專利名稱：雞新城疫、禽流感(h9亞型)、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于預(yù)防雞的新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三種疫病 的油乳劑疫苗制備方法，屬于獸用生物制品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞新城疫(newcastle disease，ND)具有很高的發(fā)病率和病死率，世界各地多有發(fā) 生，且一旦爆發(fā)將給禽養(yǎng)殖業(yè)帶來毀滅性打擊，是危害養(yǎng)禽業(yè)的一種主要傳染病。OIE將其 列為A類疫病(殷震、劉景華，1997.動物病毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)。禽流感(H9亞型)(Avain Influenza H9 subtype)是由禽流感病毒(Avain Influenza virus)引起的、主要流行于動物和人類中的一種傳染性、死亡率高的急性、高度 傳染性疾病，廣泛發(fā)生于世界各地，對人類和養(yǎng)禽業(yè)危害很大(殷震、劉景華，1997.動物病 毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)。雞傳染性法氏囊病Qnfectious bursal disease virus, IBD)是由雙RNA病毒科 中的傳染性法氏囊病病毒引起的一種特殊疾病，損害幼雞法氏囊。特征是腹瀉、衰竭，法氏 囊先發(fā)生顯著炎癥和增大，繼之以萎縮，最后患雞死亡。本病除造成一些雛雞死亡外，還常 引起病愈雞免疫抑制，導(dǎo)致免疫接種失敗，增加雛雞對雞新城疫等許多疾病的易感性(殷 震、劉景華，1997.動物病毒學(xué).北京.科學(xué)出版社)。本發(fā)明人在已有的“雞新城疫滅活疫苗”和“傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫 苗”、“雞新城疫-傳染性法氏囊病二聯(lián)苗”、“雞新城疫-禽流感(H9亞型)二聯(lián)苗”等產(chǎn)品 的基礎(chǔ)上，開展雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是制備雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病的三種抗原， 并進行合理配比制成雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三種疫病的三聯(lián)油乳劑 疫苗(本發(fā)明又簡稱“三聯(lián)苗”)，可以有效預(yù)防雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊 病的發(fā)生，同時也可以大大減少人們的勞動強度，降低養(yǎng)禽業(yè)養(yǎng)殖戶的風(fēng)險，而且保證了公 眾健康。本發(fā)明涉及的三聯(lián)苗技術(shù)的主要相關(guān)內(nèi)容和所采用的技術(shù)手段(1)選育的新毒株經(jīng)過血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗進行大量的臨床病料分析鑒定 工作，最后選出HA效價高、免疫原性好并能抵御H9亞型各地方流行毒攻擊的一株較理想的 制苗用毒株。(2)在傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ)上結(jié)合基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，并且保證 各單一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一樣的效果。(3)利用美國進口的Millipore濃縮機將抗原經(jīng)過超強濃縮，抗體產(chǎn)生快，效價 高，保護期長，降低疫病的發(fā)生及蔓延。(濃縮機的生產(chǎn)廠家，美國密理博。型號為CUP50)。
(4)疫苗制備主要步驟為1)生產(chǎn)用菌毒種為La Sota株雞新城疫病毒、YBF003株禽流感病毒(H9亞型)和 E. coliBL21/pET28a-VP2株表達IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌；2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖La Sota株雞新城疫病毒和YBF003株禽流感病毒 H9亞型，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活工藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)表達IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a_VP2株(本發(fā)明或 簡稱為“基因工程菌”)，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌工藝制備成表達的傳染性法氏囊病毒 VP2蛋白；3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。