專利名稱：一種從藥用植物中提取純化球松素的方法及其藥物制劑與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從藥用植物中提取純化球松素的方法及 其藥物制劑與其在制備治療胃腸病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃腸病是當(dāng)今世界的常見(jiàn)、多發(fā)疾病，嚴(yán)重危害人類的身體健康。近年來(lái)，隨著人 類生活水平的不斷提高，飲食不規(guī)律、免疫功能紊亂、幽門螺旋桿菌感染以及有害物質(zhì)的攝 入等導(dǎo)致胃脹、胃酸、急慢性胃炎、消化道潰瘍甚至胃癌等多種胃腸病，嚴(yán)重影響人類的健 康生活。目前，臨床治療胃腸病主要采用中藥制劑和化學(xué)合成藥物，這兩類藥物，前者用藥 量大，臨床作用緩慢，后者毒副作用較大，因此，低毒、高效的天然藥物開(kāi)發(fā)具有廣闊的市場(chǎng) 前景。胡桃科植物山核桃ijOaryaacthayensis)，在我國(guó)主要分布在浙江、安徽交界的天 目山區(qū)，產(chǎn)量大。山核桃的肉質(zhì)果皮是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，稱作青龍衣，具有治療胃痛、胃潰瘍、 皮膚病、子宮脫落等作用(杜旭等，1996);山檀(Zi/^arere/yexaHemsl.)為樟科山胡椒屬植 物的地下根，在我國(guó)長(zhǎng)江以南廣泛分布，主治胃脘脹痛、胃寒疼痛、噯氣吞酸及消化性潰瘍 等癥(張君增等，1994)；鐮形棘豆ijJxytropisfalcatabunge)為豆科棘豆屬植物，在藏藥中 被稱作草藥之王，我國(guó)東北、西北及西南地區(qū)廣泛分布。鐮形棘豆全草入藥，可治療急性、慢 性炎癥、高熱、潰瘍(姚淑英等，2008 ；王棟等，2008)等；木豆葉來(lái)源于豆科木豆屬植物木豆 \Cajan scajan (L. )Millsp.]，在我國(guó)長(zhǎng)江以南的廣大地區(qū)均有種植，資源豐富。木豆葉可 用于治療燒傷、感染、潰瘍、褥瘡、感冒、痢疾、皮膚病、肝炎、和抗菌消炎等(劉中秋等，1998; Millikenff.，1997 ；孫紹美等，1995)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，上述幾種藥用植物中共有的主要化學(xué)成分之一——球松素，屬 于黃酮類化合物，具有抗幽門螺旋桿菌、抗病毒、止痛、抗腫瘤等多方面的顯著生理活性(潘 永峰等，2005 ；Bhamarapravatietal, 2006 ；閆海燕，2008)。雖然已有專利(CN1666745A)和 (申請(qǐng)?zhí)?007101445360)報(bào)道了球松素提取純化方法，但存在操作繁瑣、毒性溶劑使用多 等特點(diǎn)，并且未見(jiàn)用球松素制劑治療胃腸病方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種從藥用植物中提取純化球松素的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供球松素用于制備治療胃腸病藥物的新應(yīng)用，具體是治 療幽門螺旋桿菌感染、消化性饋瘍、胃炎、胃疼、胃排空(即胃脹)和消化道腫瘤等胃腸病。本發(fā)明的藥用植物包括新鮮或干燥的山核桃肉質(zhì)果皮、山檀根、鐮形棘豆全草和 木豆葉，本發(fā)明的目的通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)
(1)取干燥藥用植物材料，切碎，加入4-6倍量蒸餾水，浸泡4-24小時(shí)，或者取新鮮的藥 用植物材料，切段；(2)上述材料加入10-20倍量濃度為70-95%的乙醇，勻漿提取1_10分鐘，過(guò)濾，濾渣重復(fù)提取1-3次，合并提取液，濃縮至相對(duì)密度1. 10-1. 25，靜止沉淀，去除上清液，得到沉淀 物；
(3)上述沉淀物用極性溶劑溶解后，以相應(yīng)極性溶劑為流動(dòng)相經(jīng)過(guò)1-4次凝膠樹(shù)脂柱 層析分離，再經(jīng)過(guò)結(jié)晶和重結(jié)晶得到純度大于90%球松素單體；
(4)將上述球松素單體加入相應(yīng)的賦形劑，制備成任何一種藥劑學(xué)能夠接受的口服劑型。本發(fā)明步驟(2)所述的球松素提取方法為勻漿提取，所用溶劑為濃度為70-95%的 乙醇，提取時(shí)間為1-10分鐘。本發(fā)明步驟(3)所述的凝膠樹(shù)脂包括聚苯乙烯型或甲基丙烯酸酯型MCI-GELCHP 系列凝膠樹(shù)脂或者HW-40、HW-50和HW-55型凝膠樹(shù)脂，其用量為沉淀物質(zhì)量的10-40倍；所 述的用于溶解沉淀物的極性溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮和乙腈中的任意一種或者幾種以任 意比例混合。本發(fā)明步驟(4)所述的賦形劑為藥劑學(xué)的一種或數(shù)種賦形劑的組合，所述口服劑 型為膠囊劑、顆粒劑、丸劑、口服液、片劑。