內皮祖細胞數目。圖2:處理前后的EPC。圖3示出了通過本發(fā)明方法注射之前或之后，進行或未進行離體培養(yǎng)的MSC數目。圖4示出了 PRP+可溶性hTf注射(第0天)之前、之后3天和7天時，從患者血
16液或骨髓中獲得的能夠形成集落的EPC的數目。這強調了所述處理對血液中EPC的動員。圖5示出了 PRP注射后，MSC的體外培養(yǎng)。圖6示出了在刺激區(qū)中成纖維細胞集落形成單位(CFU-F)的提高。圖7示出了在注射部位(左側)或相對部位(右側)，在PRP+可溶性hTf注射之前(第0天)所獲得的或之后7天所獲得的MSC的體外增殖。所述處理提高了 MSC的擴增性能(與左側第7天和第0天相比)，但是在相對部位處降低。圖8示出了 PRP+可溶性hTf處理之前、之后3和7天時的血細胞群體。在處理后 3和7天，CD 34和CD 133(干細胞)陽性細胞要多得多，這反映了來自骨髓的動員。圖9示出了 PRP+可溶性hTf處理之前和之后7天在處理部位(左側)或在相對部位處所獲得的骨髓細胞群體。在兩個部位的處理都維持了 CD34和CD 133的水平，這強調了骨髓補充干細胞含量的能力。CD 31細胞在兩個部位均要多得多。圖10示出了能夠形成以下形式集落的細胞的相對數目，即間充質前體形式 (CFU-F)和表達被視作前成骨細胞標志物的堿性磷酸酶的間充質前體形式(CFU-O)。在 (GO)處理前、PRP+可溶性hTf處理后3天，在處理部位(G3和RG!3)或在相對部位(D3和 RD3)從骨髓收集細胞。還處理了部分細胞以富集間充質細胞(RG3和RD3)。圖11示出了以鈣和堿性磷酸酶為量度的向骨組織的分化。在(GO)處理前、在PRP+ 可溶性hTf處理后3天，在處理部位⑴幻或在相對部位(D!3)從骨髓收集細胞，并且將這些細胞在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)指定的時間。圖12示出了如圖10中所處理的細胞的原位鈣標記，但是這些細胞培養(yǎng)長達觀天。圖13示出了使用(較大量的)根據本發(fā)明所獲得的干細胞的患者頌的骨重建。左側處理后1周，顯示填充了 12cm3異源骨的植入物；右側處理M天后，顯示了同源組織重新形成并新排布了覆蓋植入物的骨組織。下圖處理后90天時的99Tc閃爍掃描術，證明了重建頌是由活組織(血管生成)組成的。發(fā)明詳述在本發(fā)明方法中，將人患者既用作供體又用作移植物的宿主。本發(fā)明方法的獨創(chuàng)性在于增殖細胞的步驟在原位進行，即體內進行而不再像現(xiàn)有技術那樣在體外進行。然而，根據本發(fā)明刺激的干細胞具有增加的體外生長(與未刺激的干細胞相比)。已知人患者所產生的干細胞的量在新生兒中非常大，但是隨年齡增長快速降低。因此，很難從患者，特別是老年患者中回收干細胞。因此，根據本發(fā)明的方法和裝置可用于在體內快速獲得大量干細胞并且在對患者的風險有限的情況下回收這些所得的干細胞。在效率方面與現(xiàn)有技術相比，該技術特征與經活化自體PRP的使用相結合為本發(fā)明的方法和裝置賦予了實實在在的優(yōu)勢。事實上，由于體外操作是(或可以)最大限度減少，因此，最大程度上降低了移植排斥的風險，優(yōu)化了方法的安全性。另外，本發(fā)明人觀察到，有利地，開展本發(fā)明方法和/或在使用根據本發(fā)明的PRP 和凝血因子后，患者血液中的白細胞含量幾乎不變。