本發(fā)明的詳細描述1.生產(chǎn)用種毒的來源(1)雞新城疫病毒La Sota株、效檢用雞新城疫強毒北京株(CVCC AV1611株)均 購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；(2)表達IBDV VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a_VP2株(中 國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保管，菌株保藏編號為M204038，長江大學(xué)榮俊等提供，榮 俊.IBDVVP2基因重組質(zhì)粒I^bV220表達條件的優(yōu)化?！秳游镝t(yī)學(xué)進展》2007年第4期；榮 俊.傳染性法氏囊病重組亞單位疫苗免疫效力及安全性試驗.《浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2007年第 6期)；傳染性法氏囊病病毒BC6-85株(CVCC AV7株)購于北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街8 號中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；(3)禽流感病毒(H9亞型)(本發(fā)明統(tǒng)稱為禽流感病毒，Avain Influenza virus) A/Chicken/shandong/11/05 (H9N2)株(簡稱 YBF003 株)，該毒株已于 2010 年 12 月 23 日 送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管 理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4503。2.生產(chǎn)用種毒的制備(1)雞新城疫病毒La Sota株生產(chǎn)用毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋 (如10_4或10_5)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0. lml。選接種后72 120小時死 亡且病痕明顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌、對
雞紅細胞凝集價不低于1 512(微量法)的雞胚液混合，定量分裝于無菌安瓿中，冷凍 保存。注明收獲日期、毒種代次等。(2)禽流感病毒YBF003株毒種制備將毒種用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_3或 1(Γ4)，尿囊腔內(nèi)接種10日齡SPF雞胚，每胚0. Iml0選接種后72 120小時死亡且病痕明 顯的雞胚，分別收獲雞胚液(尿囊液及羊水)，裝于滅菌容器內(nèi)。將檢驗無菌、對雞紅細 胞凝集價不低于1 256(微量法)的雞胚液混合，定量分裝于安瓿中，冷凍保存，注明收獲 日期、毒種代次等。(3)表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的生產(chǎn)用菌種制備一級種子繁殖和鑒定 將各株凍干菌種分別接種于加卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，35 36°C培養(yǎng)M小時，然后 劃線接種于加卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選取符合標(biāo)準的典型菌落10個混合于少 量LB培養(yǎng)液中，接種于LB瓊脂斜面若干支、置35 36°C培養(yǎng)20 M小時，作為一級種 子。在2 8°C保存，不超過14日；在培養(yǎng)基上傳代，應(yīng)不超過4代。二級種子繁殖取一級種子接種于加卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，35 36°C培養(yǎng)20 M小時。置2 8°C保存，應(yīng) 不超過3日。3.制苗用病毒液的制備(1)雞新城疫病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，接種10 11日 齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育與觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將60小時前死亡的雞胚棄去。此后，每 4 6小時照胚1次，死亡的胚隨時取出，至96小時，無論死亡與否，全部取出，氣室向上，置 于2 8°C冷卻12 M小時。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于 50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價。凝集價低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。 