專利名稱：一種牡蠣殼提取物的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種牡蠣殼提取物的制備方法及其在制備細(xì)胞增殖抑制劑、血管生成 抑制劑和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在海水養(yǎng)殖品種中，貝類由于投入成本低、單產(chǎn)高等特點(diǎn)，占海水養(yǎng)殖的比重高達(dá) 80%以上，成為沿海漁民增收的重要渠道。貝類養(yǎng)殖中以牡蠣養(yǎng)殖為主，但是牡蠣生產(chǎn)加 工過程中殘留的大量牡蠣殼，除部分粉碎后作為動物飼料出售或煅燒白灰外，沒有得到有 效利用和妥善處理，常被加工者直接傾倒在公路兩旁、閑雜空地或廢棄溝渠里，嚴(yán)重污染環(huán) 境，直接影響了城鄉(xiāng)人居環(huán)境的改善和新農(nóng)村的建設(shè)。牡蠣殼作為中藥使用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，亦為歷次《中華人民共和國藥典》收 載，是常見海洋中藥，具有重鎮(zhèn)安神，潛陽補(bǔ)陰，軟堅(jiān)散結(jié)，收斂固澀的功效，用于驚悸失眠， 眩暈耳鳴，瘰癘痰核，癥瘕痞塊等病癥的治療。中藥牡蠣主要成分是碳酸鈣等無機(jī)成分，所 含重量比占90%以上，此外含有不到10%的有機(jī)成分，如蛋白質(zhì)、糖蛋白和多種氨基酸等。 目前對牡蠣殼中可溶性蛋白質(zhì)的制備方法以及在骨科中的應(yīng)用研究較多，對牡蠣殼提取物 的制備方法及其在制備細(xì)胞增殖抑制劑、血管生成抑制劑或抗腫瘤藥物中的應(yīng)用研究至今 未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種牡蠣殼提取物的制備方法及其在制備細(xì)胞增殖抑制劑、 血管生成抑制和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，以滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。一種牡蠣殼提取物的制備方法，其特征在于先稱取牡蠣殼粉，再按料液比為 Ig 2-20mL加入含水的醇溶液，回流提取，過濾或離心分出液體；所得液體在減壓條件下 濃縮后，用有機(jī)溶劑提取，分取有機(jī)溶劑層，減壓濃縮，干燥后得牡蠣殼提取物。上述的牡蠣殼提取物在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。上述的牡蠣殼提取物在制備血管生成抑制劑中的應(yīng)用。上述的牡蠣殼提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B(SRB)法測試了制備的牡蠣殼提取物對多種腫瘤細(xì)胞 株的細(xì)胞增殖抑制作用，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測試了牡蠣殼提取物對人臍靜脈內(nèi) 皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，本牡蠣殼提取物可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制 血管生成方式，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此本發(fā)明的牡蠣殼提取物可用作細(xì)胞增殖抑制 劑、血管生成抑制劑和抗腫瘤劑。
具體實(shí)施例方式制備本發(fā)明的牡蠣殼提取物時(shí)，先稱取牡蠣殼粉，按料液比為Ig 2-20mL加入含 水的醇溶液，回流提取，過濾或離心分出液體；所得液體在減壓條件下濃縮后，用有機(jī)溶劑提取，分取有機(jī)溶劑層，減壓濃縮，干燥后得牡蠣殼提取物。本發(fā)明中所述的醇為甲醇或乙醇，所含水的體積百分濃度為0-50%。所述的有機(jī) 溶劑為二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚或丙酮。實(shí)施例1稱取200g牡蠣殼粉末，置于反應(yīng)容器中，加入IOOOmL 50% (體積百分濃度，下 同)含水的乙醇溶液，回流提取1. 5h，離心后分出液體；向所得藥渣繼續(xù)加IOOOmL的50% 含水的乙醇溶液，回流提取lh，離心后分出液體。合并上述所得2次提取液，減壓濃縮至 IOOmL后，用等體積的二氯甲烷萃取2次，合并二氯甲烷萃取液，于40°C減壓濃縮蒸干，得牡 蠣殼提取物。采用麗絲胺羅丹明B(SRB)法，測試所制得的牡蠣殼提取物對腫瘤細(xì)胞的增殖 抑制活性。用人肝癌BEL-7402細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞和小鼠白血病P388細(xì)胞，分別 在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在32°C (P388細(xì)胞)或在37°C (BEL-7402和 Hela細(xì)胞)，通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，用新鮮的 RPMI-1640培養(yǎng)基配制成密度為每毫升2 X IO5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，按每孔200 μ L接種于 96孔板中，每孔加入2 μ L不同濃度的樣品或空白溶液，37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。繼而，在4°C、 3000轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘，吸去上清液。每孔加入20%三氯醋酸50 μ L，置于4°C固定1小 時(shí)，用水沖洗5次，并空氣干燥。每孔加入0.4% SRB的醋酸溶液50 μ L并在室溫靜置30 分鐘。用醋酸水溶液清洗4次后，每孔加入150yL三羥甲基氨基甲烷(Tris)緩沖液 (10mmol/L, pH 10. 