專利名稱：一種硫化氫產(chǎn)生酶制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶制劑及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種硫化氫產(chǎn)生酶制劑及其用途。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，硫化氫一直被認(rèn)為是一種有毒的氣體。然而最近研究表明，硫化氫作為 氣態(tài)信號(hào)分子在多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，顯示出極大的治 療性應(yīng)用前景。正常情況下，機(jī)體的穩(wěn)態(tài)可通過(guò)神經(jīng)和體液系統(tǒng)進(jìn)行內(nèi)源調(diào)節(jié)。一氧化氮和一氧 化碳是兩類早已確認(rèn)的內(nèi)源氣態(tài)調(diào)節(jié)因子，最近，硫化氫被證實(shí)為第三種氣態(tài)信號(hào)分子，共 同參與穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。研究表明，正常機(jī)體組織中存在著一定濃度的硫化氫(如大鼠血清中 約含46 μ M硫化氫，哺乳動(dòng)物腦組織中約含50-160 μ M硫化氫，哺乳動(dòng)物胃腸道中的硫化氫 濃度更高，達(dá)0.2 3. 4mM)，它們1/3以氣態(tài)形式存在，2/3以離子(主要是HS-)形式存 在。這些內(nèi)源性硫化氫主要由兩類磷酸吡哆醛依賴性酶胱硫醚β-合酶(cystathionine β -synthase, CBS, EC 4. 2. 1. 22)和胱硫醚 Y _ 裂解酶(cystathionine y-lyase, CGL ；又 稱為Y-胱硫醚酶，Y-cystathionase,CSE,EC 4.4. 1. 1)催化產(chǎn)生。硫化氫可直接作用于 Katp通道，通過(guò)減少細(xì)胞外Ca2+的內(nèi)流及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮超極化因子等方式來(lái)舒張 血管平滑肌，同時(shí)，還可通過(guò)對(duì)絲裂原激活蛋白激酶的作用抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn) 其凋亡，改善血管重構(gòu)。硫化氫的主要生理功能有治療消化道潰瘍非留體類抗炎藥(NSAIDs)廣泛用于關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱和疼痛癥狀 的緩解，但易引發(fā)消化性潰瘍。研究顯示NSAIDs抑制胃及腸粘膜細(xì)胞CSE的表達(dá)，減少 硫化氫的生成，如預(yù)先給大鼠注射NaHS，則可增加胃和腸粘膜血流，減少服用NSAIDs后 引起的粘膜損傷(Sivarajah etal. , Shock. 2006，26 154-161)。在大鼠的胃腸道潰瘍模 型中，使用NSAIDs會(huì)延緩愈合的進(jìn)程，而硫化氫供體或L-半胱氨酸可加速潰瘍的愈合 (Wallace et a 1.，F(xiàn)ASEB J. 2007,21 =4070-4076) 兩種能釋放硫化氫的 NSAIDs 衍生物， ATB337 (雙氯芬酸衍生物)和ATB343 (吲哚美辛衍生物)，可抑制前列腺素合成以及環(huán)氧 化酶的活性，阻止白細(xì)胞粘附到血管內(nèi)皮，而不會(huì)引起胃腸道粘膜損傷(Wallace，Trends Pharmacol Sc i. 2007,28 :501_505)，說(shuō)明硫化氫與NSAlDs聯(lián)用能減少NSAIDs的致潰瘍副作 用。