專利名稱：含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物及其 制備方法和應用。它是負載生物成像功能轉(zhuǎn)基因載體的膠原基復合角膜替代物及其制備方 法，將組織工程與基因轉(zhuǎn)染用于治療眼科相關疾病。
背景技術：
角膜病作為一種高發(fā)病率的致盲性眼病，已經(jīng)越來越受到人們的重視。由于角膜 的內(nèi)皮細胞不能自動修復或替代，同種異體角膜移植術便成為了治療角膜疾病的最有效方 法，但是同種異體角膜移植導致了對供體角膜的極大需求，而且存在著不健康的供體角膜 傳播疾病的隱患，此外，術后免疫排斥反應的發(fā)病率仍較高，鑒于此，開發(fā)替代同種異體角 膜移植的方法顯得刻不容緩。1859年，Heusser首次將一片玻璃植入病人眼內(nèi)，開辟了人工角膜移植的先 河。 此 后，Boston Keratoprostheses> AlphaCor Keratoprostheses、Seoul type Keratoprostheses禾口 Stanford Keratoprostheses等各種人工角膜成功被應用于臨床試 驗，但早期的這些材料均為合成材料，較差的生物相容性不利于細胞的粘附、增殖，并不能 完全替代角膜組織。伴隨著組織工程角膜的興起，具有良好生物相容性、可降解性的生物材 料備受國內(nèi)外研究者的青睞。I型膠原占角膜干重的75%，作為天然細胞外基質(zhì)(ECM)的 成分被廣泛用于組織工程領域，膠原支架所提供的細胞生長代謝環(huán)境接近于生理狀態(tài)，被 加工成多孔海綿或能包覆細胞的水凝膠，是非常理想的組織工程角膜支架材料。然而，非交 聯(lián)的膠原存在力學強度差、易降解的缺點，嚴重制約了其應用。1999年加拿大渥太華大學的 Griffith等用戊二醛交聯(lián)膠原與硫酸軟骨素復合構(gòu)建了形態(tài)、組織學結(jié)構(gòu)和透明度與正常 角膜相似的角膜替代物。又用膠原與糖胺聚糖制成凝膠，體外重建可縫合的全層人工角膜， 獲得了較為理想的機械強度，植入兔眼未引起炎癥及免疫反應。近幾年，Griffith研究組成 功用交聯(lián)劑碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)制備了多種膠原基角膜替代物。碳 二亞胺作為零長度的交聯(lián)劑，最后可被脫除，故產(chǎn)物無任何毒性異物。目前已成功用于兔、 豬的深板層移植，術后一年顯示上皮細胞的重建，伴隨基質(zhì)細胞的長入，且觀察到角膜神經(jīng) 的再生。但對于圓錐形角膜、酸堿燒傷角膜、糖尿病性角膜等金屬基質(zhì)蛋白酶或膠原酶分泌 過高的情況，單純EDC和NHS交聯(lián)的膠原角膜替代物降解會更快，無法完成最終的修復目 的。在此基礎上，Liu等[Liu W,Deng C,McLaughlin CR, et al. Collagen-phosphorylcholi neinterpenetrating network hydrogels as corneal substitutes. Biomaterials. 2009, 30(8) 1551-1559]將EDC和NHS交聯(lián)的膠原與聚乙二醇雙甲基丙烯酸酯(PEGDA)交聯(lián)的 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿(MPC)形成互穿聚合物網(wǎng)絡(IPN)凝膠，MPC網(wǎng)絡的引入 明顯提高了 IPN凝膠在膠原酶中的穩(wěn)定性。一年以上的小型豬角膜移植同樣顯示滿意的修 復效果。但由于MPC極易吸潮，且容易水解，我們研究組使用磺酸型兩性電解質(zhì)3-(甲基丙 烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)替代MPC，構(gòu)建了膠原和MPDSAH互穿聚合物網(wǎng)絡角膜替代物，以改進MPC易吸潮水解的不足，其生物相容性良好，與MPC相同都具有抑 制非特異性蛋白吸附的性能，但結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較MPC穩(wěn)定。對于角膜替代物，移植后原位跟蹤其降解程度是十分必要，由此可指導設計適宜 降解時間的替代物以滿足角膜細胞、神經(jīng)再生。但上述的角膜替代物均缺少原位跟蹤降解 功能，而標記有機熒光染料難以獲得穩(wěn)定的熒光。量子點(Quantum Dot)又稱半導體納米微晶體，是近年來研究越來越多的新興納 米材料，優(yōu)良的隨尺寸變化的性質(zhì)，使其無論在基礎研究還是實際應用方面都表現(xiàn)出了重 要的價值，特別是獨特的光學性能和光化學穩(wěn)定性，使其作為理想的熒光探針材料，廣泛被 應用于生命科學等領域。