專利名稱：一種從波棱瓜中提取具有抗菌活性組分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用溶劑提取、萃取和利用硅膠柱層析從波棱瓜子中提取抗菌有 效組分的方法，屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
波棱瓜又名塞季美朵、塞美塞古傷umpedunculosum Bailll)，為葫 蘆科波棱瓜屬一年生攀援狀藤本植物，在西藏主要分布于藏東南地區(qū)海拔2600 3000m的 山坡林緣及村寨等附近。波棱瓜子為葫蘆科植物波棱瓜的干燥種子，味苦，性寒，具有清熱 解毒，柔肝瀉肝火，解膽熱膽毒的功效，用于治療赤巴病，肝病，膽病以及消化不良。《晶珠本 草》載“波棱瓜子性涼、銳，治赤巴人臟腑?，F(xiàn)代著作《中藥大辭典》、《中華藥海》、《中藥辭 ?！?、《全國中草藥匯編》、《中華本草》、《新華本草綱要》、《中國藏藥》、《藏藥志》、《部頒藥品標(biāo) 準(zhǔn)(藏藥)》第一冊、《中國藥典》等均有收載，國家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的藏藥制劑中，涉及30多 個處方使用波棱瓜子。目前，對于波棱瓜的抗菌活性國內(nèi)外還未見到報道，因此本發(fā)明對波棱瓜子的醇 提物，乙酸乙酯萃取部位的有效部位和抗菌活性進(jìn)行了研究。本發(fā)明對金色葡萄球菌、白色 念球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌4種菌具有不同程度的抑制作用，可開發(fā)為天然抗菌劑應(yīng) 用于醫(yī)藥行業(yè)，制備出具有抗菌作用的各種形式的產(chǎn)品，為藏藥波棱瓜的開發(fā)開拓新領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從波棱瓜子中提取出具有抗菌活性的有效組分的方法。本發(fā)明方法是利用溶劑從干燥粉碎的波棱瓜子中通過固液提取法提取出粗提物， 濃縮得到浸膏，然后通過脫脂、濃縮、萃取得到具有顯著抗菌效果的萃取物，對萃取物進(jìn)行 進(jìn)一步硅膠柱層析分離，得到有效提取組分。具體分為以下步驟
步驟一取波棱瓜子，干燥粉碎過，用5-10倍量75%-95%乙醇或甲醇溶液，室溫下浸提 3-6次；合并濾液，濃縮為浸膏；濃縮可以通過減壓濃縮、低溫冷凍干燥和噴霧干燥方法。步驟二 濃縮浸膏懸浮于去離子水中，以石油醚、乙醚等有機(jī)溶劑(有機(jī)溶劑/去 離子水，ν/ν=1/Γ /4)脫脂至有機(jī)溶劑層淺黃色、淺綠色或無色(3-6次)；
步驟三脫脂后的水層，以乙酸乙酯或氯仿等與水不相混溶的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取(有機(jī) 溶劑/去離子水，V/V=l/廣1/4)，萃取3-6次，合并萃取液，濃縮為浸膏；濃縮可以通過減壓 濃縮、低溫冷凍干燥和噴霧干燥方法。步驟四將步驟三中的浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，硅膠柱層析為正相硅膠柱層析；所 用流動相正相為石油醚-乙酸乙酯，比例為100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1,8:1,5:1, 2:1,1:1 ；以柱體積1/20為一個流分收集，合并各組分層析洗脫液，濃縮得到各個組分，分 別編號 Fr. I-Fr. 10。