維持血壓穩(wěn)定研究表明，自發(fā)性或誘發(fā)性高血壓大鼠的血漿中硫化氫濃度顯著 低于正常大鼠，如果靜脈注射或腹腔注射NaHS (—種硫化氫的供體)，不僅可提高血漿中的 硫化氫水平，還能顯著降低大鼠的血壓(Shiet al.，American J Physiology Heart and Circulation Physiology. 2007，293 =2093-2100)。對(duì)正常大鼠體外灌注胱硫醚β _合酶或 胱硫醚Y -裂解酶的激活劑，可使受試動(dòng)物的血壓降低，反之，如果灌注這些酶的抑制劑， 則會(huì)使受試動(dòng)物的血壓升高(Webb et al.，J Pharm Experiment Threapeut. 2008,324 876-882)。Yang等用敲除CSE基因的突變小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種突變小鼠其硫化氫的水
3平顯著下降，并表現(xiàn)出明顯的高血壓傾向和依賴內(nèi)皮的血管舒張功能喪失，如果靜脈注射 或腹腔注射NaHS，可使血壓回歸正常(Science，2008，322 :587_590)，這些研究都說(shuō)明硫化 氫在血管擴(kuò)張和血壓調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。保護(hù)心臟心肌缺血損傷的大鼠其血漿硫化氫水平顯著降低，心肌CSE活性 下調(diào)，外源性給予NaHS可以改善左室收縮功能和舒張功能、降低心肌缺血損傷大鼠的 死亡率，還可減少心肌纖維原細(xì)胞的增生和肥大，減少脂質(zhì)過(guò)氧化作用(Ji et al., EurJPharmacol. 2008,587 :1_7)。在大鼠心肌缺血/再灌注模型中，缺血前15min預(yù)先給予 NaHS能明顯保護(hù)心臟功能，減少心肌梗死面積，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞再生 (Bliksoen et al. , EurJ Cardiothorac Surg. 2008，34 :344_349)，說(shuō)明硫化氫對(duì)缺血心肌 具有保護(hù)作用。防止動(dòng)脈粥樣硬化研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的模型小鼠中血漿硫化氫水平明顯 降低，硫化氫濃度與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度具有明顯相關(guān)性，腹腔注射NaHS后，血清中 硫化氫的含量明顯升高，主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊明顯縮小(王燕飛等，國(guó)藥理學(xué)通 報(bào).2008,24 :1293-1296)，提示硫化氫可以延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程。此外，硫化氫在防治腸易激綜合征、降低代謝、防止低氧性損傷、參與神經(jīng)調(diào)節(jié)等 生理活動(dòng)中也起著非常重要的作用。既然H2S具有如此重要的生理功能，與其相關(guān)的藥物開(kāi)發(fā)工作自然受到重視。據(jù) 2008年5月27日的 < 生命科學(xué)世界 > 報(bào)道，美國(guó)Ikaria Holdings公司已完成對(duì)注射用硫 化氫前體IK-10 01的一期臨床研究，期望開(kāi)發(fā)成對(duì)低氧和缺血性心血管疾病具有特效的 藥物。但是動(dòng)物對(duì)H2S濃度非常敏感，過(guò)高的H2S會(huì)損傷神經(jīng)及呼吸系統(tǒng)，嚴(yán)重時(shí)甚至引起 動(dòng)物麻痹和肺水腫。雖然在生理學(xué)條件下，過(guò)多的硫化氫可在線粒體內(nèi)被硫代硫酸鹽還原 酶迅速代謝，但像NaHS等快速硫化氫釋放試劑作為候選藥物具有極大的風(fēng)險(xiǎn)。因此能緩慢 釋放硫化氫的化合物正日益受到相關(guān)藥物研究者的重視，Li等于2008年合成了一種水溶