然而，可在體外實現(xiàn)幾個步驟，尤其是細胞分化。還將表明富含PRP和可溶性hTf的培養(yǎng)基在誘導干細胞體外增殖以及保持它們未分化上更有效力。從人患者收集約20至約200ml的血液(液體)樣品，優(yōu)選地約60ml血液。從該收集的血液樣品中，有可能通過現(xiàn)有技術(W003106040、W000/61256、W02004/024198, US 6855119、W002/080991 和 US 6719901)中所述的 Magellan Medtronic 方法以及裝置或設備獲得自體富血小板血漿(自體PRP)(約6或約7至約40ml的PRP，優(yōu)選地，約7至約 IOml的PRP)制劑，其包含(人患者全血中原始濃度的約100%至約1000%或更高的)血小板濃度。將所獲得的自體富血小板血漿添加到干燥形式的凝血因子，每微升(約200至約 10000單位的凝血酶或約Img重組人組織因子(促凝血酶原激酶))，以形成含有濃縮的經活化自體PRP的第一溶液。調整血小板濃度以確保血小板在約37°C時的活力。作為替代地，不是將凝血酶或重組可溶性人組織因子(促凝血酶原激酶)添加到所述自體富血小板血漿中，而是(優(yōu)選地)可使用適合遞送流體至骨髓腔和/或將其抽出骨髓腔的現(xiàn)有永久性可移植裝置將自體PRP再注射到同一人患者的髂嵴、胸骨或脂肪(脂肪性)組織中。在臨注射前，將凝血因子(或CaCl2)添加到PRP注射器中。在同一人患者的髂嵴、胸骨和/或脂肪(脂肪性)組織中再注射該溶液，從而在所述患者中局部誘導(間充質和/或內皮祖細胞，但是有利地，不引起HSC增殖)干細胞的體內增殖。在注射后約3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 至約 21 天，(在
相同目標注射部位)收集富含(間充質)干細胞的骨髓樣品。3天和7天后，收集IOml血液和骨髓樣品以估計血液學參數(血細胞比容、血紅蛋白、白細胞)的最終改變。3天和7 天后，通過彼此相對進行的兩次穿刺收集骨髓樣品以比較EPC和MSC并證明干細胞在外周血中的動員。例如針對整形外科或對外科治療方法，如所計劃的在相同日期進行該收集步驟。優(yōu)選地，在確定的時間間隔(優(yōu)選每星期)重復這些收集步驟數次以獲得足夠的干細胞濃度。已知血小板釋放多種分子，其包括血小板衍生生長因子、轉化生長因子β、血小板衍生表皮生長因子、血小板衍生血管生成因子、胰島素樣生長因子1和血小板生長因子4。 這些分子對局部間充質和上皮細胞發(fā)出信號以遷移、分化并提高膠原和基質的合成。此外，將先前收集的骨髓樣品與富血小板血漿(優(yōu)選地，除了約Img重組人組織因子(促凝血酶原激酶)之外)或足夠量的上述凝血因子之一混合以獲得包含濃縮的經活化自體PRP和MSC的組合物。此外，可以添加一定量的約80mg/ml的維生素C (L_抗壞血酸)、維生素 D3(l, 25(0H)2D3維生素)和約濃度的地塞米松至該濃度以誘導增殖、分化和基質產生。優(yōu)選地，地塞米松與允許包封化合物(延遲)釋放的PLGA (聚DL-乳酸-共聚-乙醇酸)、PGA(vp8)(聚乙醇酸)、PLLA(聚L-乳酸)和/或海藻酸鹽支架(如微珠)一起制備?？梢允褂闷渌酆匣衔飦慝@得這些優(yōu)選化合物的有效包封和釋放。包含用于增強骨形成的活化化合物的這種支架與科學文獻(Mariani M.等人， Tissue Eng. 12 (3)，547-558 頁(2006)和 Inane B.等人，Tissue Eng. 12(2)257-266 頁 (2006))中已描述的相類似。所獲得的組合物類似于還包含適當膠凝劑(如海藻酸鹽或CaCl2溶液)的凝膠， 從而形成了可直接用于骨組織再生的糊劑(參見W02004/0M198)。本領域技術人員可以對此進行調整以獲得有效的擴增和/或分化。