同時按《中華人民共和國獸藥典》(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇〇五年 版三部.中國農(nóng)業(yè)出版社，2005，本發(fā)明以下簡稱《中國獸藥典》)規(guī)定的方法進行無菌檢驗 (可不移植)，應(yīng)無菌生長。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮4倍，抽樣測定 紅細胞凝集價，凝集價不低于1 2048(微量法)時停止?jié)饪s，按《中國獸藥典》進行無菌 檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液隨即進行滅活。滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌， 使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐 口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37°C開始計時，開 啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個月。(2)禽流感(H9亞型)病毒液的制備接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_3或10_4)，接種10 11日 齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。孵育和觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將48小時前死亡的雞胚棄去。此后，每 4 6小時照胚1次，死亡雞胚隨時取出，直至96小時，無論死亡與否，全部取出，氣室向上 直立，置于2 8°C冷卻12 24小時。收獲將冷卻的雞胚取出，收獲雞胚尿囊液(先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于 50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價。凝集價低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。 同時按《中國獸藥典》規(guī)定的方法進行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長。收獲的胚液滅 活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮4倍，抽 樣測定紅細胞凝集價，凝集價不低于1 1024(微量法)時停止?jié)饪s。按《中國獸藥典》進 行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液隨即進行滅活。滅活將禽流感(H9亞型)病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌 機攪拌，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以 避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37°C開始 計時，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，應(yīng)不超過1個月。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備
菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體培養(yǎng) 基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種二級種子菌液，37°C培養(yǎng)，待菌 液的0D600值達到0. 6 1. 0，加入0. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達到0. 02mol/L,再繼續(xù) 培養(yǎng)5 他。開始小量通氣，逐漸增大氣量。破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收集的菌體加 適量PBS液進行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min,離心30min，收集 上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集VP2蛋白液隨即進行滅活。滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其充分 混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另一滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(以 罐內(nèi)液體溫度達到37°C開始計時)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超過 7日；_15°C以下保存，不超過60日。4.滅活疫苗的制備經(jīng)過檢驗合格后的半成品抗原進行疫苗制備。