專利名稱：雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明 是一種用于預(yù)防雞的新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三種疫病 油乳劑疫苗的制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的發(fā)病率和病死率，世界各地多有發(fā) 生，且一旦爆發(fā)將給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。OIE將其 列為A類疫病。(殷震、劉景華，1997.動(dòng)物病毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)雞傳染性支氣管炎(Infectious Bronchitis, IB)感染可導(dǎo)致雛雞、肉雞發(fā)育緩 慢，產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋減少和蛋品質(zhì)下降等。OIE將其列為B類疫病。(殷震、劉景華，1997.動(dòng)物 病毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)雞傳染性法氏囊病(Infectiousbursal disease virus, IBD)是由雙 RNA病毒科 中的傳染性法氏囊病病毒引起的一種特殊疾病，損害幼雞法氏囊。特征是腹瀉、衰竭，法氏 囊先發(fā)生顯著炎癥和增大，繼之以萎縮，最后患雞死亡。本病除造成一些雛雞死亡外，還常 引起病愈雞免疫抑制，導(dǎo)致免疫接種失敗，增加雛雞對(duì)雞新城疫等許多疾病的易感性。(殷 震、劉景華，1997.動(dòng)物病毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)國(guó)內(nèi)外現(xiàn)在上市的商品化產(chǎn)品品種很多，但都是很單一的傳統(tǒng)疫苗，多次使用疫 苗尤其是滅活疫苗，不僅增加雞場(chǎng)人力和物力負(fù)擔(dān)，同時(shí)多次抓雞的注射應(yīng)激，還會(huì)影響生 產(chǎn)性能，致使雞群對(duì)疾病的易感性增大。加之近年來毒株的不斷變異，使得雖然推出的多種 選擇的疫苗，但仍然出現(xiàn)控制不住疫情發(fā)展的局面。所以迫使我們?cè)谝酝哂胁簧⒍?、抗體 滴度高、免疫保護(hù)期長(zhǎng)、受母源抗體影響小等優(yōu)點(diǎn)的油乳劑滅活疫苗的基礎(chǔ)上開發(fā)出更新 更好更適合預(yù)防這三種現(xiàn)狀流行性疾病的產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病的三種抗原，并 進(jìn)行合理復(fù)配制成雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三種疫病油乳劑疫苗，可以 有效預(yù)防雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病的發(fā)生，同時(shí)也可以大大減少人們的 勞動(dòng)強(qiáng)度，降低養(yǎng)禽業(yè)養(yǎng)殖戶的風(fēng)險(xiǎn)，而且保證了公眾健康。該三聯(lián)苗技術(shù)的主要相關(guān)內(nèi)容和所采用的技術(shù)手段(1)選育的新毒株要經(jīng)過血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗(yàn)進(jìn)行大量的臨床病料分析鑒 定工作，最后選出效價(jià)高、免疫原性好并能抵御雞傳染性支氣管炎流行毒攻擊的一株較理 想的制苗用毒株。(2)在傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，并且保證 各單一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一樣的效果。(3)利用美國(guó)進(jìn)口的Millipore濃縮機(jī)將抗原經(jīng)過超強(qiáng)濃縮，抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低疫病的發(fā)生及蔓延。(濃縮機(jī)的生產(chǎn)廠家，美國(guó)密理博。型號(hào)為CUP50)。(4)技術(shù)方案主要包括以下步驟1)生產(chǎn) 用菌毒種為L(zhǎng)a Sota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒和 E. coli BL21/pET28a-VP2株表達(dá)IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌；2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖La Sota株雞新城疫病毒和M41株傳染性支氣管 炎病毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活工藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)表達(dá)IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a_VP2株(本發(fā)明或 簡(jiǎn)稱為“基因工程菌”)，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌工藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒 VP2蛋白；3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。本發(fā)明的詳細(xì)描述1.疫苗生產(chǎn)用菌毒種的來源(1)雞新城疫病毒La Sota株和效檢用雞新城疫強(qiáng)毒北京株(CVCC AV1611株)均 購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；(2)雞傳染性支氣管炎病毒M41株購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號(hào)中國(guó)獸醫(yī) 藥品監(jiān)察所；(3)表達(dá)IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a_VP2株(中 國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保管，菌株保藏編號(hào)為M204038，長(zhǎng)江大學(xué)榮俊等提供，榮 俊.IBDVVP2基因重組質(zhì)粒Pbv220表達(dá)條件的優(yōu)化?！秳?dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展》2007年第4期；榮 俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效力及安全性試驗(yàn).《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第 6期)；傳染性法氏囊病病毒BC6-85株(CVCC AV7株)購(gòu)于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8 號(hào)中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；2.生產(chǎn)用種毒的制備雞新城疫病毒La Sota株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋 (如10_4或10_5)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0. lml。選接種后72 120小時(shí)死 亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌、對(duì)