此外，可以在不同的步驟中使用細胞所表達的一些表型標志物(⑶34、⑶133、 CD45、NGF-R、產生細胞因子的，……)來跟蹤干細胞向未成熟細胞(未成熟骨原細胞)、成熟骨原細胞、前成骨細胞、成熟成骨細胞、骨細胞等的擴增和/或分化。還可以在本發(fā)明的方法和組合物中使用其它化合物，如轉錄調節(jié)子(Cbfa-1、 Msx-2 c-fos、fra-2、Dix-5，......)、淋巴因子(IL-I)、生長因子(TGF-β)、(EGF)。在骨髓中獲得第一類型的干細胞，其為⑶34+和⑶31+。圖1和2顯示使用本發(fā)明方法，有可能獲得骨髓和周圍血液中EPC的體內刺激(通過添加PRP和組織因子20至 1000 μ g可溶性組織因子(sTF)/6ml PRP，優(yōu)選地，100-700 μ g sTF/6ml PRP，更優(yōu)選地， 334 μ g sTF/6ml PRP)。此外，在最初培養(yǎng)(primo culture)前后，MSC還顯著并出乎意料地擴增(圖7)。表1.在骨髓(BM)中在人后髂嵴(左側)注射sTF-PRP之后，包括干細胞在內的細胞群
體的變化。
權利要求
1.作為藥物的富血小板血漿(PRP)和凝血因子。
2.根據權利要求1的藥物，其為非凝固(可溶性)混合物。
3.PRP和凝血因子在制備用于富集干細胞群的藥物中的用途，所述干細胞群優(yōu)選哺乳動物對象的內皮祖細胞和/或間充質干細胞的群。
4.PRP和凝血因子在制備用于治療和/或預防心血管疾病的藥物中的用途。
5.根據權利要求4的用途，其中所述心血管疾病選自(退行性)心肌病、(先天性)心臟病、冠狀動脈病、局部缺血、舒張功能不全、動脈粥樣硬化、心肌炎、心內膜炎和/或心肌梗死。
6.PRP和凝血因子在制備用于治療和/或預防神經疾病的藥物中的用途。
7.根據權利要求6的用途，其中所述神經疾病選自帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病、泰-薩病、脊髓損傷、中風、腦血管意外和肌萎縮性側索硬化(ALS)。
8.PRP和凝血因子在制備用于治療和/或預防自體免疫性疾病的藥物中的用途。
9.根據權利要求8的用途，其中所述自體免疫性疾病選自再生障礙性貧血、多發(fā)性硬化、類風濕性關節(jié)炎、干燥綜合征、I型糖尿病、突眼性甲狀腺腫和/或紅斑狼瘡。
10.PRP和凝血因子在制備用于治療和/或預防骨退行性疾病的藥物中的用途。
11.根據權利要求10的用途，其中所述骨退行性疾病選自骨萎縮、骨質疏松癥、骨重建和骨加固。
12.根據前述權利要求3至11中任一項的用途，其中所述藥物為可溶性混合物的形式。
13.根據前述權利要求3至12中任一項的用途，其中將所述富血小板血漿和所述凝血因子注射到哺乳動物對象的骨髓和/或脂肪性組織中，優(yōu)選地注射到所述哺乳動物對象的髂嵴或胸骨的骨髓中。
14.根據前述權利要求3至13中任一項的用途，其中所述哺乳動物對象為人患者。
15.根據前述權利要求中任一項的藥物，其中所述凝血因子選自(可溶性)促凝血酶原激酶(hTf或人組織因子)、因子Xa、因子Vila、因子X、因子VII或其混合物。
16.成套部件，其包含-離心設備，其用于從哺乳動物對象(優(yōu)選人患者)的血漿中獲得自體PRP和可能的自體凝血酶；-一種或多種哺乳動物(優(yōu)選人)的活化化合物，或者包含所述化合物的流體，其可能存在于小瓶中，-注射裝置，其用于注射自體PRP和MSC活化化合物或者包含所述化合物的流體，和-可能地，收集裝置，其從血液樣品或骨髓液樣品中收集干細胞。
