專利名稱：膠原蛋白海綿的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膠原蛋白海綿的制備方法。
背景技術(shù)：
膠原蛋白是一種細(xì)胞外蛋白質(zhì)，它是曲3條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀蛋白質(zhì)，膠原蛋白是人體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)，占全身總蛋白質(zhì)的30%以上。膠原蛋白富含人體需要的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的組成部分。由于膠原蛋白具有優(yōu)越的生物相容性和安全性，膠原被認(rèn)為是最有用的生物材料之一。膠原作為藥物遞送系統(tǒng)的主要應(yīng)用有眼外科的膠原罩、創(chuàng)傷和灼傷中的膠原海綿、蛋白質(zhì)傳遞的微丸和片劑、控釋凝膠處方、透皮給藥的控釋材料、基因遞送的納米粒及細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)。 另外，還有組織工程學(xué)方面的應(yīng)用包括皮膚代用品、骨代用品、人工血管、瓣膜和人工硬腦脊膜等。膠原蛋白海綿是一種新型的生物醫(yī)學(xué)材料，其不僅有效地促進(jìn)毛細(xì)血管的形成，加速肉芽組織生長，作缺損部位組織填充物從而引導(dǎo)組織再生，促進(jìn)各種創(chuàng)面的快速愈合，還具有止血消炎、減輕疼痛、減輕疤痕及色素沉著等作用。目前市場(chǎng)上膠原蛋白海綿主要缺點(diǎn)為力學(xué)性能差，降解時(shí)間短。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種既有良好的生物相容性能和組織修復(fù)性能，又有良好的力學(xué)性能和可控降解性能的膠原蛋白海綿的制備方法。本發(fā)明所提供的膠原蛋白海綿的制備方法，包括如下步驟在pH值1. 0 5. 0的條件，將牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；酶解液離心取上清，用飽和鹽溶液鹽析出膠原蛋白；將鹽析出的膠原蛋白進(jìn)行透析；在交聯(lián)劑水溶液中將透析后的膠原蛋白交聯(lián)；將交聯(lián)后的膠原蛋白凝膠凍干，在交聯(lián)劑水溶液中將所述膠原蛋白交聯(lián)，然后冷凍干燥得到膠原蛋白海綿。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述飽和鹽溶液為飽和氯化鈉溶液或飽和氯化鉀溶液。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述交聯(lián)劑選自甲醛、戊二醛、碳化亞胺、雙環(huán)氧化合物、京尼平、原花青素中任一種或幾種。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述交聯(lián)劑水溶液中交聯(lián)劑的體積百分含量為1 0.01%。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的濃度為 0.01 1000mg/L。
本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法，其中所述上清與所述飽和鹽溶液的體積比為 1 (1 100)。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法獲得的膠原蛋白海綿浸水后有一定彈拉韌性、 有良好的生物相容性能和組織修復(fù)性能，可控降解，蛋白質(zhì)含量高。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1利用去離子水清洗購買的合格原材料牛跟腱，利用切片機(jī)切割牛跟腱至合適大小放入酶解罐中待用。IOOOg牛跟腱加入注射用水，加適量的醋酸調(diào)節(jié)PH值至1. 0，加入胃蛋白酶進(jìn)行酶解，胃蛋白酶的濃度為0. 01mg/L，溫度0°C，酶解120h。酶解完成后，將酶解罐內(nèi)溶液加入離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為1000r/min，120min。取上清液。將離心后上清液倒入不銹鋼桶內(nèi)，將氯化鈉飽和溶液加入不銹鋼桶內(nèi)，氯化鈉飽和溶液與上清液的體積比為1 1， 不斷攪拌，直至膠原蛋白全部析出。將鹽析出來的膠原蛋白裝入透析袋內(nèi)，放入透析罐內(nèi)透析5天。將透析完成的膠原蛋白加入交聯(lián)罐中，加適量的注射用水至膠原蛋白膠液固體含量在0.1%，攪拌均勻后加入甲醛交聯(lián)lh，甲醛與膠原蛋白膠液的體積比為1 100，將交聯(lián)好的混合凝膠裝入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°C下冷凍干燥1小時(shí)。在交聯(lián)罐中加入適量注射用水，將凍干的膠原蛋白凝膠放入交聯(lián)罐中，加入甲醛交聯(lián)lh，甲醛與按注射用水體積比 1 100。將交聯(lián)好的膠原蛋白海綿放入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°c下冷凍干燥1小時(shí)，凍干完成后取得到膠原蛋白海綿。膠原蛋白海綿的外觀為白色海綿狀薄片，有晶體光澤，浸水后有一定彈拉韌性。膠原蛋白海綿的長為4. 32 4. 62cm，寬為4. 57 4. 61cm，厚為0. 39 0. 42cm。膠原蛋白海綿的化學(xué)性能吸水力為本身重量的50 56倍。膠原蛋白海綿的熾灼殘?jiān)?.2%，pH值6.2，膠原蛋白海綿的重金屬含量(以鉛計(jì))小于lOug/g。羥脯氨酸含量為12%。蛋白質(zhì)總量為96%。膠原蛋白海綿的生物學(xué)性能無菌檢驗(yàn)(GB/T19973. 2-2005)膠原蛋白海綿符合無菌規(guī)定。細(xì)胞毒性試驗(yàn)(GB/T 16886. 