專利名稱：一種人工椎間盤復合體組織及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及組織工程領域，具體涉及一種人工椎間盤復合體組織及其制備方法。
背景技術：
組織工程(Tissue Engineering)是應用生命科學與工程學的原理與技術，在正確 認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態(tài)下的組織結構與功能關系的基礎上，研究、開發(fā)用于 修復、維護、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物的一門新興學科。 組織工程研究主要包括四個方面種子細胞、生物材料、構建組織和器官的方法和技術以及 組織工程的臨床應用。組織工程的基本原理和方法是將體外培養(yǎng)擴增的正常組織細胞作為種子細胞， 吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物支架材料上形成復合物，將細胞_支架 材料復合物植入機體組織、器官的病損部位，種子細胞在生物材料逐漸被機體降解吸收的 過程中形成新的在形態(tài)和功能方面與、組織相一致的組織，而達到修復創(chuàng)傷和重建功能的 目的。采用組織工程學技術修復缺損的組織器官，具有移植材料來源廣泛、移植物可以在體 外成行、避免或降低了免疫排斥反應和感染性疾病的播散等優(yōu)點。目前采用組織工程技術 已成功構建皮膚、膀胱、肌腱、骨、軟骨等組織。椎間盤退變性疾病是現(xiàn)代社會中一種常見病和多發(fā)病，其中以椎間盤突出癥最為 常見，是引起腰腿痛的常見病因，嚴重影響患者生活質(zhì)量。組織工程修復椎間盤退行性變是 近年來脊柱外科領域基礎研究的熱點，研究開發(fā)符合椎間盤結構與功能的移植物，對退變 椎間盤進行功能重建，已成為治療椎間盤退變性疾病比較理想的解決方案。椎間盤包括軟骨板以及位于軟骨板之間的髓核和纖維環(huán)，髓核與纖維環(huán)是兩個發(fā) 育上和形態(tài)上分離的區(qū)域，在細胞和基質(zhì)構成和作用方面各不相同。而目前組織工程椎間 盤的研究主要采用單一成分的組織工程髓核或組織工程纖維環(huán)移植物，將兩者復合構建組 織工程椎間盤復合物是一個難點和關鍵點，主要體現(xiàn)在以下幾個方面1、如何選擇符合髓 核和纖維環(huán)生物學特性的生物材料，目前用于組織工程椎間盤研究的支架材料種類很多， 但迄今仍沒有具有優(yōu)異生物學的類人體組織理想的替代和修復材料；2、如何在體外構建組 織工程椎間盤復合組織，其中如何將組織工程髓核支架材料和纖維環(huán)支架材料復合并使復 合組織具有更好的生物性能；3、種子細胞能否粘附纖維環(huán)支架內(nèi)部并增殖和行使功能。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術中僅有單一成分的組織工程髓核或組織工程纖維環(huán)移 植物的缺陷，提供一種人工椎間盤復合體組織，其將髓核支架材料和纖維環(huán)支架材料復合 在一起，且具有更好的生物學性能。本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織，包括髓核和纖維環(huán)，其外層為纖維環(huán)細胞在 脫礦脫細胞骨基質(zhì)環(huán)生長構成的纖維環(huán)，內(nèi)層為髓核細胞以及II型膠原、透明質(zhì)、硫酸軟 骨素構成的髓核，是由髓核細胞及纖維環(huán)細胞在II型膠原、透明質(zhì)、硫酸軟骨素以及由脫鈣脫細胞的骨基質(zhì)環(huán)構成的纖維環(huán)復合體支架上生長形成。作為優(yōu)選，所述骨基質(zhì)環(huán)為兔股骨髁部制備的骨基質(zhì)環(huán)。更優(yōu)選地，所述髓核細胞及纖維環(huán)細胞來源于3周齡新西蘭大白兔。本發(fā)明還提供一種人工椎間盤復合體組織的構建方法，包含以下步驟步驟1 將除骨膜、除骨髓的兔股骨髁部，進行脫細胞脫鈣處理后修整成形制備纖 維環(huán)支架；步驟2:將II型膠原和透明質(zhì)酸按體積比9 1混合注入步驟1制備的纖維環(huán)支 架內(nèi)，冷凍干燥后浸泡于pH為5. 