專利名稱：一種魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡甘聚糖的制備方法，具體涉及一種采用魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘 聚糖的方法。
背景技術(shù)：
魔芋學名為Amorphophallus konjac，屬單子葉植物綱，天南星科耐蔭性多年生草 本植物的塊莖，是我國的一大特產(chǎn)，廣泛分布于長江流域。云南、四川產(chǎn)量最大，鄂西、湘西、 福建亦有生產(chǎn)。魔芋球莖中含有葡甘聚糖(Konjac Glucomarman，簡稱KGM)、淀粉、纖維、蛋 白質(zhì)和灰分等營養(yǎng)成分，其中主要有效成分是葡甘聚糖，是由D-葡萄糖和D-甘露糖通過 3 _1，4糖苷鍵合的高分子多糖。它具有多種獨特理化性質(zhì)，如膨脹性、流變性、增稠性、膠凝 性和成膜性等。近年來，國內(nèi)外研究證實，KGM是一種優(yōu)良的低熱量、低脂肪、高纖維素的水 溶性膳食纖維，對營養(yǎng)不平衡有重要調(diào)節(jié)作用。諸多學者研究表明，KGM具有降血糖、血脂 及逆轉(zhuǎn)脂肪肝，通便減肥、抗癌、增強免疫功能、抗衰老等奇特的保健作用和醫(yī)療功效，在食 品、醫(yī)藥、化工、紡織、石油鉆探等工業(yè)均有很好的應(yīng)用價值。魔芋由于其來源受環(huán)境和季節(jié) 影響較大，不利于葡甘聚糖的規(guī)模化生產(chǎn)，關(guān)于魔芋細胞液體培養(yǎng)產(chǎn)葡甘聚糖技術(shù)尚未見 報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種材料均一、重復性好的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡 甘聚糖的方法。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，包括以下 步驟(1)愈傷組織的誘導用水將花魔芋塊莖表面清洗干凈，經(jīng)過酒精浸泡、汞浸泡，最后 用滅菌水洗滌，削去表皮并切成小塊，將消毒好的魔芋塊莖切塊移入愈傷誘導養(yǎng)基中，控制 愈傷誘導養(yǎng)基的PH為6. 0，置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)后將膨大的組織再次切成小塊，移入新配 置的愈傷誘導培養(yǎng)基進一步進行培養(yǎng)；(2)細胞液體培養(yǎng)將經(jīng)過愈傷誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)的 生長旺盛的愈傷組織切碎，接種在盛有液體培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；(3)葡甘聚 糖制取將培養(yǎng)液離心處理，上清液在攪拌狀態(tài)下加入乙醇，使培養(yǎng)液使含醇量50 %，放置 24h后，再次離心處理，得到得沉淀物，用50 %乙醇處理數(shù)次，沉淀物冷凍干燥得白色物質(zhì)， 即葡甘露聚糖。步驟(1)中的愈傷誘導培養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg NAA、1. Omg 6_BA 和25g乳糖混合而成。步驟⑵中的液體培養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg 2，4-D，0. lmgKT和30g 乳糖混合而成，控制PH值為6. 0。步驟(1)置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)是指在26°C的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2個月。接種在盛有液體培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)條件是在光照、溫度為25士 rC、110r/min 的搖床條件下振蕩培養(yǎng)。
本發(fā)明提供的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，提出了一種新的以魔芋細胞液 體為主要原料提取葡甘聚糖的方法，解決了魔芋由于其來源受環(huán)境和季節(jié)影響較大，不利 于葡甘聚糖進行規(guī)?；a(chǎn)的問題，可實現(xiàn)從魔芋制取葡甘聚糖的工業(yè)化生產(chǎn)。


下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明圖1懸浮液體培養(yǎng)基對魔芋葡甘 露聚糖含量的影響；圖2不同接種量對魔芋葡甘露聚糖產(chǎn)生的影響；圖3pH對魔芋葡甘露 聚糖含量的影響；圖4不同碳源對魔芋葡甘露聚糖含量的影響；圖5不同濃度乳糖對魔芋 葡甘露聚糖含量的影響。
