專利名稱：一種測定中藥抗氧化活性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種以伏安法測定中藥抗氧化活性的方法。
背景技術：
(1)常用的抗氧化模型根據(jù)作用機理，天然抗氧化劑一般可分為四類1)氧自由基清除劑直接清除氧自由基；2)酶抑制劑抑制參與氧自由基產(chǎn)生的酶的活性；3)金屬離子螯合劑絡合在氧自由基產(chǎn)生過程中起重要作用的過渡金屬；4)其他。目前，評價中藥抗氧化活性的方法有很多，主要有自由基清除法，如l，l-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)法、Oxygen radical absorbance capacity (ORAC)法、超氧陰離子清除法、羥基自由基清除法和脂質自由基清除法等。由于誘導劑的不同，自由基的產(chǎn)生機理不同，抗氧化試驗結果極易受實驗條件的影響，尤其是那些以生物實驗為基礎的方法，由于操作煩瑣，加上生物實驗不確定因素相對增加，使得實驗結果往往對實驗條件有很強的依賴性。中藥中不乏優(yōu)良的抗氧化劑，但其化學成分的復雜性使得很難用現(xiàn)有方法對其抗氧化活性進行評價。(2)伏安法評價中藥抗氧化活性的理論基礎及實驗數(shù)據(jù)氧自由基清除劑的抗氧化作用多是通過電子轉移清除氧自由基，給電子的能力越強，其抗氧化活性應越強，氧化電位是物質給電子能力的指標，也應是其清除氧自由基能力的指標。已有文獻報道，黃酮類化合物及酚酸類化合物的電位與其抗氧化活性密切相關。 如van Acker等以循環(huán)伏安法測定了黃酮化合物在2. 5%二甲基亞砜緩沖溶液中的氧化電位，同時以鼠肝及腦微粒體脂質過氧化體系為模型，以dOXOrUbiCin&i^27aSCOrtate為誘發(fā)劑，評估了這些黃酮類化合物對脂質過氧化的抑制率，結果表明黃酮類化合物脂質過氧化抑制率與氧化電位之間有較好的定性關系，即氧化電位較低的物質其脂質過氧化抑制率較高(van Acker S. Α. B. Ε. , van den Berg D. -J. , Tromp Μ. N. J. L. , et al. , Free Radic. Biol. Med.，1996，20，331)。其后，他們以 azobisamidinopropane (ABAP)為誘發(fā)劑誘發(fā)脂質過氧化，結果在黃酮類化合物脂質過氧化抑制率與氧化電位之間也得到了良好的線性關系 (van Acker S. Α. B. Ε.，van Balen G. P.，van den Berg D. -J.，et al. Biochem. Pharmacol.， 1998,56,935).楊濱等采用流動柱電極電解體系對四個常見于中藥中的黃酮化合物進行了研究，考察了它們在生理PH值范圍內的電極反應類型，測定了氧化電位及電子轉移數(shù)(Bin Yang，Kensuke Arai, and Fumiyo Kusu. Electrochem.，2001，69，519)，同時建立了以Fe3+/ADP-NADra為誘導劑的鼠肝微粒體脂質過氧化模型，評價了這些黃酮化合物在此模型中的抗氧化活性(Bin Yang，Akira Kotani，Kensuke Arai，and Fumiyo Kusu Chem. Pharm. Bull. ,2001,49, 747, Bin Yang，Kensuke Arai, and Fumiyo Kusu. Anal. Sci. , 2001, 17，599)，結果表明，黃酮類化合物脂質過氧化抑制率與氧化電位之間有良好的線性關系。 Peyrat-Maillard等采用HPLC-庫侖陣列檢測技術，對酚酸類化合物的電位值進行了測定， 同時考察了它們抑制甲基亞油酸酯在無水十二烷中的加速自氧化能力及消除DPPH自由基的能力，結果表明電位與清除自由基之間有良好的線性關系(M. N. Peyrat-Maillard, etal.，Talanta，2000，51，709)。

發(fā)明內容
不同于單體化合物，中藥是由無數(shù)個單體化合物組成的，正是由于中藥成分復雜， 目前未見將伏安法直接用于中藥抗氧化活性的研究。本發(fā)明經(jīng)過大量研究表明，氧化電位值反映了所測中藥中化合物給電子的能力，氧化電流值則代表能給出電子的化合物的量， 因此，采用伏安法測定中藥的氧化電位和電流值，將兩者結合起來測定中藥的抗氧化活性。 下面進一步詳述本發(fā)明。(1)以伏安法對十種中藥的抗氧化活性進行預測，并與它們清除DPPH自由基的活性進行對比。十種實驗中藥為槐米、貫葉金絲桃、金蕎麥、山楂、山楂葉、黃芩、木蝴蝶、金銀花、 紅花和茶葉，分別以4-16倍量70%乙醇回流提取^1X 2，濾液減壓回收，殘渣蒸干，得提取物。其中，槐米和紅花分別由兩種和三種不同的提取方法提取。具體步驟為槐米加入5倍量的70%乙醇回流提取lhX4，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，殘渣蒸干，得槐米乙醇回流提取物；槐米加入4倍量70%乙醇冷浸24hX5，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，殘渣蒸干， 得槐米乙醇冷浸提取物。紅花加入15倍量蒸餾水，超聲提取lh，濾過，濾液濃縮，加入AB-8 大孔樹脂柱中，用10%乙醇洗脫后，收集50 %乙醇洗脫液，蒸至盡可能干，再冷凍干燥證， 得紅花大孔樹脂純化物；紅花加入8倍量的乙醇，加熱回流lh，濾過，減壓回收乙醇，殘渣蒸干，得紅花乙醇提物；紅花加入12倍量的蒸餾水，加熱回流lh，濾過，濾液蒸干，得紅花水提物。采用伏安法對上述十種中藥在生理pH值范圍內的氧化電位和氧化電流值進行測定，同時參考文獻方法(Brand Williams W, Cuvelier M Ε, Berset C. Lebensm Wiss U Technol, 1995，28，25)，對上述中藥的DPPH自由基清除率進行了評估(每個樣品配制7_10 個濃度)，結果見表1，以matlab數(shù)據(jù)處理軟件處理上述數(shù)據(jù)，結果表明，氧化電位、氧化電流與DPPH清除率之間有良好的相關性，見附