將以上提取得到的組分進(jìn)行抗菌實驗，證明它們對金色葡萄球菌、白色念球菌、枯 草芽孢桿菌、沙門氏菌與藤黃微球菌等4種菌有不同程度的抑制作用。本發(fā)明首次報道了波棱瓜子乙酸乙酯提取物具有抗菌活性，并確定了其抗菌的有 效部位；本發(fā)明所述的波棱瓜子為葫蘆科植物波棱瓜的干燥種子。利用本發(fā)明制備得到的有效組分，結(jié)合中、西藥制藥中常規(guī)的可藥用輔料，可以制 備成各種藥物組合物，如片劑、膠囊劑、顆粒劑、注射劑、皮膚外用制劑等。這些藥物組合物 可以用于預(yù)防或/和治療肺炎、淋巴結(jié)炎、子宮頸炎、盆腔炎等與革蘭氏陽性菌尤其是金黃 色葡萄球菌引起的有關(guān)生理改變或疾病，或治療由沙門氏菌引起的腹瀉等疾病。
具體實施例方式實施例1
取波棱瓜子，干燥粉碎過，用5倍量95%乙醇，室溫下浸提3次，每次浸泡時間12小時； 合并濾液，減壓濃縮為浸膏；將浸膏懸浮于去離子水中，以石油醚(石油醚水，V/V=l 1)脫 脂5次，至石油醚層淺黃色；脫脂后的水層，以乙酸乙酯(V/V=l 1)進(jìn)行萃取，3次，合并萃取 液，減壓濃縮為浸膏；浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，硅膠柱層析為正相硅膠柱層析；所用流動相正 相為石油醚-乙酸乙酯，比例為 100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1，1:1，按 照洗脫液極性合并流出液，濃縮得到10組分(Fr. I-Fr. 10)，濃縮液干燥為粉末。實施例2:
取波棱瓜子，干燥粉碎，用8倍量75%乙醇，室溫下浸提4次，每次浸泡時間24小時； 合并濾液，減壓濃縮為浸膏；將浸膏懸浮于去離子水中，以石油醚(石油醚水，V/V=l:4)脫 脂6次，至石油醚層淺黃綠色；脫脂后的水層，以乙酸乙酯(乙酸乙酯/ 7jC, V/V=l/2)進(jìn)行 萃取，6次，合并萃取液，減壓濃縮為浸膏；浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，硅膠柱層析為正相硅膠柱 層析；所用流動相正相為石油醚-乙酸乙酯，比例為100:0，100:1,50:1,30:1,20:1，10:1， 8:1，5:1，2:1，1:1，按照洗脫液極性合并流出液，濃縮得到10個組分(Fr. I-Fr. 10)，濃縮液 干燥為粉末。實施例3:
取波棱瓜子，干燥粉碎，用10倍量75%甲醇，室溫下浸提5次，每次浸泡時間24小時； 合并濾液，冷凍干燥濃縮為浸膏；將浸膏懸浮于去離子水中，以乙醚(乙醚/水，V/V=l:2)脫 脂5次，至乙醚層淺黃綠色；脫脂后的水層，以氯仿(氯仿/水，V/V=l: 1)進(jìn)行萃取，5次，合 并萃取液，減壓濃縮為浸膏；浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，硅膠柱層析為正相硅膠柱層析；所用流 動相正相為石油醚-乙酸乙酯，比例為 100:0，100:1，50:1，30:1，20:1，10:1，8:1，5:1，2:1， 1:1，按照洗脫液極性合并流出液，濃縮得到10個組分(Fr. I-Fr. 10)，濃縮液干燥為粉末。實施例4
抗菌生物活性篩選試驗
1)菌種活化第一次活化將菌種從-70度冰箱中取出后，置冰盒上自然解凍，
用接種環(huán)移植到平板上，劃線分離得單菌落。挑選單菌落加入裝有LB液體培養(yǎng)基的EP管 中，適宜溫度下培養(yǎng)(細(xì)菌30-35° C, 48 h，真菌3-28° C，48_72 h);第二次活化挑選一活 后的菌液，用接種環(huán)移植到平板上，劃線分離得單菌落。挑選單菌落加入裝有LB液體培養(yǎng) 基的EP管中，適宜溫度下培養(yǎng)。將二活后的菌液永移液槍轉(zhuǎn)移到裝有約50mL LB液體培養(yǎng)基中(硫酸鏈霉素濃度5mg/mL/1000)，適宜溫度下培養(yǎng)一段時間至菌液較濃。2)菌懸液制備將二活后的供試菌于37°C搖瓶培養(yǎng)12-24 h，血球計數(shù)板 計數(shù)測出菌懸液濃度，并稀釋至105 CFU/mL備用。3)樣品的制備將6種樣品用乙醇配制成約0. 005 mg/mL的溶液溶液，硫 酸鏈霉素用蒸餾水配成5 mg/mL的溶液，DMSO助溶。