5-2003)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)胞毒性為0 1級(jí)。 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)(EN455-3-2000)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)菌內(nèi)毒素小于0. 5EU/ml。Ames試驗(yàn)(GB/T16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。染色體畸變?cè)囼?yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。 微核試驗(yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。致敏試驗(yàn)(GB/T 16886. 10-2005)檢測(cè)無致敏反應(yīng)。急性供毒試驗(yàn)(ISO 10993-11 2006)檢測(cè)無急性生身毒性反應(yīng)。植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)(IS010993-6 :2007)，膠原蛋白海綿植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞及少量多核巨細(xì)胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。實(shí)施例2利用去離子水清洗購買的合格原材料牛跟腱，利用切片機(jī)切割牛跟腱至合適大小放入酶解罐中待用。IOOOg牛跟腱加入注射用水，加適量的檸檬酸調(diào)節(jié)PH值至5. 0，加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解，胰蛋白酶的濃度為1000mg/L，溫度30°C，酶解12h。酶解完成后，將酶解罐內(nèi)溶液加入離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為10000r/min，iaiiin。取上清液。將離心后上清液倒入不銹鋼桶內(nèi)，將氯化鈉鉀和溶液加入不銹鋼桶內(nèi)，氯化鈉鉀飽和溶液與上清液的體積比為 1 100，不斷攪拌，直至膠原蛋白全部析出。將鹽析出來的膠原蛋白裝入透析袋內(nèi)，放入透析罐內(nèi)透析5天。將透析完成的膠原蛋白加入交聯(lián)罐中，加適量的注射用水至膠原蛋白膠液固體含量在5%，攪拌均勻后加入戊二醛交聯(lián)Mh，戊二醛與膠原蛋白膠液的體積比為 1 10000，將交聯(lián)好的混合凝膠裝入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°C下冷凍干燥1小時(shí)。在交聯(lián)罐中加入適量注射用水，將凍干的膠原蛋白凝膠放入交聯(lián)罐中，加入碳化亞胺交聯(lián)Mh， 碳化亞胺與按注射用水體積比1 10000。將交聯(lián)好的膠原蛋白海綿放入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°C下冷凍干燥1小時(shí)，凍干完成后取得到膠原蛋白海綿。膠原蛋白海綿的外觀為白色海綿狀薄片，有晶體光澤，浸水后有一定彈拉韌性。膠原蛋白海綿的長為4. 32 4. 62cm，寬為4. 57 4. 61cm，厚為0. 39 0. 42cm。膠原蛋白海綿的化學(xué)性能吸水力為本身重量的50 56倍。膠原蛋白海綿的熾灼殘?jiān)?.2%，pH值6. 2，膠原蛋白海綿的重金屬含量(以鉛計(jì))小于lOug/g。羥脯氨酸含量為12%。蛋白質(zhì)總量為96%。膠原蛋白海綿的生物學(xué)性能無菌檢驗(yàn)(GB/T19973. 2-2005)膠原蛋白海綿符合無菌規(guī)定。細(xì)胞毒性試驗(yàn)(GB/T 16886. 5-2003)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)胞毒性為0 1級(jí)。 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)(EN455-3-2000)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)菌內(nèi)毒素小于0. 5EU/ml。Ames試驗(yàn)(GB/T16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。染色體畸變?cè)囼?yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。 微核試驗(yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。致敏試驗(yàn)(GB/T 16886. 10-2005)檢測(cè)無致敏反應(yīng)。急性供毒試驗(yàn)(ISO 10993-11 2006)檢測(cè)無急性生身毒性反應(yīng)。植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)(IS010993-6 :2007)，膠原蛋白海綿植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞及少量多核巨細(xì)胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。實(shí)施例3利用去離子水清洗購買的合格原材料牛跟腱，利用切片機(jī)切割牛跟腱至合適大小放入酶解罐中待用。IOOOg牛跟腱加入注射用水，加適量的鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4. 0，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，木瓜蛋白酶的濃度為100mg/L，溫度30°C，酶解80h。酶解完成后，將酶解罐內(nèi)溶液加入離心機(jī)離心，轉(zhuǎn)速為lOOOOr/min，lOmin。取上清液。