專利名稱：用于核磁共振研究的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建領(lǐng)域，特別涉及一種以化學(xué)物質(zhì)為致癌誘導(dǎo)物 質(zhì)，構(gòu)建金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型的方法。
背景技術(shù)：
目前，用于核磁共振成像研究的胰腺癌動(dòng)物模型主要有種植性胰腺癌動(dòng)物模型和 基因工程胰腺癌動(dòng)物模型。種植性胰腺癌動(dòng)物模型又分為異位種植性和原位種植性胰腺癌 動(dòng)物模型。異位種植性胰腺癌動(dòng)物模型是將胰腺癌細(xì)胞株或者胰腺癌瘤塊接種于動(dòng)物皮下， 在接種部位產(chǎn)生胰腺癌的一種模型，該模型優(yōu)點(diǎn)是可重復(fù)性，技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，腫 瘤可以量化，可以根據(jù)腫瘤生長(zhǎng)情況調(diào)整實(shí)驗(yàn)計(jì)劃。適合于評(píng)估抗癌新藥給予方法和療效。 局限性是(1)由于受到位置特異性影響，可能會(huì)產(chǎn)生藥物療效的假陽(yáng)性結(jié)果。(2)移植于 皮下的胰腺癌很少發(fā)生轉(zhuǎn)移，這與人的胰腺癌自然病程不一致，且轉(zhuǎn)移灶的腫瘤生物學(xué)特 性可以同原發(fā)灶不同。原位種植性胰腺癌動(dòng)物模型是將體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞或者是外科手術(shù)中采集的 腫瘤組織移植到裸鼠胰腺。它成瘤時(shí)間短，成瘤率高，維持了原有瘤組織的結(jié)構(gòu)，保持了人 體腫瘤的絕大部分生物學(xué)特性。這種方法的缺點(diǎn)是技術(shù)要求較高，因?yàn)椴捎玫膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物為 裸鼠，其本身沒(méi)有免疫力，耐受力差。無(wú)論是異位還是原位種植瘤模型，其腫瘤皆不是由胰 腺自身產(chǎn)生的，是“舶來(lái)品”，不能真正模擬人胰腺癌的發(fā)病機(jī)制及腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。基因工程胰腺癌動(dòng)物模型包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型和基因突變模型，從本質(zhì)上獲得與 人胰腺癌極為相似的模型，可對(duì)腫瘤形成早期階段進(jìn)行研究。其局限性在于那些組織學(xué)上 與人類相似的胰腺病變?cè)谶z傳學(xué)及生物學(xué)方面可能與人類明顯不同；建模時(shí)間難掌握、花 費(fèi)較高，數(shù)量上難以滿足實(shí)驗(yàn)要求；同時(shí)要保證轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)產(chǎn)物(如異體抗原)不會(huì)對(duì)藥 物治療效果產(chǎn)生影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種通過(guò)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)致癌的金黃 地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，此種構(gòu)建方法不僅能獲得組織病理學(xué)與人胰腺癌相似、可 模擬人胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程、用于核磁共振成像研究的胰腺癌動(dòng)物模型，而且操作簡(jiǎn)單， 費(fèi)用低。本發(fā)明所述金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，所用動(dòng)物為金黃地鼠，所用致 癌誘導(dǎo)物質(zhì)為N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺〔N-Nitrosobis (2-oxopropyl) amine,簡(jiǎn)稱BOP， 在說(shuō)明書(shū)的下述內(nèi)容中，所述BOP即為N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺〕，構(gòu)建操作將所述致 癌誘導(dǎo)物質(zhì)BOP用生理鹽水配制成濃度為lmg/ml的致癌誘導(dǎo)液，按1公斤金黃地鼠體重1 次使用IOmg BOP計(jì)算每次注射致癌誘導(dǎo)液的劑量，將所述致癌誘導(dǎo)液按計(jì)算的劑量于金黃 地鼠背部行皮下注射，每周一次，連續(xù)注射至少7周，停止注射致癌誘導(dǎo)液后正常飼養(yǎng)至少
323周，即形成金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型。上述方法中，所述金黃地鼠選用敘利亞金黃地鼠，8周齡，雌性，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。上述方法中，配制致癌誘導(dǎo)液所用生理鹽水中的NaCl濃度無(wú)嚴(yán)格要求，本發(fā)明選 用市售的0. 9%生理鹽水，其NaCl的質(zhì)量濃度為0. 9%。本發(fā)明具有以下有益效果1、本發(fā)明為胰腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建提供了一種與現(xiàn)有技術(shù)不同構(gòu)思的新方法。