專利名稱：一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胞外多糖改性技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及 其制備方法和它的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)具有公認(rèn)的安全性，是健康動(dòng)物消化道內(nèi)的優(yōu)勢(shì) 菌群，資源豐富，種類繁多，并對(duì)宿主發(fā)揮生物屏障、營(yíng)養(yǎng)、免疫、控制內(nèi)毒素血癥、延緩衰 老、抗腫瘤等生理作用。隨著研究日漸深入，人們發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌的許多表觀特性及功能都 與其代謝產(chǎn)物有關(guān)，對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究具有十分重要的意義。多糖是指由20個(gè)以上單糖組成的糖類化合物，是生物體重要的生物大分子之一， 因其多變的結(jié)構(gòu)而成為一種最具魅力的信息載體，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老、降血脂、 降血糖、抗炎、抗病毒等生理功能，并逐漸成為現(xiàn)代生物、醫(yī)藥、食品、化工行業(yè)的研究開發(fā) 重點(diǎn)，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。其中，免疫調(diào)節(jié)類多糖是研究最多、臨床應(yīng)用最廣的多糖，也是 最具開發(fā)應(yīng)用潛力的多糖。乳酸菌胞外多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等生理活性，不僅對(duì)乳制品的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味 具有重要影響，而且有可能成為保健食品的一個(gè)良好來源，廣泛應(yīng)用于各種食品的增稠、穩(wěn) 定、乳化、膠凝及保濕。雙歧桿菌是乳酸菌的一種，具有很高的安全性和應(yīng)用潛力，胞外多糖 (exopolysaccharide,EPS)是其重要的代謝產(chǎn)物之一，為了提高和保護(hù)多糖活性，其結(jié)構(gòu)修 飾方面的研究也有了很大的進(jìn)展。對(duì)于多糖生理活性的修飾主要包括主鏈的部分降解、硒 酸酯化、硫酸酯化、部分乙酰化、羧甲基化、羧乙基化、多羥基化、支鏈修飾等。隨著現(xiàn)代生物 技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)、酶法技術(shù)和部分物理手段也被用來對(duì)多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，以增 強(qiáng)其生理活性，尤其在免疫增強(qiáng)和抗腫瘤方面研究較為深入。例如，Jamas等向一株野生酵 母菌引入外源基因，使其胞內(nèi)多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，支鏈糖基取代度從0. 2提高到0. 5，且空 間構(gòu)象變得更為舒展，單螺旋結(jié)構(gòu)的比例提高，多糖體外抗腫瘤活性比修飾前提高35倍左 右；Stahmarm等報(bào)道，一種具有β _1，3-D-葡聚糖結(jié)構(gòu)的真菌多糖經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的超聲處理 后，分子量從25萬降至5萬左右，經(jīng)小角度X光衍射分析，其超聲降解產(chǎn)物的空間結(jié)構(gòu)與具 有免疫調(diào)節(jié)活性的裂褶多糖相似；Demleitner等以curdlan為研究對(duì)象，進(jìn)行了以D-半乳 糖、D或L-阿拉伯糖以及它們各自的低聚糖為取代基的支鏈修飾，并分別研究其抗腫瘤活 性，結(jié)果表明，D-葡萄糖為支鏈的curdlan衍生物活性最高。由于經(jīng)過修飾能夠提高多糖活性，所以，此方面的研究逐漸成為近幾年國(guó)內(nèi)外關(guān) 注的焦點(diǎn)。此項(xiàng)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外專利授權(quán)情況如下硫酸酯化枸杞多糖，硫酸酯化姬松茸多糖，硫酸酯化苦瓜多糖，硫酸酯化云芝多糖 和硫酸酯化茶樹菇多糖均已有專利申報(bào)，例如，閆紅、易劍平“硫酸酯化多糖及其制備方法 和應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?200510098339. 0)。2006年，意大利的喬治·佐派蒂、帕斯夸·安娜·奧雷斯特等申請(qǐng)的專利“K5多糖 高硫酸化衍生物及其制備方法”(申請(qǐng)?zhí)?200610127561. 3)通過異丙醇處理和消除親油物質(zhì)提純大腸桿菌K5多糖，純化的產(chǎn)物經(jīng)過N-脫乙?；饔煤罂捎脕碇苽淞蛩峄潭雀叩?新型N，0-硫酸化多糖。國(guó)內(nèi)也有多糖硫酸酯化的報(bào)道。2004年，鄭維發(fā)、儲(chǔ)成才，“新月菱形藻胞外多糖硫 酸酯及其制備方法與應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?200410090619. 2)中先將新月菱形藻胞外多糖先與甲 酰胺混合，然后加入酯化試劑在冰浴條件下進(jìn)行酯化反應(yīng)，將反應(yīng)物中和至PH6. 8 7. 