5含50-55mmol/l MES的40-45%乙醇溶液中30分鐘后， 浸泡于含 50-55mmol/l MES、24-27mmol/l EDC、3-5mmol/l 琥珀酰胺和 2-3wt%硫酸軟骨素 的40-45%乙醇溶液中交聯(lián)形成髓核纖維環(huán)復合體支架；步驟3 使髓核細胞及纖維環(huán)細胞于所述髓核纖維環(huán)復合體支架內(nèi)，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。作為優(yōu)選，步驟1所述脫細胞采用Courtman的中性去污劑-酶四步脫細胞方法進 行。作為優(yōu)選，步驟1所述脫鈣為將兔股骨髁部在4°C 0. 6-0. 8mol/LHCl中處理48_72 小時。作為優(yōu)選，，步驟2所述交聯(lián)為20_25°C下交聯(lián)24_36h。作為優(yōu)選，步驟3所述培養(yǎng)液為pH7. 4-7. 6含10-15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。作為優(yōu)選，步驟3所述髓核細胞及所述纖維環(huán)細胞來源于3周齡新西蘭大白兔，其 濃度為 1 X 105-2X 105 個/ml。更優(yōu)選地，步驟3所述髓核細胞及纖維環(huán)細胞制備成混懸液，髓核細胞及纖維 環(huán)細胞計數(shù)為1 X 105-2X 105個/ml，與50-55mmol/L CaCl2,20-22U/ml凝血酶按體積比 1:2:7比例混合制備的細胞懸液于所述髓核纖維環(huán)復合體支架內(nèi)加培養(yǎng)液培養(yǎng)。本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織外形及大小均與天然椎間盤類似，外層由纖維 環(huán)細胞在脫礦脫細胞骨基質(zhì)環(huán)生長構成的組織工程纖維環(huán)區(qū)域組織致密，內(nèi)層由髓核細 胞以及CII/HyA-CS構成的組織工程髓核區(qū)域呈半透明凝膠狀。裸鼠皮下植入4周后，細 胞_支架復合體仍保持原有外形和大小，并有大量細胞外基質(zhì)形成，但纖維環(huán)和髓核交界 區(qū)仍較清晰。到12周，隨著組織工程椎間盤復合體有豐富的細胞外基質(zhì)形成，纖維環(huán)和髓 核的交界區(qū)已難以辨認。本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織學觀察結果顯示，與天然椎間盤相比，HE及番 紅0染色結果提示進展性的組織形成。復合體支架的纖維環(huán)區(qū)域為不均一的孔隙結構，而 髓核區(qū)域為相對較小、更均一的孔隙結構。裸鼠皮下植入4周后，組織工程椎間盤復合體的 孔隙逐漸被新產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)填充；到12周，更多的細胞外基質(zhì)形成使得復合體組織更 加致密，組織工程椎間盤的纖維環(huán)和髓核區(qū)域更加地整合在一起，參見圖3。組織工程椎間盤復合體的細胞外基質(zhì)形成情況通過檢測羥脯氨酸和GAG含量來 反映。隨著植入時間的增加，復合椎間盤的細胞外基質(zhì)分泌量也顯著增加，在12周時，與天 然椎間盤的含量相似。DNA含量檢測可以反映椎間盤的細胞量，結果表明，隨植入時間的增 加，本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織的DNA含量也顯著增加，到12周時接近正常椎間盤 組織水平。
本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織的大體形態(tài)和組織學觀察結果與天然椎間盤 組織相似，形態(tài)學觀察結果纖維環(huán)和髓核區(qū)域得到良好的整合，外層纖維環(huán)組織致密，內(nèi)層 髓核呈半透明凝膠狀。。生化成分的檢測結果表明，DNA、蛋白多糖和羥脯氨酸的含量隨時間 顯著增加，在12周時與天然椎間盤的含量相似。膠原的基因表達分析結果也表明組織工程 復合椎間盤與天然椎間盤相似，可開發(fā)為符合椎間盤結構與功能的移植物，對退變椎間盤 進行功能重建以及治療椎間盤退行性變具有重要的意義。