2、實(shí)驗(yàn)表明(見(jiàn)實(shí)施例2、實(shí)施例3)，所構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型在胰腺原 位產(chǎn)生胰腺癌，組織病理學(xué)與人胰腺癌相似，為胰腺導(dǎo)管腺癌；具有典型人胰腺癌臨床特征 如黃疸、營(yíng)養(yǎng)不良、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；在胰腺癌早期，12、13密碼子的K-ras基因就有很高的突變率。3、由于本發(fā)明所述方法構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型很好的模擬了人胰腺癌 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，因而可用于研究人胰腺癌的發(fā)病機(jī)制。4、將本發(fā)明所述方法構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型采用核磁共振成像，可觀察 胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，胰腺癌不同發(fā)展階段的磁共振成像特點(diǎn)；評(píng)估藥物及其他冶療措施 對(duì)胰腺癌及其轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)防作用和療效。5、由于僅用BOP和生理鹽水配制的致癌誘導(dǎo)液每周注射一次，連續(xù)注射至少7周， 因而本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，便于推廣。


圖1是本發(fā)明所述方法構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型的核磁共振掃描圖像，其 中，圖1A、圖1B、圖1C、圖ID分別是MR平掃(A)橫斷面SE TlffI ； (B)橫斷面FRFSET2WI ； (C)冠狀面SE TlffI ； (D)冠狀面FRFSE T2WI。A-D顯示，金黃地鼠胃、脾、左腎間有巨大腫 塊，信號(hào)不均，TlffI呈等、低混雜信號(hào)，T2WI呈等、高混雜信號(hào)，其內(nèi)見(jiàn)多個(gè)類圓形更長(zhǎng)Tl、 長(zhǎng)T2信號(hào)影；胰腺脾葉顯示不清，病灶邊緣與鄰近組織分界不清，胃、脾、左腎受壓移位；MR 診斷金黃地鼠胰腺脾葉腫瘤，胰腺癌。圖2是本發(fā)明所述方法構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型經(jīng)腹部縱行正中切口剖 腹后，所暴露出的胰腺腫瘤的光學(xué)照片。圖3是將本發(fā)明所述方法構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型的胰腺及腫瘤完整取 下，波恩式液(Bouin液)固定，石蠟包埋，切片，HE染色后的顯微光學(xué)照片(HE，10x物鏡， 放大倍數(shù)=442)。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及所形成的 胰腺腫瘤作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例11、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物敘利亞金黃地鼠(購(gòu)于四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng))，雌性，8周齡， 飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(川北醫(yī)學(xué)院自建)。
4
致癌誘導(dǎo)物質(zhì)Β0Ρ，購(gòu)自深圳市榮發(fā)意達(dá)貿(mào)易有限公司。生理鹽水NaCl質(zhì)量濃度為0.9%的生理鹽水(簡(jiǎn)稱0.9%生理鹽水)，購(gòu)自湖南 科倫藥業(yè)股份有限公司2、實(shí)驗(yàn)方法敘利亞金黃地鼠130只，每只原始體重IOOg左右(用電子秤稱量)，將其分為實(shí)驗(yàn) 組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為100只敘利亞金黃地鼠，對(duì)照組為30只敘利亞金黃地鼠。第一次注射時(shí)，將IOOmg BOP溶于80ml 0. 9 %生理鹽水，待完全溶解后定容至 100ml，配制成濃度為BOPlmg/ml的致癌誘導(dǎo)液，按1公斤金黃地鼠體重1次使用IOmg BOP 計(jì)算，實(shí)驗(yàn)組每只金黃地鼠第一次BOP的用量為lmg，第一次注射致癌誘導(dǎo)液的劑量為1ml。對(duì)照組中的敘利亞金黃地鼠用0. 9%生理鹽水注射，每只金黃地鼠第一次注射生 理鹽水的劑量為1ml。將實(shí)驗(yàn)組的敘利亞金黃地鼠背部中線部位皮膚用質(zhì)量濃度75%的酒精消毒，用 2. 5ml無(wú)菌注射器吸取配制好的致癌誘導(dǎo)液1ml，以30°角進(jìn)針，于背部行皮下注射(術(shù)者 戴無(wú)菌手套)。將對(duì)照組的敘利亞金黃地鼠背部中線部位皮膚用質(zhì)量濃度75%的酒精消毒，用 2.5ml無(wú)菌注射器吸取0.9%生理鹽水lml，以30°角進(jìn)針，于背部行皮下注射(術(shù)者戴無(wú) 菌手套)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的上述注射操作每周一次(注射操作后正常飼養(yǎng))，連續(xù)注射7 周。每次注射操作均要用電子秤稱量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中每只金黃地鼠的體重，按實(shí)驗(yàn)組金 黃地鼠的總體重配制所需的致癌誘導(dǎo)液，按1公斤金黃地鼠體重1次使用IOmg BOP計(jì)算實(shí) 驗(yàn)組中各金黃地鼠該次注射致癌誘導(dǎo)液的劑量。