將離心后上清液倒入不銹鋼桶內(nèi)，將氯化鈉飽和溶液加入不銹鋼桶內(nèi)，氯化鈉飽和溶液與上清液的體積比為1 50， 不斷攪拌，直至膠原蛋白全部析出。將鹽析出來的膠原蛋白裝入透析袋內(nèi)，放入透析罐內(nèi)透析5天。將透析完成的膠原蛋白加入交聯(lián)罐中，加適量的注射用水至膠原蛋白膠液固體含量在2%，攪拌均勻后加入雙環(huán)氧化物交聯(lián)lh，雙環(huán)氧化物與膠原蛋白膠液的體積比為 1 1000，將交聯(lián)好的混合凝膠裝入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°C下冷凍干燥1小時(shí)。在交聯(lián)罐中加入適量注射用水，將凍干的膠原蛋白凝膠放入交聯(lián)罐中，加入原花青素交聯(lián)lh，原花青素與按注射用水體積比1 1000。將交聯(lián)好的膠原蛋白海綿放入適當(dāng)規(guī)格的凍干盤內(nèi)-80°C下冷凍干燥1小時(shí)，凍干完成后取得到膠原蛋白海綿。膠原蛋白海綿的外觀為白色海綿狀薄片，有晶體光澤，浸水后有一定彈拉韌性。膠原蛋白海綿的長為4. 32 4. 62cm，寬為4. 57 4. 61cm，厚為0. 39 0. 42cm。膠原蛋白海綿的化學(xué)性能吸水力為本身重量的50 56倍。膠原蛋白海綿的熾灼殘?jiān)?.2%，pH值6. 2，膠原蛋白海綿的重金屬含量(以鉛計(jì))小于lOug/g。羥脯氨酸含量為12%。蛋白質(zhì)總量為96%。膠原蛋白海綿的生物學(xué)性能無菌檢驗(yàn)(GB/T19973. 2-2005)膠原蛋白海綿符合無菌規(guī)定。細(xì)胞毒性試驗(yàn)(GB/T 16886. 5-2003)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)胞毒性為O 1級(jí)。 細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)(EN455-3-2000)檢測(cè)膠原蛋白海綿的細(xì)菌內(nèi)毒素小于0. 5EU/ml。Ames試驗(yàn)(GB/T16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。染色體畸變?cè)囼?yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。 微核試驗(yàn)(GB/T 16886. 3-2008)檢測(cè)為陰性。致敏試驗(yàn)(GB/T 16886. 10-2005)檢測(cè)無致敏反應(yīng)。急性供毒試驗(yàn)(ISO 10993-11 2006)檢測(cè)無急性生身毒性反應(yīng)。植入后局部反應(yīng)試驗(yàn)(IS010993-6 :2007)，膠原蛋白海綿植入1周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞及少量多核巨細(xì)胞，材料周圍有肉芽組織包繞。植入4周后，在試樣材料周圍有較多的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞。植入12周后，植入部位有極少的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞，試樣材料被降解吸收，無肉眼可辨別異物。以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.膠原蛋白海綿的制備方法，包括如下步驟在pH值1. 0 5. 0的條件，將牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；酶解液離心取上清，用飽和鹽溶液鹽析出膠原蛋白；將鹽析出的膠原蛋白進(jìn)行透析；在交聯(lián)劑水溶液中將透析后的膠原蛋白交聯(lián)；將交聯(lián)后的膠原蛋白凝膠凍干，在交聯(lián)劑水溶液中將所述膠原蛋白交聯(lián)，然后冷凍干燥得到膠原蛋白海綿。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶或木瓜蛋白酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述飽和鹽溶液為飽和氯化鈉溶液或飽和氯化鉀溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述交聯(lián)劑選自甲醛、戊二醛、碳化亞胺、雙環(huán)氧化合物、京尼平、原花青素中任一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于所述交聯(lián)劑水溶液中交聯(lián)劑的體積百分含量為0.01 1%。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述蛋白酶水溶液中蛋白酶的濃度為 0.01 1000mg/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述上清與所述飽和鹽溶液的體積比為1 (1 100)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種膠原蛋白海綿的制備方法。該方法包括如下步驟在pH值1.0～5.0的條件，將牛跟腱在蛋白酶水溶液中酶解；酶解液離心取上清，用飽和鹽溶液鹽析出膠原蛋白；將鹽析出的膠原蛋白進(jìn)行透析；在交聯(lián)劑水溶液中將透析后的膠原蛋白交聯(lián)；將交聯(lián)后的膠原蛋白凝膠凍干，在交聯(lián)劑水溶液中將所述膠原蛋白交聯(lián)，然后冷凍干燥得到膠原蛋白海綿。本發(fā)明的膠原蛋白海綿的制備方法獲得的膠原蛋白海綿浸水后有一定彈拉韌性、有良好的生物相容性能和組織修復(fù)性能，可控降解，蛋白質(zhì)含量高。
文檔編號(hào)A61L27/24GK102416195SQ20101029483
公開日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者宋文領(lǐng), 石凌鋒 申請(qǐng)人:北京益而康生物工程開發(fā)中心