圖1示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織構建流程圖；圖2示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織大體形態(tài)學觀察結果；NP 髓核，AF 纖 維環(huán)；圖3示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織組織學觀察結果；NP 髓核，AF 纖維 環(huán)；圖4示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織羥脯氨酸含量檢測結果；NP 髓核，AF 纖維環(huán)；圖5示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織GAG含量檢測結果；NP 髓核，AF 纖維 環(huán)；圖6示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織DNA含量檢測結果，NP 髓核，AF 纖維 環(huán)。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種人工椎間盤復合體組織及其制備方法，本領域技術人員可以借 鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域 技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過 較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述 的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術。實施例1 纖維環(huán)脫鈣脫細胞骨基質(zhì)環(huán)的制備取材取新西蘭大耳白兔雙側股骨髁部，剔除骨膜，并用PBS清洗除去骨髓，將骨 修整成橢圓形的骨塊。脫細胞方法根據(jù)Courtman的中性去污劑_酶四步脫細胞方法進行制備(參見 Courtman Dff, Pereira C, Kashef V, et al. Development of apericardial acellular matrix biomaterial :Biochemical and mechanical effectsof cell extraction. J Biomed Materials Res, 1994,28 :655_666)。將骨塊置入酶抑制劑工作液(購自美國sigma 公司)，4°C恒溫震蕩3d;骨塊置入去污劑酶抑制劑工作液(購自美國sigma公司)中，4°C 恒溫震蕩3d ；去離子水連續(xù)沖洗12h后，加入DNAse、RNAse消化液37°C恒溫下消化12h ；重 復將骨塊置入去污劑酶抑制劑工作液(購自美國sigma公司)中，4°C恒溫震蕩3d。骨塊脫鈣方法取出材料骨，用去離子水沖洗，然后在4°C 0. 6mol/LHCl中處理48 小時；產(chǎn)物比照纖維環(huán)形狀塑形，然后經(jīng)去離子水充分沖洗后。實施例2 髓核細胞支架的構建
將豬II型膠原蛋白CII溶于O.Olmol/1 HCl (pH 2. 3)，4°C下攪拌，制成1. 25% (w/v)的CII溶液，調(diào)整CII溶液的pH值至1-2。繼續(xù)4°C攪拌的條件下，按9 1 (ν/ν)比 例逐滴加入以超純水溶解的4°C、1. 25% HyA(透明質(zhì)酸)溶液，速度控制在0. 5ml/min?；?合后，4°C下300r/min攪拌4h，3000r/min、4°C離心15min去除氣泡，將混合溶液傾入一次性 培養(yǎng)皿中，輕輕震搖，使液面平整，立即置于-70°C冰箱冷凍。實施例3 髓核纖維環(huán)復合體支架的構建將CII/HyA混合溶液注入實施例1制備的中空的纖維環(huán)支架內(nèi)，冷凍干燥。干燥 后的復合體按每50mg干重浸泡于20ml含50mmol/l 2-嗎啉乙烷磺酸(MES pH = 5. 