17.根據權利要求16的成套部件，其中所述活化化合物選自-有效量的促凝血酶原激酶(組織因子或Tf)，優(yōu)選地重組促凝血酶原激酶(重組組織因子或rTf)，優(yōu)選地人組織因子(hTf)，更優(yōu)選地重組人組織因子(rhTf)，更優(yōu)選地重組可溶性人組織因子(rshTf)，更優(yōu)選地，添加了磷脂，更具體地，添加了磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺，或者-有效量的人因子VII，-有效量的人因子X，-有效量的組織因子-因子Vila，-有效量的組織因子敘， -有效量的組織因子-因子VIIa-因子fci， -有效量的因子VIII， -有效量的因子IX，或者-上述因子的組合，其中所述因子是活化的或未活化的。
18.骨髓樣品，其包含富含經活化MSC的群體。
19.根據權利要求18的骨髓樣品，其中所述MSC形成集落的能力得到提高。
20.根據權利要求18或19的骨髓，其中所述MSC形成集落的能力提高了至少約30%和 /或其中當培養(yǎng)所述骨髓樣品的1，000，000個單個核細胞時，獲得至少13個集落(CFU-F)。
21.凝血因子，其用作富集哺乳動物對象干細胞群的藥物。
22.凝血因子，其用作治療和/或預防心血管疾病的藥物。
23.凝血因子，其用作治療和/或預防哺乳動物對象神經疾病的藥物。
24.凝血因子，其用作治療和/或預防自身免疫性疾病的藥物。
25.凝血因子，其用作治療和/或預防癌癥和/或傳染性疾病的藥物。
26.根據前述權利要求21至25中任一項的藥物，其中所述凝血因子選自組織因子 (Tf)、因子Xa、因子VIIa或其混合物。
27.根據前述權利要求21至25中任一項的藥物，其中所述凝血因子是可溶性人組織因子。
28.使用足夠量的PRP和凝血因子進行非人胚胎干細胞體外培養(yǎng)的方法，優(yōu)選地所述凝血因子選自(可溶性)促凝血酶原激酶(人組織因子(hTf))、因子fe、因子VIIa或其混合物。
29.獲得富含經活化MSC的細胞群體的方法，其包括從經活化骨髓中獲得樣品的步驟。
30.根據權利要求四的方法，其中所述骨髓是(先前)通過添加PRP和凝血因子活化的。
31.根據權利要求四或30的方法，其還包括富集骨髓樣品中存在的干細胞的步驟。
32.根據權利要求31的方法，其中通過將骨髓樣品離心和回收中間級分來進行干細胞的富集。
33.根據前述權利要求四至32中任一項的方法，其中所述MSC形成集落的能力得到提尚ο
34.根據權利要求32或33的方法，其中所述MSC形成集落的能力提高了至少約30% 和/或其中當培養(yǎng)從經活化骨髓所獲得的樣品的1，000, 000個單個核細胞時，獲得至少13 個集落。
35.用于獲得非胚胎人干細胞和可能地用于使組織(優(yōu)選人患者組織)或細胞再生的方法，其包括以下步驟b)從哺乳動物對象收集血液樣品；c)從所述血漿制備自體PRP;d)通過添加哺乳動物(優(yōu)選人)活化成分來活化所述自體PRP，所述活化成分選自 -有效量的凝血酶，-有效量的促凝血酶原激酶，或-有效量的CaCl2, -有效量的因子VII， -有效量的因子X， -有效量的組織因子和因子Vila， -有效量的因子)(a，-有效量的組織因子、因子VIIa和因子fci， -有效量的因子VIII， -有效量的因子IX，或者 -上述因子的組合；從而獲得含有濃縮的經活化自體富血小板血漿的第一流體；e)在同一哺乳動物對象中選擇富含非胚胎干細胞的目標注射區(qū)；f)將所述第一流體注射到所述哺乳動物對象的所述目標注射區(qū)，從而在所述哺乳動物對象中局部誘導干細胞體內增殖；g)可能地，在足夠的孵育時間后，從同一哺乳動物對象中收集富含細胞的血液樣品和 /或骨髓樣品并回收所獲得的干細胞，優(yōu)選非胚胎人CD34+CD31+干細胞，可能地，將步驟a) 