油相制備取礦物油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至80°C 后，再加司本-80 6份，至溫度達到125°C時維持30分鐘，冷卻后備用。水相制備將檢驗合格的雞新城疫病毒液、禽流感(H9亞型)病毒液、雞傳染性法氏 囊病病毒VP2蛋白按適當(dāng)比例混合，使0. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于IO8 tlEID5tl，禽 流感病毒含量不低于IO7 ciEID5tl ；水相中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價(與雞傳染性法氏 囊病毒標(biāo)準陽性血清的瓊擴效價)不低于1 16。取滅菌后的吐溫-80 4份，加入配液罐 中，同時加混合抗原液96份，充分振搖，開動攪拌電機攪拌20 30分鐘，使吐溫-80完全 溶解。乳化取油相2份放入乳化罐中，開動電機，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐加入水相1份 后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液，使其最終濃度為 0. 01%。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 應(yīng)彡0. 5ml。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)的區(qū)別在于1.本發(fā)明人所采用的A型禽流感病毒(H9亞型)毒株YBF003株，是在全國各地 經(jīng)過血清學(xué)、分子生物學(xué)等試驗進行大量的臨床病料分析鑒定的新毒株，它是一株HA效價 高、免疫原性好并能抵御H9亞型各地方流行毒攻擊的一株較理想的制苗用毒株。2.表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/ pET28a-VP2株(生產(chǎn)雞傳染性法氏囊病基因工程亞單位疫苗用的工程菌種)是用分子生物 學(xué)的方法克隆的一株在我國流行的IBDV超強毒株的VP2基因，對基因序列進行適當(dāng)修飾后 加載到表達質(zhì)粒載體pET28a上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后制成的。此重組菌株可表達傳染性 法氏囊病病毒的VP2蛋白，提取VP2蛋白制備成疫苗，免疫效果好、生產(chǎn)工藝操作簡單、生產(chǎn) 成本低、純度高、使用安全，跟以往的制苗過程不一樣，并且將傳統(tǒng)全病毒滅活疫苗的基礎(chǔ) 上結(jié)合了基因工程亞單位疫苗的復(fù)配，同時保證各單一病毒在聯(lián)苗中均有和單苗一樣的效^ ο3.本發(fā)明所采用的濃縮工藝是利用美國進口的Millipore濃縮機濃縮，雖然目前 國內(nèi)外的一些廠家都采用此類濃縮技術(shù)，但是我們在本產(chǎn)品的濃縮工藝環(huán)節(jié)中加大了抗原 濃縮倍數(shù)，經(jīng)過超強濃縮后的抗原，制備疫苗后抗體產(chǎn)生快，效價高，保護期長，降低了疫病
6的發(fā)生及蔓延。本發(fā)明的積極意義本發(fā)明涉及一種雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生 產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、A型禽流感病毒(H9亞型)毒株TOF003株和 表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株 作為生產(chǎn)菌毒種，超強濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動物后抗體產(chǎn)生快，效價 高，保護期長，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。


圖1三聯(lián)苗工藝流程圖，其中Al熏蒸消毒是指消毒劑采用熏蒸的方法對培養(yǎng)雞胚的孵化器進行徹底消毒。A3 NDV、IBV、AIV接種雞胚指雞胚在孵化至10 11日齡時接種雞新城疫、傳染 性支氣管炎、H9亞型禽流感病毒在雞胚內(nèi)進行繁殖。A4收毒在培養(yǎng)到規(guī)定的時期，將雞胚中繁殖的雞胚液病毒進行收獲。A5病毒濃縮將收獲的含毒雞胚液在2 8°C條件下采用美國Millipore超濾濃 縮機進行抗原的濃縮，使其提高抗原含量，并同時對抗原做了進一步的純化。A6測毒價測其抗原的血凝價。B5破碎指傳染性法氏囊的VP2蛋白離心后收集菌體，加適量的PBS液進行重懸， 在4°C下用超聲波破碎，使其菌體內(nèi)的蛋白充分釋放出來。C滅活將A組和B組的抗原液都用適量的甲醛溶液進行滅活，滅活掉抗原活性及