本發(fā)明通過(guò)體外抗幽門螺旋桿菌試驗(yàn)，觀察該藥物對(duì)幽門螺旋桿菌的殺菌效果。 研究結(jié)果證明球松素能夠在較低濃度下直接殺死幽門螺旋桿菌，對(duì)幽門螺旋桿菌感染及 其引起的胃炎、消化道潰瘍具有顯著的治療作用。主要藥效學(xué)研究結(jié)果表明，球松素具有預(yù) 防和治療幽門螺旋桿菌感染引起的胃腸病的新應(yīng)用，對(duì)人胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用， 可用于制備抗幽門螺旋桿菌感染、治療消化性潰瘍、胃炎、胃疼、胃排空(即胃脹)和消化道 腫瘤等胃腸病的藥物。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
1.本發(fā)明以新鮮或者干燥藥用植物為原料，資源利用高效、合理；提取和純化操作 簡(jiǎn)單、易于大規(guī)模生產(chǎn)；
2.本發(fā)明中的球松素單體為具有較強(qiáng)生物活性的天然黃酮類，具有安全低毒、能 夠克服原發(fā)耐藥性、不易產(chǎn)生繼發(fā)耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。


圖1藥用植物中球松素的結(jié)構(gòu)式
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，需要指出的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于 說(shuō)明本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明。依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡(jiǎn)單改進(jìn)均屬于本發(fā) 明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1.山核桃肉質(zhì)果皮中球松素提取物的制備
取新鮮山核桃肉質(zhì)果皮，置于勻漿提取器中，加入10倍量的濃度為90%的乙醇，高速勻 漿2次，每次lmin，提取液過(guò)濾，合并過(guò)濾液，減壓濃縮回收乙醇(60°C，0. 09Mpa)至提取液 相對(duì)密度1. 12，靜止放置20min，除去上清液，得到沉淀物為球松素的提取物。實(shí)施例2.山檀根中球松素提取物的制備取干燥山檀根，去雜，切片，加入5倍量水浸泡24小時(shí)，然后將其置于組織勻漿提取器 中，加入15倍量的濃度為90%的乙醇，高速勻漿3次，每次5min，提取液過(guò)濾，合并過(guò)濾液， 減壓濃縮回收乙醇(60°C，0. 09Mpa)至提取液相對(duì)密度1. 15，靜止放置20min，除去上清液， 得到沉淀物為球松素的提取物。實(shí)施例3.鐮形棘豆全草中球松素提取物的制備
取新鮮鐮形棘豆全草，去雜，切段，置于組織勻漿提取器中，加入12倍量的濃度為80% 的乙醇，高速勻漿2次，每次2min，提取液過(guò)濾，合并過(guò)濾液，減壓濃縮回收乙醇(60°C， 0. 09Mpa)至提取液相對(duì)密度1. 10，靜止放置20min，除去上清液，得到沉淀物為球松素的提 取物。實(shí)施例4.木豆葉中球松素提取物的制備
取新鮮木豆葉，去雜，置于組織勻漿提取器中，加入15倍量的濃度為80%的乙醇，高速 勻漿2次，每次lmin，提取液過(guò)濾，合并過(guò)濾液，減壓濃縮回收乙醇(60°C，0. 09Mpa)至提取 液相對(duì)密度1. 10，靜止放置20min，除去上清液，得到沉淀物為球松素的提取物。實(shí)施例5.山檀根提取物中球松素的純化
將40克山檀根提取物用120mL無(wú)水乙醇溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)裝有600gHW-40凝 膠樹(shù)脂、徑高比為1:35的凝膠樹(shù)脂柱，以無(wú)水乙醇為流動(dòng)相，對(duì)樣品分離，經(jīng)過(guò)10個(gè)柱體積 后，得到4個(gè)柱體積的富含球松素的流份，靜止析晶得到純度92%的球松素56. Smg0實(shí)施例6.山核桃肉質(zhì)果皮中球松素的純化
將25克山核桃肉質(zhì)果皮提取物用50mL無(wú)水乙醇溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)裝有 300gMCIGel凝膠樹(shù)脂、徑高比為1 22的MCIGELCHP20型凝膠樹(shù)脂柱，以無(wú)水乙醇為流動(dòng)相， 對(duì)樣品分離得到富含球松素的流份，減壓濃縮至干后，再次經(jīng)過(guò)該MCIGELCHP20凝膠樹(shù)脂 柱，以甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)6個(gè)柱體積后，得到5個(gè)柱體積的富含球松素的流份，濃縮至1/5 流份體積后，靜止析晶得到純度為95%的球松素18. 4mg。實(shí)施例7.鐮形棘豆提取物中球松素的純化