目前應用范圍最廣、制備最為成熟的是CdX(X = S、Se、Te)量子點， 但極大的生物毒性嚴重制約了其在基因治療領域的應用。作為替代物，安全無毒、生物友好 的氧化鋅量子點越來越受到人們的重視。量子點/聚合物復合材料作為兼顧量子點和聚合 物各自優(yōu)勢的一種材料，表現(xiàn)出了廣泛的應用前景，目前制備方法主要有原位生成法、原位 聚合法、溶膠-凝膠法等。基于以上原因，我們成功制備了聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸 乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹的氧化鋅量子點，提供了一種具有熒光示蹤能力，并能夠有效 復合DNA進行基因轉(zhuǎn)染載體的制備方法，隨后采用凝膠后包裹技術，通過將氧化鋅量子點 與質(zhì)粒DNA的復合物負載到角膜替代物中，此復合角膜替代物不僅具有基因遞送功能，而 且通過光學方法實現(xiàn)對于DNA運輸過程的跟蹤。此方法可拓展為ZnO量子點復合內(nèi)皮抑制 素基因達到原位示蹤降解和基因釋放抑制角膜移植的新生血管目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜 替代物及其制備方法和應用。該角膜替代物具備良好的力學性能、光學性能，在膠原酶中降 解緩慢，且與人眼組織有良好的生物相容性。通過負載量子點載體與質(zhì)粒DNA的復合物，可 將組織工程與基因轉(zhuǎn)染用于眼科，并示蹤DNA的運輸過程，制備方法簡單，可以長期保存和 運輸。本發(fā)明提供的一種含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物是 膠原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子點載體/DNA復合物制備而成，所述角膜替代物 與ZnO量子點載體/DNA復合物重量比約425 1，ZnO量子點載體與DNA的重量比25 1。所述的膠原/MPDSAH IPN角膜替代物主要是以膠原、3_ (甲基丙烯酰胺)丙基-二 甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH)為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑對膠原進行 交聯(lián)，聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)(平均分子量為575)為交聯(lián)劑，對MPDSAH進行交聯(lián)，以 2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮(Irgacure 2959)為光引發(fā)劑進行反應，反應產(chǎn) 物經(jīng)過澆注成膜制備成互穿聚合物網(wǎng)絡角膜替代物。其組成和配比EDC與膠原(以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2)的摩爾比為1 1 ；EDC 與NHS的摩爾比為1 1 ；MPDSAH與PEGDA的質(zhì)量比為2 1 ；光引發(fā)劑Irgacure2959與 MPDSAH的摩爾比為0. 02 1。所用膠原是豬I型膠原，量子點是聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙 烯酸鹽包裹的氧化鋅量子點，結(jié)構(gòu)如下聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽
單體N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯與甲基丙烯酸鋅兩單體的共聚摩爾比為 1-30 1。本發(fā)明提供的含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物是膠原 /MPDSAH IPN角膜替代物的制備方法包括以下步驟1)將膠原溶于水配成質(zhì)量分數(shù)為13. 7%的溶液，于4°C 5000r/min離心去除氣 泡，按計量在冰水浴中與MPDSAH水溶液、EDC和NHS等物質(zhì)的量混合的水溶液與引發(fā)劑 Irgacure 2959的無水乙醇溶液均勻混合反應，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5. 