雞紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于1 512 (微量法)的雞胚液混合，定量分裝于無菌安瓿中，冷凍 保存。注明收獲日期、毒種代次等。雞傳染性支氣管炎病毒M41株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀 釋(如10_2 10_3)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0. Iml0選接種后30 48小時(shí) 內(nèi)死亡的雞胚及48小時(shí)存活的雞胚胚液(尿囊液及羊水)，裝于無菌容器內(nèi)。將檢驗(yàn)無菌、 病毒含量> 106 0EID50/0. lml、對(duì)雞紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)為陰性的胚液混合，定量分裝于無菌 安瓿中，冷凍保存。注明收獲日期、毒種代次等。表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生產(chǎn)用菌種制備一級(jí)種子繁殖和鑒定將 各株凍干菌種分別接種于加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 36°C培養(yǎng)24小時(shí)，然后劃 線接種于加卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準(zhǔn)的典型菌落10個(gè)混合于少量 LB培養(yǎng)液中，接種于LB瓊脂斜面若干支、置35 36°C培養(yǎng)20 24小時(shí)，作為一級(jí)種子。 在2 8°C保存，不超過14日；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過4代。二級(jí)種子繁殖取一級(jí)種子 接種于加卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，35 36°C培養(yǎng)20 24小時(shí)。置2 8°C保存，應(yīng)不超過3日。3.制苗用病毒液的制備

(1)雞新城疫病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，接種10 11日 齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育與觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將60小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后，每 4 6小時(shí)照胚1次，死亡的胚隨時(shí)取出，至96小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上，置 于2 8°C冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于 50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。 同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在 2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，抽樣測(cè) 定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1 2048(微量法)時(shí)停止?jié)饪s，按中華人民共和國(guó)獸藥 典(中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二〇〇五年版三部.中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2005，本發(fā)明以下簡(jiǎn)稱為《中國(guó)獸藥典》)規(guī)定的方法進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生 長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌， 使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐口附 近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí)，開啟攪 拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。(2)雞傳染性支氣管炎病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_2或10_3)，接種10 11日 齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育和觀察雞胚接種后24小時(shí)照胚1次，棄去死胚。此后每4小時(shí)照胚1次，死 亡的雞胚隨時(shí)取出，直至48小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C中 冷卻12 24小時(shí)。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放 于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣檢測(cè)病毒含量，應(yīng)彡106 0EID50/0. 1ml。同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥 典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5曰。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，同時(shí)按 《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨 即進(jìn)行滅活。滅活將傳染性支氣管炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪 拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避 免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì) 時(shí)，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備
菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種二級(jí)種子菌液，37°C培養(yǎng)，待菌 液的0D600值達(dá)到0. 6 1. 0，加入0. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達(dá)到0. 02mol/L,再繼續(xù) 培養(yǎng)5 8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體 加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收 集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其充分 混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另一滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(shí)(以 罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超過 7日；_15°C以下保存，不超過60日。4.滅活疫苗的制備 經(jīng)過檢驗(yàn)合格后的半成品抗原進(jìn)行疫苗制備。油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并 加熱至80°C后，再加司本-80 6份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。水相制備將檢驗(yàn)合格的雞新城疫病毒液、傳染性支氣管炎病毒液、雞傳染性法氏 囊病病毒VP2蛋白等量混合，含有使0. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于IO8 tlEID5tl，M41 株傳染性支氣管炎病毒含量不低于IO6 tlEID5tl ；水相中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價(jià)按與 雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)計(jì)算不低于1 16。取滅菌后的吐溫-80 4 份，加入配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，充分振搖，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30分鐘，使 吐溫-80完全溶解。乳化取油相3份放入乳化罐中，開動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1份 后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最終濃度為 0. 01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 應(yīng)彡0. 5ml。本發(fā)明采用的技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于1.表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/ pET28a-VP2株(生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗用的工程菌種)是用分子生物 學(xué)的方法克隆的一株在我國(guó)流行的IBDV超強(qiáng)毒株的VP2基因，對(duì)基因序列進(jìn)行適當(dāng)修飾后 加載到表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后制成的。此重組菌株可表達(dá)傳染性 法氏囊病病毒的VP2蛋白，提取VP2蛋白制備成疫苗，免疫效果好、生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn) 成本低、純度高、使用安全，跟以往的制苗過程不一樣，并且將傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ) 上結(jié)合了基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，同時(shí)保證各單一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一樣的效果。2.本發(fā)明所采用的濃縮工藝是利用美國(guó)進(jìn)口的Millipore濃縮機(jī)濃縮，雖然目前 國(guó)內(nèi)外的一些廠家都采用此類濃縮技術(shù)，但是我們?cè)诒井a(chǎn)品的濃縮工藝環(huán)節(jié)中加大了抗原 濃縮倍數(shù)，經(jīng)過超強(qiáng)濃縮后的抗原，制備疫苗后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低了疫病 的發(fā)生及蔓延。本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生 產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和表達(dá)雞傳染性 法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株作為生產(chǎn)菌毒 種，超強(qiáng)濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動(dòng)物后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)， 降低了疫病的發(fā)生及蔓延。


圖1本發(fā)明工藝流程圖Al熏蒸消毒是指消毒劑采用熏蒸的方法對(duì)培養(yǎng)雞胚的孵化器進(jìn)行徹底消毒。A3 NDV、IBV接種雞胚指雞胚在 孵化至10 11日齡時(shí)接種雞新城疫、傳染性支 氣管炎在雞胚內(nèi)進(jìn)行繁殖。A4收毒在培養(yǎng)到規(guī)定的時(shí)期，將雞胚中繁殖的雞胚液病毒進(jìn)行收獲。A5 病毒濃縮將收獲的含毒雞胚液在2 8°C條件下采用美國(guó)Millipore超濾 濃縮機(jī)進(jìn)行抗原的濃縮，使其提高抗原含量，并同時(shí)對(duì)抗原做了進(jìn)一步的純化。A6測(cè)毒價(jià)測(cè)其抗原的血凝價(jià)。B5 破碎指?jìng)魅拘苑ㄊ夏业腣P2蛋白離心后收集菌體，加適量的PBS液進(jìn)行重 懸，在4°C下用超聲波破碎，使其菌體內(nèi)的蛋白充分釋放出來。C滅活將A組和B組的抗原液都用適量的甲醛溶液進(jìn)行滅活，滅活掉抗原活性 及外毒素。D 半成品檢驗(yàn)是指要進(jìn)行滅活檢驗(yàn)、VP2蛋白含量檢測(cè)、無菌檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢 驗(yàn)，使其各個(gè)指標(biāo)在半成品時(shí)合格，才能進(jìn)行下一步。E抗原配比指雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊3組的水相的抗原配比 是 1 1 1。F乳化指將含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即 成為成品的疫苗狀態(tài)。最佳實(shí)施方式實(shí)施例1(一 )抗原制備以及半成品檢驗(yàn)1.雞新城疫病毒液的制備(1)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，接種10 11日齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。(2)孵育與觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將60小時(shí)前死亡的雞胚棄去。此后， 每4 6小時(shí)照胚1次，死亡的胚隨時(shí)取出，至96小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上， 置于2 8°C冷卻12 24小時(shí)。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放 于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)。