GYY4137 (morpholin-4-ium 4methoxyphenol phosphinodithioate) ,ff^^Bj, 該化合物能在數(shù)小時(shí)內(nèi)持續(xù)緩慢釋放硫化氫，具有擴(kuò)張血管及降低血壓等作用。2010年3 月加拿大Antibe Therapeutics公司開(kāi)發(fā)成功能釋放硫化氫的非甾體類抗炎藥ATB-346并 成功進(jìn)入市場(chǎng)。但是，目前正在使用的非留體類抗炎藥有上千種，要在每一種藥物上都連接 一個(gè)硫化氫緩釋基團(tuán)，將是一項(xiàng)非常艱巨的工作，而且這些化學(xué)合成藥可能會(huì)產(chǎn)生新的毒 副作用。如果能開(kāi)發(fā)一個(gè)毒副作用小的硫化氫緩釋劑作為“萬(wàn)能”輔助藥物，將有極大的市 場(chǎng)前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種硫化氫產(chǎn)生酶酶制劑，該酶制劑能催化L-半胱氨酸脫硫并緩 慢產(chǎn)生硫化氫。硫化氫產(chǎn)生的速率與酶比活力、底物L(fēng)-半胱氨酸的含量，輔助因子磷酸吡 哆醛和二硫蘇糖醇的濃度及酶所處的環(huán)境條件有關(guān)。該酶制劑解決了現(xiàn)有硫化氫釋放試劑 釋放過(guò)快、副作用較大的問(wèn)題?？梢耘c幾乎所有非留體類抗炎藥聯(lián)用，降低這類藥物的致潰 瘍風(fēng)險(xiǎn)。一種酶制劑，該制劑中含硫化氫產(chǎn)生酶、質(zhì)量百分比為0. 01 0. 的磷酸吡哆 醛和質(zhì)量百分比為O 0. 的二硫蘇糖醇，所述的硫化氫產(chǎn)生酶為在微量磷酸吡哆醛存在的條件下能將L-半胱氨酸脫硫產(chǎn)生硫化氫的酶。所述的硫化氫產(chǎn)生酶為胱硫醚β -合酶、胱硫醚Y “裂解酶和半胱氨酸脫硫酶中 的至少一種。所述的硫化氫產(chǎn)生酶比活力單位優(yōu)選為1 2000U/g。本發(fā)明還提供了上述酶制劑在制備硫化氫產(chǎn)生藥物中的用途及在治療和預(yù)防因 內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生被抑制或內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生不足而引起的疾病中的用途。本發(fā)明中硫化氫產(chǎn)生酶的活力定義為以每克酶制劑在37°C、pH8. 0的緩沖液中 每分鐘生成1微摩爾硫化氫定義為1個(gè)酶活單位(U)。本發(fā)明中硫化氫產(chǎn)生酶制劑的優(yōu)點(diǎn)是(1)利用硫化氫產(chǎn)生酶將含硫氨基酸分解 成硫化氫。由于硫化氫的脂溶性5倍于它的水溶性，因此能容易地穿過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞之 間自由擴(kuò)散。這種特性有利于制成口服或透皮藥物?？诜幬镆揽磕c上皮細(xì)胞的吸收， 透皮藥物利用皮膚的吸收作用，可增加血液和組織中的硫化氫含量；(2)可通過(guò)控制酶制 劑的用量、控制底物(如半胱氨酸)和輔助因子(如磷酸吡哆醛)的劑量來(lái)調(diào)節(jié)硫化氫 產(chǎn)生酶的活性；(3)所用的酶制劑(本身就是蛋白質(zhì))、底物(如半胱氨酸)和輔助因子 (如磷酸吡哆醛)是機(jī)體本身的組分，幾乎沒(méi)有副作用；(4)酶制劑制成腸溶包衣微膠囊 后，不會(huì)被胃酸和胃蛋白酶破壞，而食物中的蛋白質(zhì)被蛋白酶消化后釋放出的半胱氨酸，正 好成為硫化氫產(chǎn)生酶的底物。由于腸道對(duì)硫化氫的敏感性比較低，或者說(shuō)腸道能耐比較 高的硫化氫濃度(一般哺乳動(dòng)物胃腸道中硫化氫濃度可維持在0. 2 3. 