4)抗菌圈大小的測定菌液制備取實驗菌株接種于LB瓊脂平板培養(yǎng)基 中，35°C培養(yǎng)14h，用LB液體培養(yǎng)基制備菌懸液，菌液濃度1. 5X108CFU. mL—1備用。含藥物 紙片制備將藥物溶解后，滅菌備用。每張紙片(直徑6 mm)加藥物樣品10μ 1，稀釋兩個 濃度梯度，即一個稀釋十倍，一個稀釋一百倍。陰性對照是助溶劑，空白對照生理鹽水；陽 性對照是慶大霉素溶液。一個板上放六個紙片。5)K-B法取菌液濃度為1. 5 X IO8CFU. mL—1的菌株0. 2 mL,均勻涂布整塊 LB培養(yǎng)基表面，室溫2-5 min后，貼加含藥紙片，置入35°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16 18h，游 標(biāo)卡尺精確測定，其紙片周圍抗菌環(huán)直徑的大小，結(jié)果以mm表示，
權(quán)利要求
1.一種從波棱瓜中提取具有抗菌活性組分的方法，其特征在于利用溶劑從干燥粉 碎的波棱瓜子中通過固液提取法提取出粗提物，濃縮得到浸膏，然后通過脫脂、濃縮、萃取 得到具有顯著抗菌效果的萃取物，對萃取物進(jìn)行進(jìn)一步硅膠柱層析分離，得到有效提取組 分；所述固液提取法使用的溶劑為5-10倍量75%-95%乙醇或甲醇溶液；所述脫脂溶劑采用石油醚或乙醚/去離子水，ν/ν=ι/Γι/4,脫脂至石油醚或乙醚呈淺 黃色、淺綠色或無色；所述萃取是將脫脂后的水層，加入乙酸乙酯或氯仿等與水不相混溶的有機(jī)溶劑，有機(jī) 溶劑/去離子水，V/V=l/廣1/4，萃取3-6次，合并萃取液；所述硅膠柱層析為正相硅膠柱層析，所用流動相正相為石油醚_乙酸乙酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于進(jìn)行固液提取法利用浸提的方法，次數(shù) 3-6次，每次浸泡時間12-24小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述濃縮是通過減壓濃縮、低溫冷凍干燥 和噴霧干燥。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法進(jìn)行操作的溫度在-20-40°C范 圍內(nèi)。
5.權(quán)利要求1所述的方法獲得的提取物活性組分在制備對金色葡萄球菌、白色念球 菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌4種菌具有抑制作用的藥品方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明所屬醫(yī)藥產(chǎn)品研究開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明請求保護(hù)從藏藥材波棱瓜子中提取具有抗菌活性組分的方法，該方法是利用溶劑從干燥粉碎的波棱瓜子中通過固液提取法提取出粗提物，濃縮得到浸膏，然后通過脫脂、濃縮、萃取得到具有顯著抗菌效果的萃取物，對萃取物進(jìn)行進(jìn)一步硅膠柱層析分離，得到有效提取組分。本發(fā)明產(chǎn)品對金色葡萄球菌、白色念球菌、枯草芽孢桿菌、沙門氏菌等4種菌具有不同程度的抑制作用，可開發(fā)為天然抗菌劑應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)，制備出具有抗菌作用的片劑、顆粒劑、膠囊、注射劑、皮膚外用制劑等產(chǎn)品形式，為藏藥波棱瓜的開發(fā)開拓新領(lǐng)域。
文檔編號A61K131/00GK102000136SQ20101055908
公開日2011年4月6日 申請日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月25日
發(fā)明者蘭小中, 廖志華, 徐冰, 陳敏 申請人:西南大學(xué)