按照對(duì)照組金黃地鼠的總體重準(zhǔn)備所需的 0. 9%生理鹽水，按IOOg金黃地鼠體重使用Iml 0. 9%生理鹽水計(jì)算對(duì)照組中各金黃地鼠 該次注射0. 9%生理鹽水的劑量。注射停止后正常飼養(yǎng)23周，實(shí)驗(yàn)組中的敘利亞金黃地鼠即成為胰腺癌動(dòng)物模型。實(shí)施例21、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料、設(shè)備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)施例1構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型。水合氯醛購(gòu)自湖南科倫藥業(yè)股份有限公司超導(dǎo)MR成像儀型號(hào)1.5T，美國(guó)GM公司生產(chǎn)。2、實(shí)驗(yàn)方法對(duì)實(shí)施例1構(gòu)建的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型進(jìn)行常規(guī)橫斷面、冠狀面核磁共振掃 描，操作如下(1)術(shù)者帶無(wú)菌手套，用Iml無(wú)菌注射器吸取麻醉用藥物水合氯醛0.45ml (—只模 型鼠的劑量)，對(duì)實(shí)驗(yàn)組的模型鼠行腹腔注射。(2)將麻醉效果良好的模型鼠放入小鼠專用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)線圈，取仰臥位，頭先進(jìn)。(3)用超導(dǎo)MR成像儀對(duì)模型鼠進(jìn)行核磁共振掃描，掃描序列及參數(shù)橫斷面 SET Iff I, FRFSE T2WI ；冠狀面:SE T Iff I, FRFSE T2WL· 層厚:2mm ；層距0. 5mm ； FOV :6X6mm ； 矩陣256 X 192。(4)掃描結(jié)束后，將核磁 振掃描(MRI)圖像傳至工作站進(jìn)行測(cè)量。
核磁共振掃描(MRI)顯示，腫瘤位于胰腺脾葉，胃、脾、左腎之間，大小約 12mmX18mmX20mm，部分邊界欠清晰，信號(hào)不均勻，TlWI呈等、低混雜信號(hào)，T2WI呈等、高混雜 信號(hào)(見(jiàn)圖IA-圖1D)。實(shí)施例3實(shí)例2結(jié)束后，取出模型鼠10只，脫白法處死。術(shù)者帶無(wú)菌手套，持手術(shù)剪，鑷子， 經(jīng)模型鼠腹部縱行正中切口剖腹，暴露出的胰腺腫瘤見(jiàn)圖2。完整取下胰腺及腫瘤，波恩式液(Bouin液，購(gòu)于上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公 司)固定，石蠟包埋，切片，HE染色，IOx物鏡觀察(放大倍數(shù)=442)，如圖3所示癌性導(dǎo) 管不完整，細(xì)胞部分極性消失，核異型、濃染，核漿比例增大，見(jiàn)核分裂，杯狀細(xì)胞化生，間質(zhì) 內(nèi)纖維組織增生。病理診斷為胰腺高分化導(dǎo)管腺癌。對(duì)照組金黃地鼠按照實(shí)例2和實(shí)例3的方法進(jìn)行操作，MR圖像和解剖后組織學(xué)觀 察均未發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤形成。
權(quán)利要求
一種用于核磁共振研究的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，其特征在于所用動(dòng)物為金黃地鼠，所用致癌誘導(dǎo)物質(zhì)為N 亞硝基雙(2 氧丙基)胺，構(gòu)建操作將所述致癌誘導(dǎo)物質(zhì)N 亞硝基雙(2 氧丙基)胺用生理鹽水配制成濃度為1mg/ml的致癌誘導(dǎo)液，按1公斤金黃地鼠體重1次使用10mg N 亞硝基雙(2 氧丙基)胺計(jì)算每次注射致癌誘導(dǎo)液的劑量，將所述致癌誘導(dǎo)液按計(jì)算的劑量于金黃地鼠背部行皮下注射，每周一次，連續(xù)注射至少7周，停止注射致癌誘導(dǎo)液后正常飼養(yǎng)至少23周，即形成金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，其特征在于所述金黃地 鼠為敘利亞金黃地鼠，8周齡，雌性，飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，其特征在于配制致 癌誘導(dǎo)液所用生理鹽水中，NaCl的質(zhì)量濃度為0. 9%。
全文摘要
一種用于核磁共振研究的金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，所用動(dòng)物為金黃地鼠，所用致癌誘導(dǎo)物質(zhì)為N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺，構(gòu)建操作將所述致癌誘導(dǎo)物質(zhì)N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺用生理鹽水配制成濃度為1mg/ml的致癌誘導(dǎo)液，按1公斤金黃地鼠體重1次使用10mg N-亞硝基雙(2-氧丙基)胺計(jì)算每次注射致癌誘導(dǎo)液的劑量，將所述致癌誘導(dǎo)液按計(jì)算的劑量于金黃地鼠背部行皮下注射，每周一次，連續(xù)注射至少7周，停止注射致癌誘導(dǎo)液后正常飼養(yǎng)至少23周，即形成金黃地鼠胰腺癌動(dòng)物模型。
文檔編號(hào)A61K31/655GK101919867SQ20101908702
公開(kāi)日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者張小明, 楊正偉, 沈成義, 蒲宇, 馬青松 申請(qǐng)人:川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院