將30克鐮形棘豆提取物用IOOmL甲醇溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)裝有300g凝膠樹(shù)脂、 徑高比為1 22的MCIGELCHP20型凝膠樹(shù)脂柱，以甲醇為流動(dòng)相，對(duì)樣品分離，經(jīng)過(guò)7個(gè)柱體 積后，得到3個(gè)柱體積的富含球松素的流份，減壓濃縮至干后，用20mL丙酮溶解，再次經(jīng)過(guò) MCIGELCHP20型凝膠樹(shù)脂柱，以丙酮為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)5個(gè)柱體積后，得到含球松素較高的流 份，體積為3個(gè)柱體積，濃縮至1/2體積后，靜止析晶得到純度為98%的球松素14. 7mg。實(shí)施例8.木豆葉提取物中球松素的純化
將15克木豆葉提取物用70mL丙酮溶解，過(guò)濾，濾液經(jīng)過(guò)裝有300gMCIGELCHP20型 凝膠樹(shù)脂、徑高比為1:25的凝膠樹(shù)脂柱，以丙酮為流動(dòng)相，對(duì)樣品分離，3個(gè)柱體積后得到 2個(gè)柱體積的富含球松素的流份，減壓濃縮至1/3流份體積后，靜止析晶并重結(jié)晶得到純度 為96%球松素26. 4mg。實(shí)施例9.球松素的體外抗幽門螺旋桿菌分析
用微量肉湯百分比濃度稀釋法測(cè)定球松素對(duì)幽門螺旋桿菌的最小殺菌濃度(MBC)。藥 品以5mg/mL的濃度作為原液，菌液初始密度約為108CFU/mL，稀釋后密度為107CFU/mL。取 無(wú)菌試管分別加入不同體積的肉湯培養(yǎng)液和5mg/mL的藥品溶液，使總體積為lmL，每管中 加入濃度為107CFU/mL的菌液，在微需氧條件下，37°C培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察各個(gè)試管菌生長(zhǎng)及液體混濁情況，然后從各個(gè)試管中取出液體50 yL，接種于固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)48小 時(shí)后，以無(wú)菌落出現(xiàn)的最低濃度為最小殺菌濃度。試驗(yàn)結(jié)果表明本藥物的最小殺菌濃度為 0.5mg/mL。實(shí)施例10.球松素對(duì)人胃癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性試驗(yàn)
用含10%小牛血清的RPM11640培養(yǎng)液對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901、于37 °C、5%C02培養(yǎng)箱中 貼壁培養(yǎng)至細(xì)胞生長(zhǎng)80%融合時(shí)，0. 25%胰蛋白酶消化傳代。然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S0C-7901 細(xì)胞，制成細(xì)胞濃度為1 X 105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加細(xì)胞懸液 100 y L (相當(dāng)于1 X 104個(gè))，以單純的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，繼續(xù)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中貼 壁培養(yǎng)24小時(shí)，分別加入球松素的最終濃度為0. 25,0. 5,1. 0,2. 0,4. 0,8. OUO. Omg/mL的 培養(yǎng)液，以未加藥的培養(yǎng)液為陰性對(duì)照，每組重復(fù)3次，分別培養(yǎng)24，48，72小時(shí)后，加入 0. 5%MTT20 u L，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸除孔內(nèi)液體，加二甲基亞礬200 u L，震蕩10分鐘，用酶標(biāo) 儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，計(jì)算抑制率，如表1所示。結(jié)果表明球松素對(duì)人胃癌細(xì)胞 具有很強(qiáng)的抑制作用，并且其作用效果隨著用藥量和時(shí)間的增加而增強(qiáng)，即球松素對(duì)人胃 癌細(xì)胞的抑制作用呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。表1球松素作用對(duì)人胃癌細(xì)胞SGC-7901的抑制率(％) 實(shí)施例11.球松素的急性毒性試驗(yàn)