圖1，Z = 0. 349/X+O. 579Y-0. 106，r2 = 0. 9243， 其中Z為十種中藥清除DPPH自由基的IC5tl值，X為氧化電流值，Y為氧化電位值，氧化電流值越高，電位值越低，IC50值越小，清除DPPH自由基能力越強。以Trolox為陽性對照，同時參照文獻數(shù)據(jù)，抗壞血酸清除DPPH自由基的IC5tl 值為 0.132mg · mL_1(Avijeet Jain, Manish Soni, Lokesh Deb, et al. Journal of Ethnopharmacology，2008，115，61)，本實驗樣品均有較好的抗氧化活性，由此推知當樣品的氧化電位值低于0. 232V，氧化電流值大于0. ZSZyAAigmL-1時，它們的抗氧化活性較強。(2)以伏安法對九種中藥的抗氧化活性進行預測，并與它們在Oxygen radical absorbance capacity(ORAC)模型中的抗氧化活性進行對比。九種實驗中藥為除山楂外的上述十種中藥，采用伏安法對這九種中藥在生理pH 值范圍內的氧化電位和氧化電流值進行測定，同時測定它們在ORAC模型中的抗氧化活性， 方法同文獻(續(xù)潔琨，姚新生，栗原博.中國藥理學通報，2006，22 (8) 1015 ；H. Kurihara, H. Fukami, S. Asami, et al. Biol. Pharm. Bull. 2004，27 (7)，1093-1098)，以 ORAC值(樣品相當于Trolox的量)為指標，結果見表2。以matlab數(shù)據(jù)處理軟件處理數(shù)據(jù)，結果表明，氧化電位、氧化電流與AAPH自由基清除率之間有良好的相關性，見附圖2，Z = 0. 299X+0. 195/
6γ-ο. 002/Y2-0. 08，r2 = 0. 830，其中Z為9種中藥提取物的ORAC值，X為氧化電流值I，Y為氧化電位值仏/2 ；氧化電流值越高，電位值越低，ORAC值越大，清除AAPH自由基能力越強。以Trolox為陽性對照，可以看出，本實驗樣品均有較好的抗氧化活性，由此推知當樣品的氧化電位值低于0. 232V，氧化電流值大于0. 282 μ A/mg · mL—1時，它們的抗氧化活性較強。表1 10種中藥提取物氧化電流值、氧化電位值及DPPH清除率(n = 7-10)
_樣品的名稱 E1/2/VIC^
/μΑ/mg-mL"1/mg-mL"1
....................Trolox66^98 …— 0.120 ....................θ7θΓ ———
茶葉 7.80.0690.012
貫葉金絲桃6.3580.0820.028
黃芩2.3440.0190.049
木蝴蝶6.2980.0120.052
槐米(回流)2.2080.0820.079槐米(冷浸)2.1900.0820.051
金蕎麥2.9340.1330.054
金銀花4.5980.2100.066
山楂葉1.4080.1890.11
山楂1.7540.1330.33
紅花(過樹脂)0.5140.1280.45
紅花(水提物)1.4180.2320.46
紅花(醇提物)0.2820.1511.30
I表2 9種中藥提取物氧化電流值、氧化電位值及AAPH清除率(n = 7)
權利要求
1.一種測定中藥抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為以適宜溶劑對中藥進行提取，收集濾液，濃縮，干燥，得到提取物，以伏安法測定中藥提取物的氧化電位和氧化電流值，其中提取物不是單體化合物。
2.如權利要求1所述的測定中藥抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為取 2-25kg中藥，粉碎，加入4-6倍量的有機溶劑提取2-10次，每次提取2_10小時，收集濾液， 濾液減壓濃縮，干燥，即得中藥提取物，然后，取中藥提取物20-50mg，以有機溶劑溶解，置 10-25ml容量瓶中定容，采用伏安法測定中藥提取物的氧化電位和氧化電流值。
3.如權利要求2所述的測定中藥抗氧化活性的方法，其特征在于有機溶劑為乙醇或甲醇。
4.如權利要求2所述的測定中藥抗氧化活性的方法，其特征在于提取中藥的方法選自冷浸，滲漉，加熱回流中的任意一種。
5.如權利要求2所述的測定中藥抗氧化活性的方法，其特征在于中藥選自槐米、貫葉金絲桃、黃芩、木蝴蝶、金蕎麥、山楂葉、山楂、金銀花、紅花、茶葉中的任意一種。