凝集價(jià)低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。 按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，抽樣測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1 2048 (微量法)時(shí)停止?jié)饪s，按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行 無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨即進(jìn)行滅活。(5)滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機(jī) 攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1 %。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐 口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí)，開 啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。 2.雞傳染性支氣管炎病毒液的制備(1)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_2或10_3)，接種10 11日齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。(2)孵育和觀察雞胚接種后24小時(shí)照胚1次，棄去死胚。此后每4小時(shí)照胚1 次，死亡的雞胚隨時(shí)取出，直至48小時(shí)，無論死亡與否，全部取出，氣室向上直立，置于2 8°C中冷卻12 24小時(shí)。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放 于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣檢測(cè)病毒含量，應(yīng)彡106 0EID50/0. 1ml。按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》 進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5曰。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機(jī)濃縮，至少濃縮4倍，按 《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)(可不移植)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)，并留樣備測(cè)毒價(jià)。濃縮后的胚液隨 即進(jìn)行滅活。(5)滅活將傳染性支氣管炎病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計(jì)量加入10%甲醛溶液，開啟 攪拌機(jī)攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以 避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(shí)(以罐內(nèi)溫度達(dá)到37°C開始 計(jì)時(shí)，開啟攪拌機(jī)連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個(gè)月。3.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備(1)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種二級(jí)種子菌液，37°C培養(yǎng)， 待菌液的0D600值達(dá)到0. 6 1. 0，加入0. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達(dá)到0. 02mol/L,再 繼續(xù)培養(yǎng)5 8h。開始小量通氣，逐漸增大氣量。(2)破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌 體加適量PBS液進(jìn)行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，離心30min， 收集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進(jìn)行滅活。(3)滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機(jī)攪拌，使其 充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另一滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(shí) (以罐內(nèi)液體溫度達(dá)到37°C開始計(jì)時(shí))，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超 過7日；_15°C以下保存，不超過60日。4.半成品檢驗(yàn)(1)雞新城疫病毒液1)病毒含量測(cè)定將濃縮后滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_7、10_8、 10_9 3個(gè)稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10 11日齡SPF雞胚5個(gè)，每胚0. 1ml，置36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于 1 128(微量法)者，判為感染，計(jì)算EID50，每0.1ml病毒含量SlO8 7EID5tl的胚液，方可 用于制苗。2)紅細(xì)胞凝集價(jià)測(cè)定取濃縮后滅活前的胚液，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行測(cè)定，其 凝集價(jià)不低于1 2048 (微量法)者，方可用于制苗。3)滅活檢驗(yàn)取10日齡SPF雞胚6個(gè)，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每個(gè)0.2ml，置 36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，雞胚非特異死亡應(yīng)不超過1個(gè)。對(duì)所有胚液 分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，均應(yīng)不出現(xiàn)凝集，將胚液收獲再盲傳一代，仍無凝集價(jià)時(shí)，認(rèn)為滅