具體實施例方式一、制備實施例(1)愈傷組織的誘導用水將花魔芋塊莖表面清洗干凈，再用 75%酒精浸泡lmin，0. 升汞浸泡lOmin，最后用滅菌水洗滌4次，削去表皮并切成小塊， 將消毒好的魔芋塊莖切塊移入愈傷誘導養(yǎng)基中，控制愈傷誘導養(yǎng)基的PH為6. 0，置于暗培 養(yǎng)室中在26°C的溫度下培養(yǎng)2個月后將膨大的組織再次切成小塊，移入新配置的愈傷組織 誘導培養(yǎng)基進一步進行培養(yǎng)；上述愈傷誘導養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg NAA (萘 乙酸)、l.Omg 6-BA (6-芐氨基嘌呤，是一種細胞分裂素)和30g蔗糖混合而成；(2)細胞液 體培養(yǎng)將經(jīng)過愈傷誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長旺盛的愈傷組織切碎，接種在盛有液體培養(yǎng)基 的容器中，在光照、溫度為25 士 l°C、110r/min的搖床條件下振蕩培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；液體培 養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg 2，4-D，0. ImgKT (6-糠基腺嘌呤，細胞分裂素)和30g 蔗糖混合而成，控制PH值為6. O。(3)葡甘聚糖制取將培養(yǎng)液4000r/min離心5min，上清液在攪拌狀態(tài)下加95% 乙醇使含醇量50%，放置24h后，4000r/min離心5min，得沉淀物，反復用50%乙醇處理數(shù) 次，冷凍干燥得白色物質(zhì)，即葡甘露聚糖。二、相關(guān)指標測定1、葡甘聚糖含量測定1-1繪制標準工作曲線依次移取濃度為 lmg/mL的葡萄糖標準溶液0. 40，0. 80，1. 20，1. 60，2. OmL于5個IOmL容量瓶中，加蒸餾水補 至2mL，然后分別加入1. 5mL3，5- 二硝基水楊酸試劑，在沸水浴上加熱5min后，用蒸餾水定 容至10mL，于550nm處測定其吸光度(A)。2-2培養(yǎng)物中葡甘露聚糖的測定取培養(yǎng)液4ml，4000r/min離心5min，上清液在攪 拌狀態(tài)下加95%乙醇使含醇量50%，放置24h后，4000r/min離心5min，得沉淀物，反復用 50%乙醇處理數(shù)次，冷凍干燥得白色物質(zhì)，即葡甘露聚糖，測定含量。KGM含量測定將冷凍干燥得白色物質(zhì)加0. 5mLddH20溶解，加0. 5mL3mo VLH2SO4 在沸水浴上水解2h，冷卻加入lmL3mol/LNaOH，并加水定容至10mL，取該水解液2. OmL, 按標準葡萄糖工作曲線步驟測定KGM吸光度值A(chǔ)(OD55tl)15將吸光度值A(chǔ)代入回歸方程A =-0. 019+0. 0392 -T, r = 0. 99958，計算出各吸光度值對應(yīng)的葡萄糖毫克數(shù)T。KGM含量用 下式計算KGM含量=ε ？？ T 稀釋倍數(shù)式中ε = 0. 9，為葡萄糖和甘露糖在葡甘露聚 糖中的殘基相對分子質(zhì)量與葡甘露聚糖水解后得到的葡萄糖和甘露糖相對分子質(zhì)量之比T 為葡甘露聚糖水解液比色測定值，查標準曲線所得毫克數(shù)。2、不同培養(yǎng)基對葡甘聚糖積累的影響在添加2，4-D1.0mg/L+KT0. lmg/L+蔗糖30g/L的MS、N6、B5培養(yǎng)液中，以4g/100mL的接種量接入魔芋愈傷組織，在光照、溫度為 25士 1°C、轉(zhuǎn)速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，由圖1可知，MS培養(yǎng)基利于葡甘露聚糖的合成， 所以選用MS培養(yǎng)基作為獲得高產(chǎn)量次生代謝物葡甘露聚糖基本懸浮培養(yǎng)基。3、不同接種量對葡甘聚糖積累的影響在培養(yǎng)液MS+2，4-Dl. Omg/L+KTO. lmg/L+蔗 糖30g/L中，分別加入2、4、6g/100mL的新鮮魔芋愈傷組織，在光照、溫度為(25士 1) °C、轉(zhuǎn) 速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔3d取一次樣測定葡甘聚糖含量變化曲線，如圖2所示， 當接種量為4. 0g/100mL時，第15d時葡甘露聚糖達到最大含量。4、培養(yǎng)基初始pH對葡甘露聚糖含量的影響調(diào)節(jié)培養(yǎng)基MS+2，4-D1.0mg/ L+KTO. lmg/L+蔗糖30g/L初始pH值，設(shè)置初始pH值為5. 6,5.8,6.0,6. 24個梯度，愈傷組織 接種量為4g/100mL，在光照、溫度為25 士 1°C、轉(zhuǎn)速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，15d后測定葡 甘聚糖含量，如圖3所示，第15d，pH值為6. 0時，葡甘露聚糖含量最高達到54. 82mg/100mL。5、不同碳源對葡甘聚糖積累的影響在培養(yǎng)基MS+2，4-Dl. Omg/L+KTO. lmg/L中加 入不同碳源，分別為蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、乳糖，不同碳源的濃度為30g/L，愈傷組織接種 量為4g/100mL，在光照、溫度為(25士 1)°C、轉(zhuǎn)速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，15d后測定葡 甘聚糖含量，由圖4可知，乳糖是葡甘露聚糖積累的最適碳源，其葡甘露聚糖積累量可達 86. lmg/100mL。6、乳糖對葡甘聚糖積累的影響在培養(yǎng)基MS+2，4-D1. Omg/L KTO. lmg/L中加 入20、25、30、35g/L5種不同濃度的乳糖，愈傷組織接種量為4g/100mL，在光照、溫度為 (25士 1) °C、轉(zhuǎn)速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，15d后測定葡甘聚糖含量，由圖5可知，乳糖濃 度為25g/L時，第15d葡甘聚糖積累量最大，達到103. 