外毒素。D半成品檢驗是指要進行滅活檢驗、VP2蛋白含量檢測、無菌檢驗、內(nèi)毒素檢驗， 使其各個指標(biāo)在半成品時合格，才能進行下一步。E抗原配比指雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊3組的水相的抗原配比 是 1 1 1。F乳化指將含有抗原的水相和油相按照一定的配比方法充分的混合在一起，即 成為成品的疫苗狀態(tài)。最佳實施方式實施例1(一 )抗原制備以及半成品檢驗1.雞新城疫病毒液的制備(1)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_4或10_5)，按《全自動 接種機使用說明》要求，接種15460枚10 11日齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔， 置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。(2)孵育與觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將60小時前死亡的雞胚棄去。此后， 每4 6小時照胚1次，死亡的胚隨時取出，至96小時，無論死亡與否，全部取出，氣室向上， 置于2 8°C冷卻12 M小時。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，按《全自動收獲機使用說明》要求，收獲雞胚尿囊液 (先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價。凝集價低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。收獲的185000mL合格胚液，同時按《中國獸藥典》進 行無菌檢驗(可不移植)，無菌生長。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，應(yīng)不超過5日。(4)濃縮將收獲的胚液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮4倍，抽樣 測定紅細胞凝集價，凝集價不低于1 1024(微量法)時停止?jié)饪s，濃縮后40000mL胚液， 按《中國獸藥典》進行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無菌生長，并留樣備測毒價。濃縮后的胚液 隨即進行滅活。(5)滅活將雞新城疫病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟攪拌機 攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1 %。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以避免罐 口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°C滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37°C開始計時，開 啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，不超過1個月。2.禽流感(H9亞型)病毒液的制備(1)接種取生產(chǎn)用毒種，用滅菌生理鹽水作適當(dāng)稀釋(如10_3或10_4)，按《全自動 接種機使用說明》要求，接種10422枚10 11日齡易感雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔， 置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻胚。(2)孵育和觀察雞胚接種后，每日照胚1次，將48小時前死亡的雞胚棄去。此后， 每4 6小時照胚1次，死亡雞胚隨時取出，直至96小時，無論死亡與否，全部取出，氣室向 上直立，置于2 8°C冷卻12 24小時。(3)收獲將冷卻的雞胚取出，按《全自動收獲機使用說明》要求，收獲雞胚尿囊液 (先收活胚后收死胚)。吸取胚液放于50000ml滅菌容器內(nèi)，抽樣測定紅細胞凝集價。凝集 價低于1 256(微量法)者應(yīng)棄去。收獲的127000mL胚液同時按《中國獸藥典》規(guī)定方 法進行無菌檢驗(可不移植)，無菌生長。收獲的胚液滅活前在2 8°C保存，不超過5日。(4)濃縮將收獲的雞胚病毒液在2 8°C條件下，用超濾濃縮機濃縮，至少濃縮4 倍，抽樣測定紅細胞凝集價，凝集價不低于1 1024(微量法)時停止?jié)饪s。濃縮后41000ml 的胚液按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行無菌檢驗(可不移植)，應(yīng)無細菌生長，并留樣備測毒 價。濃縮后的胚液隨即進行滅活。(5)滅活將禽流感(H9亞型)病毒液導(dǎo)入滅活罐內(nèi)，計量加入10%甲醛溶液，開啟 攪拌機攪拌，使其充分混合，甲醛的最終濃度為0. 1%。加甲醛溶液后導(dǎo)入另一滅活罐中，以 避免罐口附近粘附的病毒未能接觸滅活劑。37°c滅活16小時(以罐內(nèi)溫度達到37°C開始 計時，開啟攪拌機連續(xù)攪拌)后取出，放2 8°C保存，不超過1個月。3.雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的制備(1)菌液培養(yǎng)用培養(yǎng)罐通氣培養(yǎng)，按容積裝入70%培養(yǎng)基(加卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基)及花生油消泡劑。