6.一種測定槐米抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟如下(1)槐米提取物的制備，取2. Okg槐米加入4倍量70 %乙醇冷浸Mh，重復冷浸5次，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，殘渣蒸干，得提取物0. 85kg，得率為42%。(2)配制pH為7. 0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取槐米提取物2%ig，精密稱定，以70%乙醇溶解，定容置IOmL量瓶中，制備成樣品溶液，測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空自樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1.0V，終止電位1.0V，掃描速率0.05V/S，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 082V，單位濃度的電流值為2. 190 μ A/mg · mL—1。
7.一種測定貫葉金絲桃抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟如下(1)貫葉金絲桃提取物的制備，5. Okg貫葉金絲桃加入15倍量的70%乙醇冷浸池，加熱回流提取2h，濾過，殘渣加原藥材15倍量的70%乙醇回流提取2次，每次1小時，濾過，合并濾液，減壓回收濃縮，殘渣蒸干，得提取物。(2)配制pH為7. 0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取貫葉金絲桃提取物7mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用 Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1. 0V，終止電位1. 0V，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 082V,單位濃度的電流值為6. 358 μ A/mg · mL—1。
8.一種測定黃芩抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)黃芩樣品的制備，取 20kg黃芩，以6倍量70%乙醇回流提取2次，每次池，濾過，合并濾液，減壓回收，真空干燥， 得提取物。(2)配制pH為7. 0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取黃芩提取物10mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比1 1混合，進行線性掃描，起始電位-ι.ον，終止電位1. 0V，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 019V, 單位濃度的電流值為2. 344 μ A/mg · mL—1。
9.一種測定木蝴蝶抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)木蝴蝶樣品的制備，25kg木蝴蝶加入16倍量70%乙醇冷浸12h，再回流提取2h，濾過，殘渣加入10倍量70% 乙醇回流提取池，合并濾液，減壓回收乙醇，真空干燥，得提取物。(2)配制pH為7.0的0. IM 的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取木蝴蝶提取物10mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中， 制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時， 先將底液與空白樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1.0V，終止電位1.0V，掃描速率0.05V/S， 記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0.012V，單位濃度的電流值為6. 298 μ A/ mg · mL 1 ο
10.一種測定金蕎麥抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)金蕎麥樣品的制備，取5. Okg金蕎麥加入4倍量的70%乙醇冷浸1. 5h，回流提取池，濾過，濾渣加入原藥材的2倍量的70%乙醇回流提取6次，每次1小時，合并濾液，減壓回收乙醇，濾液蒸干，得提取物。(2)配制pH為7.0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取金蕎麥提取物15mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-ι.ον，終止電位1.(^，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 133V, 單位濃度的電流值為2. 934 μ A/mg · mL—1。
11.一種測定金銀花抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)金銀花樣品的制備，取2. Okg金銀花，以4倍量70%乙醇回流，提取兩次，每次提取池，濾液減壓回收，殘渣蒸干，得提取物。(2)配制pH為7.0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取金銀花提取物 15mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液以體積比為1 1 混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1. 0V，終止電位1. 0V，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 210V,單位濃度的電流值為4. 598 μ A/mg · mL—1。