活完全。4)無菌檢驗(yàn)取滅活的胚液按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。(2)傳染性支氣管炎病毒液 1)病毒含量測(cè)定將濃縮后滅活前取出的胚液進(jìn)行10倍系列稀釋，取10_5、10_6 和10_7 3個(gè)稀釋度，分別尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個(gè)，每胚0. lml，每日照胚2次， 觀察6日。6日后收取雞胚，無論死胚、活胚(接種后24小時(shí)內(nèi)死亡者除外)均稱重觀察雞 胚病變，其胎兒具有失水、卷縮、發(fā)育小(接種胎兒重量比對(duì)照胚最輕胎兒重量少2克以上) 等特異性病痕者，判為感染，計(jì)算EID5tlt5每0. Iml病毒含量> IO6 7EID5tl，方可用于制苗。2)無菌檢驗(yàn)取滅活的病毒液，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。3)滅活檢驗(yàn)取10日齡SPF雞胚6個(gè)，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每個(gè)0.2ml，置 36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，雞胚非特異性死亡應(yīng)不超過1個(gè)。對(duì)所有雞 胚進(jìn)行檢驗(yàn)，應(yīng)均不出現(xiàn)失水、卷縮、發(fā)育小等現(xiàn)象。將胚液收獲再盲傳一代，仍不出現(xiàn)失 水、蜷縮、發(fā)育小等現(xiàn)象時(shí)，認(rèn)為滅活完全。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白1) VP2含量檢測(cè)將制苗用VP2蛋白液對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒陽(yáng)性血清(購(gòu)自中 國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按常規(guī)方法進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，上清液中表達(dá)產(chǎn)物VP2的滴度(AGP效 價(jià))不低于1 64者，方可用于制苗。2)無菌檢驗(yàn)按《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。3)內(nèi)毒素檢測(cè)將滅菌后的VP2蛋白液按“附注”方法進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，內(nèi)毒素 含量不高于1000EU/ml者(用內(nèi)毒素< 0. 125EU/ml的氯化鈉注射液將VP2蛋白稀釋1000 倍，鱟試劑盒檢測(cè)為陰性)，方可用于制苗。( 二)疫苗制備(1)油相制備取優(yōu)質(zhì)注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻 并加熱至80°C后，再加司本-80 6份，至溫度達(dá)到125°C時(shí)維持30分鐘，冷卻后備用。(2)水相制備將檢驗(yàn)合格的雞新城疫病毒液、傳染性支氣管炎病毒液、雞傳染性法 氏囊病病毒VP2蛋白等量混合，使0. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于108_ 0EID50,雞傳染 性支氣管炎病毒含量不低于IO6 ciEID5tl ；水相中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價(jià)按與雞傳染 性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)計(jì)不低于1 16。取滅菌后的吐溫-80 4份，加入 配液罐中，同時(shí)加混合抗原液96份，充分振搖，開動(dòng)攪拌電機(jī)攪拌20 30分鐘，使吐溫-80 完全溶解。(3)乳化取油相3份放入乳化罐中，開動(dòng)電機(jī)，慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相1份后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最終 濃度為0.01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出 的水相應(yīng)≤0. 5ml。(4)分裝定量分裝，加蓋密封。實(shí)施例2成品檢驗(yàn)1. f生狀外觀乳白色乳劑。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不 擴(kuò)散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 應(yīng)≤0. 5ml。粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗 Iml，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需的時(shí)間，應(yīng)在6秒以內(nèi)。2.無菌檢驗(yàn)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行，應(yīng)無菌生長(zhǎng)。3.安全檢驗(yàn)用7 14日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀 察14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。4.效力檢驗(yàn)(1)雞新城疫部分效力檢驗(yàn)采用血清學(xué)方法進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果不符合規(guī)定時(shí)，可采用 免疫攻毒法進(jìn)行檢驗(yàn)。1)血清學(xué)方法用30 60日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1， 另5只不免疫作對(duì)照。接種后21 28日，每只雞分別采血，分離血清，按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥 典》進(jìn)行HI抗體效價(jià)測(cè)定。免疫組HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不低于1 16(微量法)， 未免疫對(duì)照組HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不高于1 4(微量法)。2)免疫攻毒法用30 60日齡SPF雞15只，10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1， 另5只不免疫作對(duì)照。接種后21 28日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強(qiáng)毒 (CVCC AV1611株)IO5 tlELD5tl，觀察14日。對(duì)照組應(yīng)全部死亡，免疫組應(yīng)保護(hù)至少7只。(2)雞傳染性支氣管炎部分用14 42日齡SPF雞25只，其中20只各點(diǎn)眼、滴鼻 接種傳染性支氣管炎活疫苗(Η120株)1羽份(0. 05ml)，另5只不接種作為對(duì)照。接種后 21 28日，分別采血，分離血清，同時(shí)免疫雞再分別肌肉接種三聯(lián)滅活疫苗0. 3ml，二免后 21 28日再將免疫雞和對(duì)照雞分別采血，分離血清。將兩次血清分別測(cè)HI抗體效價(jià)。免 疫組二免血清HI抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)比首免血清高4倍以上，未免疫對(duì)照組血清HI 抗體效價(jià)的幾何平均值應(yīng)不高于1 8(微量法)。(3)雞傳染性法氏囊病部分效力檢驗(yàn)以下方法任擇其一。1)血清學(xué)方法取21 28日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射 疫苗0. 