滅菌后按培養(yǎng)基量的2% 4%接種二級種子菌液，37°C培養(yǎng)， 待菌液的0D600值達到0. 6 1. 0，加入0. 2mol/L α -乳糖，使終濃度達到0. 02mol/L,再 繼續(xù)培養(yǎng)5 他。開始小量通氣，逐漸增大氣量。(2)破菌培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集7312g菌體。收集的菌體用PBS液清洗2次，將收 集的菌體加適量PBS液進行重懸，在4°C下用超聲波破碎。破碎后的菌液，3000r/min，離心 30min,收集上清液。經(jīng)硫酸銨沉淀后，收集73000mLVP2蛋白液隨即進行滅活。(3)滅菌將收集的上清液中按比例加入10%的甲醛溶液，開啟攪拌機攪拌，使其 充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0. 2%，然后將胚液導(dǎo)入另一滅活罐內(nèi)，37°C滅活12小時(以罐內(nèi)液體溫度達到37°C開始計時)，以滅活殘存的大腸桿菌及毒素。2 8°C保存，不超 過7日；_15°C以下保存，不超過60日。4.半成品檢驗(1)雞新城疫病毒液1)病毒含量測定將濃縮后滅活前取出的胚液進行10倍系列稀釋，取10_7、10_8、 10- 個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10 11日齡SPF雞胚5個，每胚0. 1ml，置36 37°C繼 續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定紅細胞凝集價，凝集價不低于 1 128(微量法)者，判為感染，計算EID5tl，每0. Iml病毒含量彡IO8 5EID5tl的胚液，方可用 于制苗。2)紅細胞凝集價測定取濃縮后滅活前的胚液，按《中國獸藥典》附錄進行測定，其 凝集價不低于1 1024(微量法)者，方可用于制苗。3)滅活檢驗取10日齡SPF雞胚6枚，尿囊腔內(nèi)接種滅活病毒液，每胚O.aiil，置 36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，雞胚非特異死亡應(yīng)不超過1個。對所有胚液 分別測定紅細胞凝集價，均應(yīng)不出現(xiàn)凝集，將胚液收獲再盲傳一代，仍無凝集價時，認為滅
活完全。4)無菌檢驗取滅活的胚液按《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。(2)禽流感(H9亞型)病毒液1)病毒含量測定將濃縮后滅活前取出的胚液進行10倍系列稀釋，取10_6、10_7、 10- 個稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10 11日齡SPF雞胚5個，每胚0. 1ml，置36 37°C繼 續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定紅細胞凝集價，凝集價不低于 1 16(微量法)者，判為感染，計算EID5tl，每0.1ml病毒含量彡IO7 5EID5tl時，方可用于制
田ο2)紅細胞凝集價測定將濃縮后滅活前的胚液測定紅細胞凝集價，凝集價不低于 1 1024(微量法)者，方可用于制苗。3)無菌檢驗取滅活的胚液按《中國獸藥典》附錄進行檢驗，應(yīng)無菌生長。4)滅活檢驗取10日齡SPF雞胚6枚，尿囊腔內(nèi)接種滅活濃縮胚液，每胚0. ^il,置 36 37°C繼續(xù)孵育，每日照胚2次，觀察5日，對所有胚液分別測定紅細胞凝集價，均應(yīng)不 出現(xiàn)凝集，將胚液收獲再盲傳一代，仍無凝集價時，認為滅活完全。(3)雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白1) VP2含量檢測將制苗用VP2蛋白液對雞傳染性法氏囊病病毒陽性血清(購自中 國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)按常規(guī)方法進行瓊脂擴散試驗，上清液中表達產(chǎn)物VP2的滴度(AGP效 價)不低于1 64者，方可用于制苗。2)無菌檢驗按《中國獸藥典》進行，應(yīng)無菌生長。3)內(nèi)毒素檢測將滅菌后的VP2蛋白液按“附注”方法進行內(nèi)毒素檢測，內(nèi)毒素含 量不高于1000EU/ml者(用內(nèi)毒素小于0. 125EU/ml的氯化鈉注射液將VP2蛋白稀釋1000 倍，鱟試劑盒檢測為陰性)，方可用于制苗。( 二)疫苗制備1.油相制備取礦物油94份，硬脂酸鋁2份，在油相制備罐中混合均勻并加熱至 80°C后，再加司本-80 6份，至溫度達到125°C時維持30分鐘，冷卻后備用。