5 ；2)將混合反應溶液澆注到模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化 40min，取出后保持濕度100%的條件下，室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h ；3)去除夾具，打開模具取出角膜樣品放入PH = 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸 泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有氯仿的pH = 7. 4的PBS中， 于4°C下保存?zhèn)溆茫?)將上述復合角膜替代物-50°C冷凍干燥48h，后浸入在ZnO量子點載體/DNA復 合物溶液中，吸附24h，保證角膜完全恢復形變并對復合物達到了平衡吸附；5)將制品再次進行冷凍干燥48h，可使角膜替代物達到長期保存和運輸?shù)哪康?。本發(fā)明所述的膠原是豬I型膠原，ZnO量子點的粒徑約3. 6nm, ZnO量子點的濃度 5mg/ml，DNA的濃度0. 5mg/ml，角膜替代物與ZnO量子點載體/DNA復合物重量比約425 1， ZnO量子點載體與DNA的重量比25 1 ；角膜替代物厚500-600 μ m，直徑11. 5_12mm。本發(fā)明的復合角膜替代物用于制造治療眼科相關疾病的藥物，并可示蹤替代物的 降解和特定基因的原位釋放。本發(fā)明的復合角膜替代物與現(xiàn)有的產(chǎn)品和技術相比具有如下的優(yōu)點膠原基角膜替代物具有良好的生物相容性，可誘導和促進角膜再生，并隨角膜再 生而生物降解；該角膜替代物具有與人角膜相似的力學性能、光學性能，MPDSAH聚合物網(wǎng) 絡的引入明顯提高了角膜替代物在膠原酶中的穩(wěn)定性及力學強度；所用的氧化鋅量子點能 夠有效復合壓縮DNA，成功將DNA導入細胞并使其成功表達，在轉(zhuǎn)基因過程中能夠通過熒光 作用隨時跟蹤DNA/載體的位置并確定其胞內(nèi)分布；該角膜替代物將基因轉(zhuǎn)染、組織工程、 熒光示蹤有效結(jié)合，制作方法簡單，易于加工處理和長期保存及運輸。


圖1為角膜替代物在可見光下的光學顯微照片。圖2為未吸附量子點的角膜替代物在紫外燈下的光學顯微照片。
圖3為collagen角膜替代物吸附量子點后在紫外燈下的光學顯微照片。圖4為IPm-0. 3角膜替代物吸附量子點后在紫外燈下的光學顯微照片。圖5為IPm-I角膜替代物吸附量子點后在紫外燈下的光學顯微照片。圖6為IPm-2角膜替代物吸附量子點后在紫外燈下的光學顯微照片。
具體實施方式

ZnO量子點的制備方法參照文獻[Zhang P，Liu WG. ZnO QDi PMAA-co-PDMAEMAnonviral vector for plasmid DNA delivery and bioimaging. Biomaterials. 2010,31(11) :3087_3094]，通過在甲基丙烯酸鋅(Zn (MAA) 2)與甲基丙烯酸 二甲氨基乙酯(DMAEMA)的無規(guī)共聚過程中加入氫氧化鋰水解的方法制得了具有優(yōu)良水溶 性，在紫外激發(fā)下具有較強黃綠色熒光的ZnO量子點。實施例1 膠原角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH (質(zhì)量比) 1 0Coll-NH2 EDC NHS (摩爾比) 1:1:1(1)交聯(lián)膠原角膜替代物的制備取0. 5g 13. 7%的豬皮I型膠原溶液到注射器 內(nèi)，并通過T型容器連接另一注射器密封，反復推拉混均，然后用微量注射器按計量注入交 聯(lián)劑EDC和NHS，其中Coll-NH2 EDC NHS = 1 1 1 (摩爾比)，反復推拉混均，然后 用微量注射器加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在5. 5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌?模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，100%濕度，室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。 去除夾具，打開模具取出角膜樣品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 4)中浸泡，每隔 12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有氯仿的PBS溶液中，于4°C下保存?zhèn)?用。制得的角膜替代物厚500-600 μ m，直徑11. 5_12mm，與人角膜具有相同曲率。