2， 用有機(jī)溶劑沉淀，所得沉淀溶解、透析即得新月菱形藻胞外多糖硫酸酯，并證明該胞外多糖 硫酸酯免疫調(diào)節(jié)活性有了顯著的提高，對(duì)病毒性肺炎和腫瘤的形成有明顯的抑制作用。隨著生理功能構(gòu)效研究方面的發(fā)展，其他改性手段也逐漸引入該技術(shù)領(lǐng)域。 2004年，在劉建林、趙雪松，“硒酸酯多糖制備新工藝”(申請(qǐng)?zhí)?200410067065. 4)中 將卡拉膠進(jìn)行硒酸酯化，形成了一種有機(jī)硒閾值穩(wěn)定在50-100mg/g的硒化卡拉膠 (Kappa-Selenocarrageenan)，控制了重復(fù)抱團(tuán)現(xiàn)象，形成了一維納米結(jié)晶，磺酸基團(tuán)完全 被亞硒酸基團(tuán)修飾，降低了生物毒性，該發(fā)明合成的硒酸酯多糖，具有毒性小、生物利用度 高的特點(diǎn)；2004年，孟晟、鐘偉在“一種磷脂基團(tuán)修飾的多糖或其衍生物的合成方法”(申 請(qǐng)?zhí)?200410054022. 2)中報(bào)道了將磷酰膽堿等具有仿生功能的基團(tuán)通過縮合反應(yīng)，共價(jià) 鍵合到天然的、生物可降解的天然多糖分子鏈上，制備得一種含有以磷脂基團(tuán)修飾的新型 多糖材料；2004年，于廣利在“一種灰樹花多糖硫酸酯及其制備方法與應(yīng)用”(申請(qǐng)?zhí)?200410023856. 7)中將灰樹花水不溶性多糖懸浮于有機(jī)溶劑中，加入堿液醚化，加入氯乙 酸，控溫進(jìn)行硫酸酯化反應(yīng)制備得到的羧甲基衍生物水溶性好，結(jié)構(gòu)獨(dú)特，價(jià)格便宜，可用 于制備免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物。但是有關(guān)雙歧桿菌胞外多糖及其改性產(chǎn)品的研究報(bào)道非 常少。本發(fā)明對(duì)雙歧桿菌胞外多糖改性，從而提供一種比未改性雙歧桿菌胞外多糖免疫調(diào) 節(jié)性更強(qiáng)的改性雙歧桿菌胞外多糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種含有上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的組合 物。本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的應(yīng)用。一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖，該胞外多糖的紅外光譜中存在1600波 數(shù)和1420波數(shù)的羧甲基中COO-的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮震動(dòng)特征峰，上述羧甲基雙歧 桿菌胞外多糖中羧甲基含量為10% -21%，取代度為0. 35 % -0. 72%，重均分子量為 (0. 8-1. 2) X IO5Da0其制備方法如下(1)將雙歧桿菌胞外多糖溶于濃度為1. 5-2. OmoL/L的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下 加入氯乙酸，于40-80°C繼續(xù)劇烈攪拌反應(yīng)2-4h，其中，雙歧桿菌胞外多糖與氯乙酸的質(zhì)量 比為 1 5-15 ；(2)冷卻步驟(1)的反應(yīng)體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7. 0，過濾，濾液用自 來水透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/2-1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多 糖，再依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2-3次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖。所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的原料雙歧桿菌胞外多糖是通過發(fā)酵星狀雙 歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC No. 1355 而得到的。星狀雙歧桿菌 (Bifidobacterium asteroides)BM-10于2005年4月13日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管 理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No. 1355。該菌株已在申請(qǐng)?zhí)枮?200510105465. 4的專利中公開。有關(guān)利用該菌株發(fā)酵制備雙歧桿菌胞外多糖的方法參見申 請(qǐng)?zhí)枮?00510105465. 4的專利。步驟(1)中所述雙歧桿菌胞外多糖在NaOH水溶液中的濃度為4_20g/L。步驟(2)中透析所用透析袋的截留分子量為8000_12000Da。羧甲基雙歧桿菌胞外多糖中的羧甲基含量、取代度及重均分子量的測(cè)定方法參 見以下兩個(gè)文獻(xiàn)孫婷，呂榮文，張紅兵，光度滴定法測(cè)定羧甲基菊粉的取代度，精細(xì)化工， 2007，24卷，1期，83-85;張燕萍，變性淀粉制造與應(yīng)用[M]，北京化學(xué)工業(yè)出版社，2001， 72。一種以羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖為活性成分的組合物，還包括一種或多種藥學(xué) 上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘結(jié)劑、潤(rùn)濕劑、 崩解劑、表面活性劑、吸附載體、潤(rùn)滑劑等。