89mg/100mL。7、植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對葡甘聚糖積累的影響分別調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基細胞分裂素 和生長素的濃度，細胞分裂素(KT和6-BA)設(shè)置濃度為0. 5，1. 0，1. 5,2. Omg/L ；生長素(2， 4-D和NAA)濃度為0. 5，1. 0,2. 0,4. Omg/L ；繼代量均為4g/100mL。每處理3個重復。培 養(yǎng)條件為光照、溫度為(25士 1)°C、轉(zhuǎn)速llOr/min條件下振蕩培養(yǎng)，15d后測定葡甘聚糖 含量，由表1可知，2，4-D在1. Omg/L時對葡甘露聚糖積累效果明顯，葡甘露聚糖含量達到 76. 34mg/100mL ；細胞分裂素6-BA使葡甘露聚糖積累明顯高于KT，且6-BA在1. 5mg/L時 葡甘露聚糖積累量最高，達到90. 69mg/100mL，故我們選擇1. Omg/L的2，4_D和1. 5mg/L的 6-BA作為液體培養(yǎng)產(chǎn)葡甘露聚糖的最適外源激素濃度。表1不同外源激素對魔芋葡甘聚糖含量的影響
權(quán)利要求
一種魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，其特征在于包括以下步驟(1)愈傷組織的誘導用水將花魔芋塊莖表面清洗干凈，經(jīng)過酒精浸泡、汞浸泡，最后用滅菌水洗滌，削去表皮并切成小塊，將消毒好的魔芋塊莖切塊移入愈傷誘導養(yǎng)基中，控制愈傷誘導養(yǎng)基的pH為6.0，置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)后將膨大的組織再次切成小塊，移入新配置的愈傷誘導培養(yǎng)基進一步進行培養(yǎng)；(2)細胞液體培養(yǎng)將經(jīng)過愈傷誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)的生長旺盛的愈傷組織切碎，接種在盛有液體培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)，得到培養(yǎng)液；(3)葡甘聚糖制取將培養(yǎng)液離心處理，上清液在攪拌狀態(tài)下加入乙醇，使培養(yǎng)液使含醇量50％，放置24h后，再次離心處理，得到得沉淀物，用50％乙醇處理數(shù)次，沉淀物冷凍干燥得白色物質(zhì)，即葡甘露聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，其特征在于步驟(1) 中的愈傷誘導培養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg NAA、1. Omg 6-BA和25g乳糖混合而 成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，其特征在于步驟(2) 中的液體培養(yǎng)基是在1升MS培養(yǎng)液中加入1. Omg 2，4-D，0. ImgKT和25g乳糖混合而成，控 制PH值為6.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，其特征在于步驟(1) 置于暗培養(yǎng)室中培養(yǎng)是指在26°C的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間2個月。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魔芋細胞液體培養(yǎng)葡甘聚糖的方法，其特征在于接種在盛 有液體培養(yǎng)基的容器中培養(yǎng)條件是在光照、溫度為25士 rC、110r/min的搖床條件下振蕩培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用液體培養(yǎng)法產(chǎn)葡甘聚糖的方法，對影響魔芋細胞液體培養(yǎng)產(chǎn)次生代謝物葡甘聚糖產(chǎn)生的幾種主要因子進行了研究，結(jié)果表明，在魔芋細胞液體培養(yǎng)生產(chǎn)葡甘聚糖的過程中，MS培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基，第15天左右葡甘聚糖的含量達到最大值，pH為6.0時利于葡甘聚糖的合成，25g/L的乳糖為最適碳源，2，4-D在1.0mg/L時葡甘聚糖的積累效果明顯，其它濃度的2，4-D和NAA對葡甘聚糖積累效果不明顯，細胞分裂素6-BA使葡甘聚糖積累明顯高于KT，且1.5mg/L時葡甘聚糖積累量最高。最后得到MS+2，4-D(1.0mg/L)+6-BA(1.5mg/L)+乳糖(25mg/L)為魔芋細胞培養(yǎng)生產(chǎn)葡甘聚糖的較優(yōu)培養(yǎng)基，其最高葡甘聚糖積累量可達125.70mg/100mL。
文檔編號A61P3/04GK101885784SQ201010231540
公開日2010年11月17日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者樂超銀, 梁宏偉, 梁薇, 王健, 王玉兵, 郭政宏, 陳發(fā)菊 申請人:三峽大學