2.水相制備將檢驗合格的雞新城疫病毒液、禽流感(H9亞型)病毒液、雞傳染性法 氏囊病病毒VP2蛋白按適當(dāng)比例混合。使0. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于108_ 0EID50, 禽流感(H9亞型)病毒含量不低于IO7 tlEID5tl ；水相中傳染性法氏囊病毒上清液中VP2蛋白 的含量不低于1 16 (與雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準陽性血清的瓊擴效價)。取滅菌后的吐 溫-80 4份，加入配液罐中，同時加混合抗原液96份，充分振搖，開動攪拌電機攪拌20 30 分鐘，使吐溫-80完全溶解。水相總量共計120000mL。3.乳化取油相2份(240000mL)放入乳化罐中，開動電機，慢速轉(zhuǎn)動攪拌，同時徐徐 加入水相1份后，再以4000r/min攪拌30 40分鐘，在終止攪拌前加入1 %硫柳汞溶液， 使其最終濃度為0. 01%。成品疫苗共計360000mL。乳化后，取疫苗IOml加入離心管中，以 3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相應(yīng)不超過0. 5ml。4.分裝定量分裝，加蓋密封。實施例2成品檢驗1. f生狀外觀乳白色乳劑。劑型油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，均應(yīng)不擴散。穩(wěn)定性吸取疫苗IOml加入離心管中，以3000r/min離心15分鐘，管底析出的水相 應(yīng)不超過0. 5ml。粘度用Iml吸管(下口內(nèi)徑為1.2mm，上口內(nèi)徑為2.7mm)吸取25°C左右的疫苗 Iml，令其垂直自然流出，記錄流出0. 4ml所需的時間，應(yīng)在6秒以內(nèi)。2.無菌檢驗按《中國獸藥典》附錄進行，應(yīng)無菌生長。3.安全檢驗用7 14日齡SPF雞10只，每只肌肉或頸部皮下注射疫苗1ml，觀察 14日，應(yīng)不出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身不良反應(yīng)。4.效力檢驗(1)雞新城疫部分效力檢驗采用血清學(xué)方法進行檢驗，結(jié)果不符合規(guī)定時，可采用 免疫攻毒法進行檢驗。1)用30 60日齡SPF雞15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗20 μ 1，另5只 作對照。接種后21 觀日，每只雞分別采血，分離血清，進行HI抗體效價測定。免疫組血 清HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不低于1:16(微量法)，對照組每只雞的血清HI抗體效價 均應(yīng)不高于1 4(微量法)。2)免疫攻毒法用30 60日齡SPF雞15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗 20 μ 1，另5只作對照。接種后21 觀日，每只雞各肌肉注射雞新城疫病毒北京株強毒 (CVCC AV1611株)IO5 tlELD5tl，觀察14日。對照雞應(yīng)全部死亡，免疫雞應(yīng)至少保護7只。(2)禽流感(Η9亞型)部分效力檢驗1)血清學(xué)方法用30 60日齡SPF雞15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗 O.aiil，另5只作對照。接種后21 觀日，每只雞分別采血，分離血清，進行HI抗體效價測 定。免疫組血清HI抗體效價的幾何平均值應(yīng)不低于1 180 (微量法)，對照組每只雞的血 清HI抗體效價均應(yīng)不高于1:4(微量法)。
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2)免疫攻毒法用30 60日齡SPF雞15只，其中10只各皮下或肌肉注射疫苗 0. anl，另5只作對照。接種后21 觀日，每只雞翅靜脈注射10倍稀釋的YBF003株毒液， 每只0. 2ml (約含2 X IO6 0EID50)，于攻毒后5日，采集泄殖腔拭子，經(jīng)處理后，尿囊腔接種 10 11日齡SPF雞胚5枚，每胚0. anl，孵育觀察5日，無論死胚、活胚均應(yīng)測定雞胚液紅 細胞凝集價，每個拭子樣品接種的5枚雞胚中只要有1枚雞胚液的凝集價不低于1 16(微 量法)，即可判為病毒分離陽性。對病毒分離陰性的樣品，應(yīng)盲傳一次后再進行判定。免疫 雞應(yīng)至少9只病毒分離為陰性；對照雞應(yīng)至少4只病毒分離為陽性。(3)雞傳染性法氏囊病部分效力檢驗以下方法任擇其一。1)血清學(xué)方法取21 觀日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫 苗0. anl，另10只作對照。接種后21 觀日，每只雞分別采血，分離血清，進行瓊擴抗體效 價測定。免疫雞應(yīng)至少8只血清瓊擴效價不低于1 8，對照組每只雞的血清瓊擴效價均應(yīng) 為陰性。2)免疫攻毒法取21 觀日齡SPF雞20只，其中10只各肌肉或頸部皮下注射疫 苗0. anl，另10只作對照。接種后21 觀日，取所有免疫雞和對照雞，每只點眼攻擊100 倍稀釋的雞傳染性法氏囊病病毒強毒BC6-85株毒液0. Iml (實含毒量不低于100個BID)。 攻毒后，逐日觀察并記錄發(fā)病和死亡情況，至96小時，宰殺存活雞，逐只解剖，觀察法氏囊 等病變。免疫雞應(yīng)至少8只正常，不出現(xiàn)法氏囊病病變；對照雞應(yīng)至少8只發(fā)病，出現(xiàn)明顯 的法氏囊病病變(如胸肌或腿肌條狀出血、法氏囊腫大或萎縮、發(fā)黃、內(nèi)有膠凍樣分泌物等 一種以上病變)。5.甲醛、汞類防腐劑殘留量測定按《中國獸藥典》規(guī)定方法進行測定，符合“獸用 生物制品通則的規(guī)定”。