2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同群飼養(yǎng)。接種后21 28日，每只雞分別采血，分 離血清，做瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。免疫雞應(yīng)至少有8只瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1 8，對(duì)照雞應(yīng)全部 陰性。2)免疫攻毒法取21 28日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫苗0. 2ml，另外10只不免疫作為對(duì)照，同條件下隔離飼養(yǎng)。接種后21 28日，所有免疫雞和 對(duì)照雞，每只點(diǎn)眼途徑接種100倍稀釋的雞傳染性法氏囊病強(qiáng)毒BC6-85株毒液0. Iml (實(shí) 含毒量> 100個(gè)BID)。攻毒后，每天觀察雞只的臨床表現(xiàn)，記錄發(fā)病和死亡雞數(shù)，至72 96小時(shí)，撲殺存活雞，逐只剖解，觀察法氏囊等病變。免疫雞應(yīng)至少8只正常，不出現(xiàn)法氏囊 病變；對(duì)照雞應(yīng)至少8只發(fā)病，出現(xiàn)明顯的法氏囊病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫 大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等一種以上病變)。5.甲醛、汞類防 腐劑殘留量測(cè)定按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》進(jìn)行測(cè)定，符合“獸用生物 制品通則的規(guī)定”。附注凝膠法檢查細(xì)菌內(nèi)毒素Pyrosate內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒Pyrosate凝膠法內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒作為世界上唯一的凝膠法內(nèi)毒素快速檢 測(cè)試劑，主要用于水、裂解液、透析液等終產(chǎn)品的內(nèi)毒素的快速檢測(cè)。成分樣品檢測(cè)管(SPL)管內(nèi)壁有鱟試劑樣品陽(yáng)性檢測(cè)對(duì)照管(PPC)管內(nèi)壁有內(nèi)毒素吸管特異性Pyrosate凝膠法內(nèi)毒素快速檢測(cè)試劑盒只對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生特異性，并排除 了(l，3)-i3-D-glUcans引起的假陽(yáng)性結(jié)果。敏感性本試劑盒的靈敏度為lEU/ml。作用與用途用于水、裂解液、透析液等終產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測(cè)。貯藏室溫保存，有效期為120個(gè)月。規(guī)格10次/盒。操作述式(1)在37°C溫箱中預(yù)熱所用器具。(2)將供試品用氯化鈉注射液(內(nèi)毒素< 0. 125EU/ml)適當(dāng)稀釋成不同倍數(shù)，待 測(cè)。(3)將0. 5ml稀釋不同倍數(shù)的供試品小心加入樣品檢測(cè)管(SPL)，并輕輕混勻。(4)用無熱原的吸管小心地從樣品檢測(cè)管中吸取0. 25ml的供試品加入樣品陽(yáng)性 檢測(cè)管(PPC)，輕輕混合60秒，即可。(5)將完全混勻后的樣品檢測(cè)管和樣品陽(yáng)性檢測(cè)管放置于37°C培養(yǎng)30min。(6)倒置樣品檢測(cè)管和樣品陽(yáng)性檢測(cè)管，觀察有無凝集。(7)當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)管(PPC)完全凝集判試驗(yàn)成立。(8)若樣品檢測(cè)管有凝集反應(yīng)，說明該稀釋度的供試品中內(nèi)毒素的含量> 1. OEU/ ml ；若樣品檢測(cè)管中無凝集反應(yīng)，說明該稀釋度的供試品中內(nèi)毒素含量< 1.0EU/ml。根據(jù) 稀釋度計(jì)算原供試品中內(nèi)毒素含量。
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該疫苗 主要成分是滅活的La Sota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒和E. coli BL21/ pET28a-VP2株大腸桿菌基因工程菌表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐劑.
2.一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征 在于(1)生產(chǎn)用菌毒種為L(zhǎng)aSota株雞新城疫病毒、M41株傳染性支氣管炎病毒和表達(dá)雞傳 染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株；(2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖LaSota株雞新城疫病毒和M41株傳染性支氣管炎病 毒，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活工藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培 養(yǎng)表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2 株，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌工藝制備成表達(dá)的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白；(3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述一種雞新城疫、M41株傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅 活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征在于三種滅活抗原等量混合，含有使0. Iml水相中雞新城疫病 毒含量不低于IO8 tlEID5tl，M41株傳染性支氣管炎病毒含量不低于IO6 tlEID5tl ；水相中傳染 性法氏囊病毒VP2蛋白效價(jià)按與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清的瓊擴(kuò)效價(jià)計(jì)不低于 1 16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、傳染性支氣管炎病毒M41株和表達(dá)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株作為生產(chǎn)菌毒種，超強(qiáng)濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動(dòng)物后抗體產(chǎn)生快，效價(jià)高，保護(hù)期長(zhǎng)，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。
文檔編號(hào)A61P31/14GK102068694SQ201010612089
公開日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者宮曉, 李昌友, 李曉林, 李陸梅, 郭偉偉 申請(qǐng)人:青島易邦生物工程有限公司