4mM,見(jiàn)Rose P， WorldJGastroenterol 2005，11(26) =3990-3997)，因此不會(huì)有大的副作用，而且嚴(yán)格意義 上說(shuō)，腸道應(yīng)是機(jī)體的外環(huán)境，如果不小心服用過(guò)量，多量的硫化氫會(huì)通過(guò)腸腔排到大氣 中。以本發(fā)明以硫化氫產(chǎn)生酶為活性成分，與制藥學(xué)上可接受的載體或藥用輔料組 合，可開(kāi)發(fā)成相宜的治療藥物或保健食品。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1. 口服腸溶酶制劑A將比活力單位為2000U/g的半胱氨酸脫硫酶凍干粉末與磷酸吡哆醛、二硫蘇糖醇 和L-半胱氨酸以質(zhì)量比100 0. 1 0. 1 0.5混合后，加入3倍重量的淀粉，混勻，各取 200mg裝入每一腸溶膠囊，即可得總酶活單位約為100U/膠囊的口服腸溶制劑。該制劑需冷 藏保存，防止受潮。實(shí)施例2. 口服腸溶酶制劑B將比活力單位為lU/g的胱硫醚β-合酶與磷酸吡哆醛和二硫蘇糖醇以質(zhì)量比 100 0. 5 0.5混合后，取IOOmg壓成片芯；在鄰苯二甲酸乙酸纖維素包衣液中加入重量 百分比為5%的L-半胱氨酸進(jìn)行第一次包衣，然后用聚丙烯酸樹(shù)脂進(jìn)行第二層包衣，即制 備成總酶活單位約為0. IU/片的口服腸溶衣片。包衣按醫(yī)藥制作的常規(guī)方法進(jìn)行即可。包 衣片冷凍干燥保藏。實(shí)施例3. 口服腸溶酶制劑C將比活力單位為510U/g的胱硫醚β-合酶凍干粉末、lU/g的胱硫醚Y-裂解酶凍 干粉末和220U/g的半胱氨酸脫硫酶凍干粉末以質(zhì)量比1 1 1的比例混合，加入總質(zhì)量0. 03%的磷酸吡哆醛、0. 02%的二硫蘇糖醇、5%的L-半胱氨酸和10倍質(zhì)量的微晶纖維素， 混勻后裝入腸溶膠囊中，制成口服腸溶制劑C，冷凍干燥保藏。實(shí)施例4. 口服腸溶酶制劑D將比活力單位為120U/g的胱硫醚β -合酶粗酶凍干粉末和比活力單位為1480U/ g的胱硫醚Y-裂解酶凍干粉末以質(zhì)量比5 1的比例混合，加入總質(zhì)量0.01%的磷酸吡 哆醛和50%的甘露醇，按常規(guī)方法在壓片機(jī)上壓成片芯，然后噴上醋酸纖維素包衣，制備成 半透膜片劑，在片劑外再包一層歐巴代(OYP)腸溶包膜，制備成口服腸溶制劑D。該制劑最 好與適量半胱氨酸制劑一起服用，或僅利用腸道中蛋白分解后生成的半胱氨酸緩慢釋放硫 化氫。實(shí)施例5. 口服腸溶酶制劑E將比活力單位為1340U/ml的胱硫醚Y -裂解酶溶液與質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 2 %的磷 酸吡哆醛、0. 的二硫蘇糖醇和50%的羧甲基淀粉鈉，混勻后送入低溫顆粒搖擺機(jī)進(jìn)行造 粒，小丸經(jīng)低溫干燥后在旋流流化床包衣機(jī)上用CAP (苯二甲酸醋酸纖維素酯)進(jìn)行包衣； 包衣后的小丸與質(zhì)量百分比為1 %的L-半胱氨酸混合，裝入市售腸溶衣膠囊中，制備成口 服腸溶制劑E，冷凍干燥保藏。實(shí)施例6.透皮酶制劑貼片F(xiàn)將比活力單位為1080U/ml的胱硫醚Y -裂解酶與質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為0. 2 %的磷酸吡 哆醛和0. 的二硫蘇糖醇混合后，加入等體積的50%明膠水溶液后，再加入等體積的甘 油后，用研和法制備成軟膏劑，冷藏。使用時(shí)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為的L-半胱氨酸，混勻后涂 布于膠布上，作為透皮貼片，貼于皮膚表面。實(shí)施例7.酶制劑的硫化氫產(chǎn)生活力精確稱取酶制劑0. 1克(或吸取0. Iml)，加至IOmL比色管中，加入ρΗ8· 0的20mM Tris緩沖液8ml，37°C保溫10分鐘后，加入5mM L-半胱氨酸0. 