附注凝膠法檢查細菌內(nèi)毒素Pyrosate內(nèi)毒素快速檢測試劑盒Pyrosate凝膠法內(nèi)毒素快速檢測試劑盒作為世界上唯一的凝膠法內(nèi)毒素快速檢 測試劑，主要用于水、裂解液、透析液等終產(chǎn)品的內(nèi)毒素的快速檢測。成分樣品檢測管(SPL)管內(nèi)壁有鱟試劑樣品陽性檢測對照管(PPC)管內(nèi)壁有內(nèi)毒素吸管特異性Pyrosate凝膠法內(nèi)毒素快速檢測試劑盒只對內(nèi)毒素產(chǎn)生特異性，并排除 了(l，3)-i3-D-glUcans引起的假陽性結(jié)果。敏感性本試劑盒的靈敏度為lEU/ml。作用與用途用于水、裂解液、透析液等終產(chǎn)品的內(nèi)毒素檢測。貯藏室溫保存，有效期為120個月。規(guī)格10次/盒。操作述式(1)在37°C溫箱中預(yù)熱所用器具。(2)將供試品用氯化鈉注射液(內(nèi)毒素< 0. 125EU/ml)適當(dāng)稀釋成不同倍數(shù)，待 測。
(3)將0. 5ml稀釋不同倍數(shù)的供試品小心加入樣品檢測管(SPL)，并輕輕混勻。(4)用無熱原的吸管小心地從樣品檢測管中吸取0. 25ml的供試品加入樣品陽性 檢測管(PPC)，輕輕混合60秒，即可。(5)將完全混勻后的樣品檢測管和樣品陽性檢測管放置于37°C培養(yǎng)30min。(6)倒置樣品檢測管和樣品陽性檢測管，觀察有無凝集。(7)當(dāng)陽性對照檢測管(PPC)完全凝集判試驗成立。(8)若樣品檢測管有凝集反應(yīng)，說明該稀釋度的供試品中內(nèi)毒素的含量> 1. OEU/ ml ；若樣品檢測管中無凝集反應(yīng)，說明該稀釋度的供試品中內(nèi)毒素含量< 1.0EU/ml。根據(jù) 稀釋度計算原供試品中內(nèi)毒素含量。
權(quán)利要求
1.一種雞新城疫、禽流感H9亞型、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗，其特征在于該疫苗 主要成分是滅活的La Sota株雞新城疫病毒JBF003株禽流感病毒H9亞型和E. coliBL21/ pET28a-VP2株大腸桿菌基因工程菌表達的傳染性法氏囊病毒VP2蛋白和疫苗佐劑，其中 TOF003株禽流感病毒H9亞型毒株已于2010年12月23日送交北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏 號為 CGMCC No. 4503。
2.一種雞新城疫、禽流感H9亞型、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法，其特征 在于(1)生產(chǎn)用菌毒種為LaSota株雞新城疫病毒、YBF003株禽流感病毒H9亞型和表達雞 傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/pET28a-VP2株；(2)分別按常規(guī)方法用雞胚繁殖LaSota株雞新城疫病毒和TOF003株禽流感病毒 H9亞型，收獲病毒液后經(jīng)濃縮和滅活工藝制備成滅活病毒液；用加卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基培養(yǎng)表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E. coli BL21/ pET28a-VP2株，經(jīng)過破菌、硫酸銨提取和滅菌工藝制備成表達的傳染性法氏囊病毒VP2蛋 白；(3)將以上制備的三種滅活抗原混合后按常規(guī)方法制備滅活佐劑疫苗。
3.如權(quán)利要求2所述一種雞新城疫、禽流感H9亞型、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的 生產(chǎn)方法，其特征在于三種滅活抗原等量混合，使0. Iml水相中雞新城疫病毒含量不低于 IO8 tlEID5tl，禽流感病毒含量不低于IO7 tlEID5tl ；水相中傳染性法氏囊病毒VP2蛋白效價按與 雞傳染性法氏囊病毒標(biāo)準陽性血清的瓊擴效價計算不低于1 16。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫、禽流感(H9亞型)、傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗的生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用新城疫病毒La Sota株、A型禽流感病毒(H9亞型)YBF003株和表達雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的大腸桿菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2株作為生產(chǎn)菌毒種，超強濃縮工藝和優(yōu)質(zhì)佐劑制備成滅活疫苗，免疫動物后抗體產(chǎn)生快，效價高，保護期長，降低了疫病的發(fā)生及蔓延。
文檔編號A61P31/16GK102139104SQ20101061198
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者宮曉, 徐寶娟, 李昌友, 李陸梅, 王紅 申請人:青島易邦生物工程有限公司