所述組合物的劑型為藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)劑型，包括片 劑、膠囊、注射劑、凍干粉針、口服液、沖劑等。均可按藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)方法制備。上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖在制備免疫力調(diào)節(jié)保健品或藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明得到的羧甲基雙歧桿菌胞外多糖的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，而且體外實(shí)驗(yàn)表明該胞 外多糖可以顯著提高小鼠脾細(xì)胞中IL-2、IFNy細(xì)胞因子的水平，免疫調(diào)節(jié)力明顯高于未 改性的雙歧桿菌胞外多糖，本發(fā)明的胞外多糖制備方法簡(jiǎn)單易行。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不限制本發(fā)明。實(shí)施例1羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備1(1)設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)，將三份2g雙歧桿菌胞外多糖分別溶于濃度為250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下依次加入氯乙酸10g、20g、30g，于60°C條件下繼續(xù)劇烈攪拌 反應(yīng)3h ；(2)冷卻步驟(1)的反應(yīng)體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7. 0，過濾，濾液用自 來水透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖；得 到的羧甲基雙歧桿菌胞外多糖的羧甲基化結(jié)果見表1。表1不同原料用量對(duì)雙歧桿菌胞外多糖羧甲基化程度及產(chǎn)率的影響 實(shí)施例2羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備2(1)設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)，將三份2g雙歧桿菌胞外多糖分別溶于濃度為250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下分別加入氯乙酸20g，將三份反應(yīng)體系分別置于40°C、60°C、 80°C的條件下繼續(xù)劇烈攪拌反應(yīng)3h ；(2)冷卻步驟(1)的反應(yīng)體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7. 0，過濾，濾液用自 來水透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/4，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖；得 到的羧甲基雙歧桿菌胞外多糖的羧甲基化結(jié)果見表2。表2不同反應(yīng)溫度對(duì)雙歧桿菌胞外多糖羧甲基化程度及產(chǎn)率的影響 實(shí)施例3羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備3(1)設(shè)置三組實(shí)驗(yàn)，將三份2g雙歧桿菌胞外多糖分別溶于濃度為250mL、2. OmoL/L 的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下分別加入氯乙酸20g，將三份反應(yīng)體系分別在60°C條件下繼 續(xù)劇烈攪拌反應(yīng)2h、3h和4h ；(2)冷卻步驟(1)的反應(yīng)體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7. 0，過濾，濾液用自 來水透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/4，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖；得 到的羧甲基雙歧桿菌胞外多糖的羧甲基化結(jié)果見表3。表3不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)雙歧桿菌胞外多糖羧甲基化程度及產(chǎn)率的影響
6 實(shí)施例4羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖對(duì)小鼠脾細(xì)胞細(xì)胞因子的增殖效果將小鼠(昆明種SPF級(jí)小鼠，雌雄不限，體重(18+2) g，5周齡，購(gòu)自北京軍事醫(yī)學(xué) 科學(xué)院)處死制備脾細(xì)胞混懸液，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度達(dá)到2. OX IO6個(gè)/mL ；將未改性的原料雙 歧桿菌胞外多糖和本發(fā)明實(shí)施例3在反應(yīng)3h的情況下制得的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖 分別溶于蒸餾水中制備濃度為100μ g/mL的多糖溶液；96孔板中每孔加100 μ 1上述細(xì)胞混懸液和100 μ 1改性(羧甲基化)或未改性的 雙歧桿菌胞外多糖溶液，同時(shí)設(shè)不加多糖的對(duì)照組。