12.一種測定山楂葉抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)山楂葉樣品的制備，2. Okg山楂葉，以4倍量70%乙醇回流，提取兩次，每次提取2h，濾液減壓回收，殘渣蒸干，得提取物。(2)配制pH為7. 0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取山楂葉提取物 37mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1. 0V，終止電位1. 0V，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 189V，單位濃度的電流值為1. 408 μ A/mg · mL—1。
13.一種測定山楂抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)山楂樣品的制備， 5. Okg山楂去核后，置于滲漉桶中，加入2倍量的70 %乙醇冷浸Mh，濾過，殘渣再加原藥材1.6倍量的70%乙醇冷浸24hX2，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇，殘渣蒸干，得提取物 0. Ag，得率為14%。(2)配制pH為7.0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取山楂提取物35. 6mg，精密稱定，以70% KOH定容于IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3 打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液體積比為·1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描， 起始電位-1. 0V，終止電位1. 0V，掃描速率0. 05V/S，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 133V，單位濃度的電流值為1. 754 μ A/mg · mL—1。
14.一種測定紅花抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟為(1)紅花樣品的制備 2. Okg紅花，以4倍量70%乙醇回流，提取兩次，每次提取池，濾液減壓回收，殘渣蒸干，得提取物。(2)配制pH為7. 0的0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液。取紅花提取物81mg，精密稱定，以70%乙醇定容IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時，先將底液與空白樣品液以體積比為1 1混合，進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-ι.ον，終止電位1.(^，掃描速率0. 05V/s，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 151V, 單位濃度的電流值為0. 282 μ A/mg · mL—1。
15.一種測定茶葉抗氧化活性的方法，其特征在于測定步驟如下(1)稱取茶葉2. Ag 于滲漉桶中，加入4倍量的70%乙醇冷浸Mh，濾過，殘渣再加茶葉3. 5倍量的70%乙醇冷浸Mh，濾過，殘渣再加茶葉3. 5倍量的乙醇冷浸Mh，濾過，共冷浸3天，合并濾液減壓回收乙醇，殘渣蒸干，得提取物1.26kg，得率為46.7%。( 配制0. IM的磷酸鹽緩沖溶液為底液，其pH為7. 0。取茶葉提取物10mg，精密稱定，以70%乙醇溶解，定容置IOmL量瓶中，制備成樣品溶液。測定前，用Al2O3打磨工作電極，高純水超聲清洗3次，每次lmin，測定時， 先將底液與空白樣品液以體積比為1 1進行空白測定，隨后，將樣品溶液與底液以體積比為1 1混合，進行線性掃描，起始電位-1.0V，終止電位1.0V，掃描速率0.05V/S，記錄伏安圖，測得第一氧化電位的半峰電位值為0. 069V，單位濃度的電流值為7. 8 μ A/mg · mL—1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用電化學中的伏安技術，以氧化電位和電流值為指標，對中藥抗氧化活性進行評價的方法。目前，有許多評價中藥抗氧化活性的方法，但中藥化學成分的復雜性使得實驗結果往往對實驗條件有很強的依賴性，阻礙了人們對其抗氧化活性的正確評價。本發(fā)明是將電化學中的伏安技術應用于中藥的抗氧化活性評價，其理論基礎是氧自由基清除劑的抗氧化作用多是通過電子轉移清除氧自由基，其給電子的能力應與抗氧化活性密切相關，即氧化電位和電流值是其最基本的抗氧化活性指標，氧化電位代表物質給電子的難易程度，氧化電流值則代表物質反應的量。本發(fā)明以伏安法測定中藥的氧化電位和電流值，以此來對中藥的抗氧化活性進行評價。
文檔編號A61K36/539GK102455316SQ201010522810
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權日2010年10月28日
發(fā)明者戴卉卿, 晏仁義, 李洪梅, 楊濱, 袁亞男, 陳承瑜 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所