5)的 40%乙醇溶液中30分鐘(室溫)，然后浸泡在20ml含50mmol/l MES、24mmol/l EDC、5mmol/ 1琥珀酰胺(NHS)和2wt% 6-CS硫酸軟骨素的40%乙醇溶液中，室溫(20_25°C )下交聯(lián) 24h。將此復合體支架在0. lmol/1 Na2HPO4中清洗2次，共Ih ；lmol/1 NaCl中清洗2次，共 2h ；2mol/l NaCl中清洗24h (期間更換6次)，用超純水清洗十次，冷凍干燥機中兩次凍干 得到復合體支架。經(jīng)鈷60照射消毒滅菌后-20°C保存?zhèn)溆?。實施? 本發(fā)明椎間盤復合組織的構建髓核纖維環(huán)復合體支架用細胞培養(yǎng)基DMEM(含10%胎牛血清、青霉素10萬U/L、 鏈霉素10萬U/L，20mmol/L HEPES，pH7. 2)在培養(yǎng)箱內(nèi)浸泡1周，換液2次。接種時取出支 架PBS液體洗滌后盡量吸出水分，浸入人纖維蛋白原溶液(2mg/ml)中30min，無菌紗布吸去 多余液體，靜置4h。分別將來源于3周齡新西蘭大白兔的原代培養(yǎng)髓核細胞及纖維環(huán)細胞， 以0.25%胰蛋白酶消化、離心，用DMEM/F12(pH 7.0)混懸細胞，計數(shù)制成含細胞1 X IO5個 /ml，按9 1體積加入PBS液體配置的凝血酶(20U/ml)；按1 2 7比例混合50mmol/ L CaCl2、凝血酶20U/ml細胞懸液。將混合物滴加至支架材料內(nèi)，靜置30min。然后加培養(yǎng) 液(含 15%FBS&DMEM/F12，pH 7.4)至 2ml，置于 37°C、5% CO2 溫箱中培養(yǎng)。實施例5 組織工程椎間盤復合體裸鼠皮下移植取裸鼠30只，隨機分為4、8、12周組，皮下注射戊巴比妥鈉麻醉，于背部切開皮膚 并皮下植入復合體，縫合皮膚。術后常規(guī)清潔級飼養(yǎng)。實施例6 大體形態(tài)學觀察取實施例1-4制備的人工椎間盤復合體組織觀察，結果見圖組織工程椎間盤復 合體(圖2A)外形及大小均與天然椎間盤類似(圖2B)，外層由脫礦脫細胞骨基質(zhì)環(huán)構成的 組織工程纖維環(huán)區(qū)域組織致密，內(nèi)層由CII/HyA-CS構成的組織工程髓核區(qū)域呈半透明凝 膠狀。裸鼠皮下植入4周后，細胞-支架復合體仍能保持原有外形和大小，并有大量細胞外 基質(zhì)形成，但纖維環(huán)和髓核交界區(qū)仍較清晰(圖2C)。到12周，隨著組織工程椎間盤復合體 有豐富的細胞外基質(zhì)形成，纖維環(huán)和髓核的交界區(qū)已難以辨認(圖2D)。實施例7 組織學觀察4%多聚甲醛固定液固定24小時，常規(guī)石蠟包埋切片，行HE及番紅0染色。光鏡 觀察。實施例1-4制備的人工椎間盤復合體組織組織學觀察結果顯示與天然椎間盤相比 (圖3G，H)，HE及番紅0染色結果提示進展性的組織形成。復合體支架的纖維環(huán)區(qū)域為不 均一的孔隙結構，而髓核區(qū)域為相對較小、更均一的孔隙結構(圖3A，B)。裸鼠皮下植入4 周后，組織工程椎間盤復合體的孔隙逐漸被新產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)填充(圖3C，D)。到12周， 更多的細胞外基質(zhì)形成使得復合體組織更加致密，組織工程椎間盤的纖維環(huán)和髓核區(qū)域更加地整合在一起，這與大體觀察結果相一致(圖3E，F(xiàn))。實施例8 生化指標檢測本發(fā)明所述椎間盤復合體的細胞外基質(zhì)形成情況，通過檢測羥脯氨酸和GAG含量 來反映。羥脯氨酸含量、氨基葡聚糖(GAG)含量、DNA含量依相應參考文獻方法進行檢測。取實施例1-4制備的人工椎間盤復合體組織進行生化成分檢測，結果顯示隨著 植入時間的增加，復合椎間盤的細胞外基質(zhì)分泌量也顯著增加，在12周時，與天然椎間盤 的含量相似，見圖4和圖5。DNA含量檢測可以反映組織工程椎間盤的細胞量。結果表明，隨植入時間的增加， 組織工程椎間盤復合體的DNA含量也顯著增加，到12周時接近正常水平，見圖6。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發(fā)明的保護范圍。
權利要求