雌雄各半小鼠30只，體重20-23g，隨機(jī)分成2組，每組15只，設(shè)定藥品組和水對(duì)照組， 試驗(yàn)前對(duì)小鼠禁食不禁水12小時(shí)，按照最大體積0. 04mL/g(320mg/kg)的最大灌胃量灌胃， 每天一次，連續(xù)7天，監(jiān)測(cè)小鼠體征與死亡狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7天后兩組小鼠外觀、飲食、 活動(dòng)均正常，無(wú)差異、無(wú)死亡發(fā)生。于末次給藥12小時(shí)后，處死小鼠進(jìn)行系統(tǒng)解剖，觀察兩 組組小鼠主要臟器，包括腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、大腸、睪丸和卵巢等，結(jié)果表明其外 形、重量正常，兩組無(wú)明顯差異，各器官組織切面未見(jiàn)異常，說(shuō)明在最大給藥量的條件下該 藥物安全無(wú)毒。
權(quán)利要求
一種從藥用植物中提取純化球松素的方法及其在制備治療胃腸病的藥物制劑與應(yīng)用，其特征在于它是以新鮮或干燥的藥用植物為原料，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)取干燥藥用植物材料，切碎，加入4-6倍量水浸泡4-24小時(shí)，或者取新鮮的藥用植物材料，切段；(2)上述材料加入10-20倍量濃度為70-95%的乙醇勻漿提取1-10分鐘，過(guò)濾，濾渣重復(fù)勻漿提取1-3次，合并提取液，濃縮至相對(duì)密度1.10-1.25，靜止沉淀，去除上清液，得到沉淀物；(3)上述沉淀物樣品用極性溶劑溶解后，以相應(yīng)極性溶劑為流動(dòng)相經(jīng)過(guò)1-4次凝膠樹(shù)脂柱層析分離，再經(jīng)過(guò)結(jié)晶和重結(jié)晶得到高純度球松素；(4)將上述的球松素加入相應(yīng)的賦形劑制備成任何一種藥劑學(xué)能夠接受的口服劑型。
2.如權(quán)利要求1所述的從藥用植物中提取純化球松素的方法及其藥物制劑，其特征在 于所用原料為新鮮或者干燥的藥用植物材料，所述藥用植物材料包括山核桃肉質(zhì)果皮、山 檀全株、鐮形棘豆全草和木豆全株。
3.如權(quán)利要求1所述的從藥用植物中提取純化球松素的方法及其藥物制劑，其特征在 于步驟(2)所述的球松素提取方法為勻漿提取，所用溶劑為濃度為70-95%的乙醇，提取時(shí) 間為1-10分鐘。
4.如權(quán)利要求1所述的從藥用植物中提取純化球松素的方法及其藥物制劑，其特征在 于步驟(3)所述的凝膠樹(shù)脂包括聚苯乙烯型或甲基丙烯酸酯型MCI-GELCHP系列凝膠樹(shù)脂 或者HW-40、HW-50和HW-55型凝膠樹(shù)脂，其用量為沉淀物樣品質(zhì)量的10-40倍；所述的用于 溶解和分離沉淀物樣品的極性溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮和乙腈中的任意一種或者幾種以 任意比例混合。
5.如權(quán)利要求1所述的從藥用植物中提取純化球松素的方法及其藥物制劑，其特征在 于步驟(4)所述的賦形劑為藥劑學(xué)的一種或數(shù)種賦形劑的組合；所述口服劑型為膠囊劑、 顆粒劑、丸劑、口服液、片劑。
6.如權(quán)利要求1或5所述的藥物制劑在制備治療抗幽門螺旋桿菌藥物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求1或5所述的藥物制劑在制備治療消化道潰瘍藥物中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1或5所述的藥物制劑在制備治療急性、慢性胃炎藥物中的應(yīng)用。
9.如權(quán)利要求1或5所述的藥物制劑在制備治療消化道腫瘤藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種稱為球松素的天然生物活性物質(zhì)的提取純化方法及其藥物制劑與應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明公開(kāi)了一種從藥用植物中提取和純化球松素的方法及其藥物制劑和在制備治療胃腸病藥物中的應(yīng)用，屬于生命科學(xué)領(lǐng)域。該方法將藥用植物用濃度為70-95%的乙醇勻漿提取，提取液濃縮至一定體積后，靜止沉淀，去除上清液，得到的沉淀物用有機(jī)溶劑溶解，采用凝膠樹(shù)脂柱層析分離，再經(jīng)過(guò)結(jié)晶和重結(jié)晶得到純度大于90%的球松素單體。本發(fā)明制備的球松素單體加入不同的賦形劑后可以制備成任何一種常用的藥劑學(xué)劑型，對(duì)幽門螺旋桿菌感染引起的消化性潰瘍、胃炎、胃疼、胃排空(即胃脹)和消化道腫瘤等方面具有明顯的生理活性，并且具有無(wú)毒副作用的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101875648SQ201010224549
公開(kāi)日2010年11月3日 申請(qǐng)日期2010年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月12日
發(fā)明者馬靈媛 申請(qǐng)人:馬靈媛