5)，利用MD公司產(chǎn)SPECTRA MAX Plus型酶標(biāo)儀測定每孔在520nm處的 光密度(OD)值。在同一塊96孔板中樣品的每個(gè)濃度均設(shè)置三孔，另設(shè)三孔空白對照。取 三孔平均OD值，按公式= (0D空白對照-OD樣品)/OD空白對照X 100 %計(jì)算每個(gè)濃 度下的細(xì)胞增殖抑制率(IR% )。腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明，所制取的牡蠣殼提取物對小 鼠白血病P388細(xì)胞的IC5tl值為67. 3 μ g/mL ；牡蠣殼提取物在250 μ g/mL濃度下，對人宮頸 癌Hela細(xì)胞和人肝癌BEL-7402細(xì)胞的增殖抑制率分別為64. 84和77. 78%。以上實(shí)驗(yàn)證 實(shí)，所制取的牡蠣殼提取物對腫瘤細(xì)胞可通過抑制細(xì)胞增殖方式，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法，測試所制得的牡蠣殼提取物對血管生成的抑制活 性。用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEHUVEC細(xì)胞，在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，37°C、 通入5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中繼代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC，計(jì)數(shù) 后埋96孔板，濃度為5000個(gè)/孔。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)孵育48h。換用 含1 %胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，加藥，繼續(xù)孵育48h。然后每孔加入5mg/mL的MTT溶 液20 μ L，孵育4h。吸出MTT，加入150 μ L 二甲基亞砜充分溶解；酶標(biāo)儀490nm處測定吸光 度。內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明，所制取的牡蠣殼提取物在250 μ g/mL濃度下，對人臍靜脈 內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的增殖抑制率為25. 86%。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，所制取的牡蠣殼提取物對腫瘤細(xì) 胞可通過抑制血管生成的方式，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。實(shí)施例2稱取200g牡蠣殼粉末，置于反應(yīng)容器中，用1200mL的甲醇，回流提取lh，過濾分出 液體；向所得藥渣繼續(xù)加入IOOOmL的甲醇，回流提取0. 5h，過濾分出液體；再次向所得藥渣 加入IOOOmL的甲醇，回流提取0. 5h，過濾分出液體。合并上述所得3次提取液，于40°C減 壓濃縮蒸干后，共用200mL丙酮分2次提取，合并丙酮提取液，于40°C減壓濃縮蒸干，得牡蠣殼提取物。腫瘤細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)表明，所制取的牡蠣殼提取物在100μ g/mL濃度下，對小 鼠白血病P388細(xì)胞的增殖抑制率為81. 32%。
權(quán)利要求
一種牡蠣殼提取物的制備方法，其特征在于先稱取牡蠣殼粉，再按料液比為1g∶2 20mL加入含水的醇溶液，回流提取，過濾或離心分出液體；所得液體在減壓條件下濃縮后，用有機(jī)溶劑提取，分取有機(jī)溶劑層，減壓濃縮，干燥后得牡蠣殼提取物。
2.如權(quán)利要求1所述牡蠣殼提取物的制備方法，其特征在于所述的醇為甲醇或乙醇， 所含水的體積百分濃度為0-50%。
3.如權(quán)利要求1所述牡蠣殼提取物的制備方法，其特征在于所述的有機(jī)溶劑為二氯甲 烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚或丙酮。
4.權(quán)利要求1所述的牡蠣殼提取物在制備細(xì)胞增殖抑制劑中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的牡蠣殼提取物在制備血管生成抑制劑中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的牡蠣殼提取物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種牡蠣殼提取物的制備方法，其特征在于先稱取牡蠣殼粉，再按料液比為1g∶2-20mL加入含水的醇溶液，回流提取，過濾或離心分出液體；所得液體在減壓條件下濃縮后，用有機(jī)溶劑提取，分取有機(jī)溶劑層，減壓濃縮，干燥后得牡蠣殼提取物。本發(fā)明采用麗絲胺羅丹明B法測試了制備的牡蠣殼提取物對多種腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞增殖抑制作用，采用四甲基偶氮唑鹽法測試了牡蠣殼提取物對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明，本牡蠣殼提取物可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖和抑制血管生成方式，從而發(fā)揮其抗腫瘤作用。因此本發(fā)明的牡蠣殼提取物可用作細(xì)胞增殖抑制劑、血管生成抑制劑和抗腫瘤劑。
文檔編號A61K35/56GK101953850SQ20101028036
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者劉紅兵, 楊雪, 管華詩 申請人:中國海洋大學(xué)