一種人工椎間盤復合體組織，其外層為纖維環(huán)細胞在脫礦脫細胞骨基質(zhì)環(huán)生長構成的纖維環(huán)，內(nèi)層為髓核細胞以及II型膠原、透明質(zhì)、硫酸軟骨素構成的髓核，是由髓核細胞及纖維環(huán)細胞在II型膠原、透明質(zhì)、硫酸軟骨素以及由脫鈣脫細胞的骨基質(zhì)環(huán)構成的纖維環(huán)復合體支架上生長形成。
2.根據(jù)權利要求1所述的人工椎間盤復合體組織，其特征在于，所述骨基質(zhì)環(huán)為兔股 骨髁部制備的骨基質(zhì)環(huán)。
3.根據(jù)權利要求1所述的人工椎間盤復合體組織，其特征在于，所述髓核細胞及纖維 環(huán)細胞來源于3周齡新西蘭大白兔。
4.一種人工椎間盤復合體組織的構建方法，包含以下步驟步驟1 將除骨膜、除骨髓的兔股骨髁部，進行脫細胞脫鈣處理后修整成形制備纖維環(huán) 支架；步驟2:將II型膠原和透明質(zhì)酸按體積比9 1混合注入步驟1制備的纖維環(huán)支架 內(nèi)，冷凍干燥后浸泡于pH為5. 5含50-55mmol/l MES的40-45%乙醇溶液中30分鐘后，浸 泡于含 50-55mmol/l MES、24-27mmol/l EDC、3-5mmol/l 琥珀酰胺和酸軟骨素的40-45%乙醇溶液中交聯(lián)形成髓核纖維環(huán)復合體支架；步驟3 加培養(yǎng)液使髓核細胞及纖維環(huán)細胞于所述髓核纖維環(huán)復合體支架內(nèi)生長至12周。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟1所述脫細胞采用Courtman的 中性去污劑_酶四步脫細胞方法進行。
6.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟1所述脫鈣為將兔股骨髁部在 40C 0. 6-0. 8mol/L HCl 中處理 48-72 小時。
7.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟2所述交聯(lián)為20-25°C下交聯(lián) 24-36h。
8.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟3所述培養(yǎng)液為pH7.4-7. 6含 10-15% FBS 的 DMEM/F12 培養(yǎng)液。
9.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述髓核細胞及所述纖維環(huán)細胞來 源于3周齡新西蘭大白兔，其濃度為1 X 105-2 X IO5個/ml。
10.根據(jù)權利要求4-9任一項所述制備方法制備的人工椎間盤復合體組織。
全文摘要
本發(fā)明涉及組織工程領域，公開了一種人工椎間盤復合體組織及其制備方法。本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織包括髓核和纖維環(huán)，所述纖維環(huán)由脫鈣脫細胞的骨基質(zhì)環(huán)構成，所述髓核由髓核細胞及纖維環(huán)細胞在II型膠原、透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素構成的髓核纖維環(huán)復合體支架上生長形成。其外形及大小均與天然椎間盤類似，外層纖維環(huán)組織致密，內(nèi)層髓核呈半透明凝膠狀。生化成分的檢測結果表明，本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織DNA、蛋白多糖和羥脯氨酸的含量隨時間顯著增加，在12周時與天然椎間盤的含量相似。膠原的基因表達分析結果也表明組織工程復合椎間盤與天然椎間盤相似，顯示本發(fā)明所述人工椎間盤復合體組織具有良好的生物學功能，具有廣泛的應用前景。
文檔編號A61L27/40GK101954123SQ20101051456
公開日2011年1月26日 申請日期2010年10月21日 優(yōu)先權日2010年10月21日
發(fā)明者周躍, 莊穎, 李長青, 黃博 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院