至步驟e)或步驟a)至步驟f)重復數次；h)可能地，收集第二血液流體樣品；i)可能地，從所述第二血液樣品制備第二自體PRP；j)可能地，通過活化成分來活化所述自體PRP，所述活化成分選自-有效量的凝血酶，-有效量的促凝血酶原激酶，或-有效量的CaCl2,-有效量的因子VII，-有效量的因子X，-有效量的組織因子和因子Vila，-有效量的組織因子和因子敘，-有效量的組織因子、因子VIIa和因子fci，-有效量的因子VIII，-有效量的因子IX，或者-上述因子的組合；從而獲得含有濃縮的經活化自體富血小板血漿的第一流體；k)可能地，將所述第二流體與先前收集的所述血液或骨髓流體樣品混合，從而獲得包含經活化濃縮的自體PRP和MSC的組合物；1)可能地，將分化輔劑添加到所述干細胞中，優(yōu)選地添加到包含經活化濃縮的自體 PRP和MSC的組合物中，其中所述輔劑包括用于細胞錨定的至少一種基質以及優(yōu)選地其他成分，所述其他成分選自維生素、可的松或可的松衍生物(地塞米松、氫化可的松、潑尼松龍、甲潑尼龍、地塞米松、曲安西龍、倍他米松)和/或β -甘油磷酸酯，從而誘導干細胞向分化(骨)組織細胞的分化并且可能地獲得組織再生，以及，m)可能地，向包含經活化濃縮的自體PRP和干細胞的所述組合物中添加能夠形成凝膠4組合物的適當膠凝劑，和η)可能地，將因此所獲得的凝膠組合物應用到所述哺乳動物(優(yōu)選人患者)的目標組織重建部位中/上，使得可在所述重建部位發(fā)生組織重建。
36.根據權利要求35的方法，其中所述孵育時間在3天至3個月之間，優(yōu)選地在15天至1月之間，更優(yōu)選地為3周。
37.根據前述權利要求35或36中任一項的方法，其中所述PRP所包含的血小板濃度在 600，000個血小板/微升至8，000, 000個血小板/微升之間。
38.用于組織重建的凝膠組合物，其有可能通過根據前述權利要求28至37中任一項的方法獲得，其包含通過足夠量的促凝血酶原激酶活化的濃縮自體PRP、非人胚胎干細胞和至少一種適當的膠凝劑以及可能的輔劑，所述輔劑選自維生素、可的松、可的松衍生物(地塞米松)或其混合物。
39.提高(優(yōu)選提高至少50%)來自哺乳動物對象的細胞因子之血液濃度的方法，其包括在所述哺乳動物對象中注射PRP和凝血因子的步驟。
40.根據權利要求39的方法，其中將所述PRP和凝血因子注射到骨髓中，優(yōu)選地注射到哺乳動物對象髂嵴的骨髓中。
41.根據權利要求39或40的方法，其中所述細胞因子為2、3或4種不同的細胞因子， 其選自FGF-2、VEGF, Rantes 和 BDNF。
42.根據前述權利要求39至41中任一項的方法，其中FGF-2、VEGF、Rantes和BDNF以外的其他細胞因子不受影響。
43.根據權利要求42的方法，其中所述細胞因子選自IGF-I、SDF-Ia、MIP-Iα和 PDGF或其混合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織產生、再生、重建、加固和/或復壯領域。更確切地，本發(fā)明涉及使特定組織再生的方法，所述組織優(yōu)選間充質組織如骨、脂肪、腱、肌肉、軟骨和骨髓基質以及血液學組織(RBC、WBC、血小板、淋巴細胞、血液干細胞(HSC)、內皮祖細胞(EPC)等)。本發(fā)明還涉及在哺乳動物對象優(yōu)選人患者中使用通過本發(fā)明方法獲得的(再生)組織重建、再生、復壯或加固受損或患病組織的方法。
文檔編號A61P25/00GK102341112SQ201080010659
公開日2012年2月1日 申請日期2010年2月5日 優(yōu)先權日2009年2月5日
發(fā)明者皮埃爾·菲利帕爾 申請人:皮埃爾·菲利帕爾