每組測(cè)定三個(gè)平行，置于C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)3d，用細(xì)胞因子試劑盒(進(jìn)口分裝，上海西塘生物科技有限公司)測(cè)定IL-2和IFNy 濃度，結(jié)果見表4。表4小鼠脾細(xì)胞IL-2和IFN γ的檢測(cè)結(jié)果(pg/mL) *與對(duì)照組比較，ρ < 0. 05廣與對(duì)照組比較，ρ < 0.01o表4的數(shù)據(jù)表明，與對(duì)照組相比，雙歧桿菌胞外多糖的體外免疫活性高于未改性 雙歧桿菌胞外多糖，能顯著提高IL-2、IFNy細(xì)胞因子的濃度，表現(xiàn)出體外免疫活性。
權(quán)利要求
一種羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖，其特征在于，所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的紅外光譜中存在1600波數(shù)和1420波數(shù)的羧甲基中COO 的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮震動(dòng)特征峰，上述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖中的羧甲基含量為10％ 21％，取代度為0.35％ 0.72％，重均分子量為(0.8 1.2)×105Da。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖，其特征在于，所述羧甲基化 雙歧桿菌胞外多糖的原料雙歧桿菌胞外多糖是通過發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides)BM-10CGMCC No. 1355 而得到的。
3.權(quán)利要求1所述的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備方法，其特征在于，按照如下 操作步驟進(jìn)行(1)將雙歧桿菌胞外多糖溶于濃度為1.5-2. OmoL/L的NaOH水溶液中，劇烈攪拌下加入 氯乙酸，于40-80°C繼續(xù)劇烈攪拌反應(yīng)2-4h，其中，雙歧桿菌胞外多糖與氯乙酸的質(zhì)量比為 1 5-15 ；(2)冷卻步驟(1)的反應(yīng)體系至室溫，用冰乙酸中和至pH為7.0，過濾，濾液用自來水 透析2d-3d，再用蒸餾水透析ld-2d ；(3)濃縮透析液至原體積的1/2-1/5，然后加入4 5倍95%乙醇沉淀出胞外多糖，再 依次用無水乙醇、丙酮各洗滌沉淀2-3次，真空冷凍干燥沉淀得羧甲基雙歧桿菌胞外多糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備方法，其特征在于，步驟 (1)中所述雙歧桿菌胞外多糖在NaOH水溶液中的濃度為4-20g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的制備方法，其特征在于，所述 雙歧桿菌胞外多糖是通過發(fā)酵星狀雙歧桿菌(Bifidobacterium asteroides) BM-10CGMCC No. 1355而得到的。
6.一種以權(quán)利要求1所述的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖為活性成分的組合物。
7.權(quán)利要求1所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖在制備免疫力調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖在制備免疫力調(diào)節(jié)保健品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種屬于胞外多糖改性技術(shù)領(lǐng)域的羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖及制備方法。該胞外多糖的紅外光譜中存在1600波數(shù)和1420波數(shù)的羧甲基中COO-的對(duì)稱和反對(duì)稱伸縮震動(dòng)特征峰，羧甲基含量為10％-21％，取代度為0.35％-0.72％，重均分子量為(0.8-1.2)×105Da。其制備方法如下將雙歧桿菌胞外多糖與氯乙酸在NaOH水溶液中反應(yīng)后，用冰乙酸中和至pH為7.0，然后經(jīng)過濾、透析、濃縮、沉淀和洗滌而得到羧甲基雙歧桿菌胞外多糖。本發(fā)明還公開了羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖在制備免疫力調(diào)節(jié)保健品或藥物中的應(yīng)用。該羧甲基化雙歧桿菌胞外多糖的體外實(shí)驗(yàn)表明該胞外多糖可以顯著提高小鼠脾細(xì)胞中IL-2、IFNγ細(xì)胞因子的水平，免疫調(diào)節(jié)力明顯高于未改性的雙歧桿菌胞外多糖。
文檔編號(hào)A61K31/715GK101891837SQ20101024829
公開日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2010年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月9日
發(fā)明者吳廣楓, 旭日花, 李平蘭, 林偉靜, 馬世敏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)