5ml，37°C反應(yīng)30分鐘后，取 反應(yīng)液1. 6ml，加0. 2ml 二甲基對(duì)苯二胺溶液(0. 02M 二甲基對(duì)苯二胺硫酸鹽溶于7. 2M鹽酸 中)和0. 2ml氯化鐵溶液(0. 03M氯化鐵溶于1. 2M鹽酸中)，37°C反應(yīng)30分鐘后，測(cè)定反應(yīng) 液在667nm下的吸光度。用硫化鈉作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得產(chǎn)生的硫化氫濃度。硫化氫產(chǎn)生酶的活力以每克(或每ml)制劑在37°C、pH8. 0的緩沖液中每分鐘生 成1微摩爾硫化氫定義為1個(gè)酶活單位(U)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1.酶的比活力測(cè)定(U)
酶來(lái)源酶制劑A酶制劑B酶制劑C酶制劑D酶制劑E酶制劑F酶活力1960U/glU/g250U/g350U/g1340U/ml1080U/ml 實(shí)施例8.酶制劑的半衰期。精確稱取酶制劑0. 1克(或吸取0. Iml)，加至IOmL比色管中，加入ρΗ8· 0的20mM Tris緩沖液8mL，37°C水浴保溫。每隔2小時(shí)，取一管加入5mM L-半胱氨酸0. 5mL,按實(shí)施 例6中的方法測(cè)定酶活力，以酶活力下降一半的時(shí)間作為酶制劑的半衰期。結(jié)果見(jiàn)表2。表2.酶的半衰期測(cè)定(h)
權(quán)利要求
一種酶制劑，其特征在于該制劑中含硫化氫產(chǎn)生酶、質(zhì)量百分比為0.01～0.1％的磷酸吡哆醛和質(zhì)量百分比為0～0.1％的二硫蘇糖醇，所述的硫化氫產(chǎn)生酶為在微量磷酸吡哆醛存在的條件下能將L 半胱氨酸脫硫產(chǎn)生硫化氫的酶。
2.如權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于所述的硫化氫產(chǎn)生酶為胱硫醚β-合酶、 胱硫醚Y-裂解酶和半胱氨酸脫硫酶中的至少一種。
3.如權(quán)利要求1所述的酶制劑，其特征在于所述的硫化氫產(chǎn)生酶比活力單位1 2000U/g。
4.如權(quán)利要求1 3任一所述的酶制劑在制備硫化氫產(chǎn)生藥物中的用途及在治療和預(yù) 防因內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生被抑制或內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生不足而引起的疾病中的用途。
5.一種包含權(quán)利要求1 3任一所述酶制劑的口服制劑和貼片。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種硫化氫產(chǎn)生酶制劑及其用途，該制劑中含硫化氫產(chǎn)生酶、質(zhì)量百分比為0.01～0.1％的磷酸吡哆醛和質(zhì)量百分比為0～0.1％的二硫蘇糖醇，所述的硫化氫產(chǎn)生酶為在微量磷酸吡哆醛存在的條件下能將L-半胱氨酸脫硫產(chǎn)生硫化氫的酶。本發(fā)明酶制劑可通過(guò)與常規(guī)輔料混合制成口服制劑，增加硫化氫供給，可治療和預(yù)防因內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生被抑制或內(nèi)源性硫化氫產(chǎn)生不足而引起的疾病，而且無(wú)毒副作用，具有廣闊應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101940785SQ20101029036
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月25日
發(fā)明者吳根福 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)