(2)負載ZnO量子點載體的角膜替代物的制備及體外轉(zhuǎn)染按以上步驟制備片狀 角膜替代物樣品，并切割成48孔板大小圓片，冷凍干燥48h后使其暴露在紫外燈下光照24h 滅菌。將所用ZnO量子點載體配成濃度為5mg/ml的溶液，并用0. 22 μ m濾器濾菌，與0. 5mg/ ml pGL3質(zhì)粒DNA溶液等體積復合30min，復合比25 1 (w/w) 0將滅菌充分的凍干樣品浸 入到每孔500 μ L復合物溶液的48孔板中靜置24h，待樣品完全恢復形變并對復合物達到了 平衡吸附后將生長至指數(shù)生長期的RCFBF細胞懸液加入到凝膠中，轉(zhuǎn)染24h后換掖，繼續(xù)培 養(yǎng)24小時。裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為18861. OlRLU/mgprotein。取片狀角膜替代物樣品進行力學性能、光學性能測試，此角膜替代物樣品命名為 Collagen，其中進行力學性能測試的角膜替代物樣品的尺寸為20mmX3mm，厚為500 μ m。實施例2 膠原/MPDSAH復合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH (質(zhì)量比) 1 0. 3Coll-NH2 EDC NHS (摩爾比)1:1:1MPDSAH PEGDA (質(zhì)量比)2 1Irgacure2959 MPDSAH (摩爾比) 0. 02 1用上述各組分制備本生物活性復合角膜替代物的步驟如下
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(1)復合角膜替代物的制備取0.5g 13. 7%的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)，并 通過T型容器連接另一注射器密封，反復推拉混均；按計量為豬皮I型膠原MPDSAH = 1 0.3(質(zhì)量比)的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復 推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure 2959， 其中 Coll-NH2 EDC NHS = 1 1 1 (摩爾比)，引發(fā)劑 Irgacure 2959 MPDSAH =0.02 1(摩爾比)，反復推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在 5. 5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化 40min，取出后室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具取出角膜樣 品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天 后，將樣品放入含有氯仿的PBS溶液中，于4°C下保存?zhèn)溆谩Ｖ频玫膹秃辖悄ぬ娲锖?500-600 μ m，直徑11. 5_12mm，與人角膜具有相同曲率。(2)負載ZnO量子點載體的角膜替代物的制備及體外轉(zhuǎn)染按以上步驟制備片狀 角膜替代物樣品，并切割成48孔板大小圓片，冷凍干燥48h后使其暴露在紫外燈下光照24h 滅菌。將所用ZnO量子點載體配成濃度為5mg/ml的溶液，并用0. 22 μ m濾器濾菌，與0. 5mg/ ml pGL3質(zhì)粒DNA溶液等體積復合30min，復合比25 1 (w/w) 0將滅菌充分的凍干樣品浸 入到每孔500 μ L復合物溶液的48孔板中靜置24h，待樣品完全恢復形變并對復合物達到了 平衡吸附后將生長至指數(shù)生長期的RCFBF細胞懸液加入到凝膠中，轉(zhuǎn)染24h后換掖，繼續(xù)培 養(yǎng)24小時。裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為25957. 29RLU/mgpr0tein。取片狀角膜替代物樣品進行力學性能、光學性能測試，此角膜替代物樣品命名為 IPN1-0. 3，其中進行力學性能測試的角膜替代物樣品的尺寸為20mmX3mm，厚為500 μ m。實施例3 膠原/MPDSAH復合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH (質(zhì)量比) 1 1Coll-NH2 EDC NHS(摩爾比)1:1:1MPDSAH PEGDA (質(zhì)量比)2 1Irgacure2959 MPDSAH (摩爾比) 0. 02 1用上述各組分制備本生物活性復合角膜替代物的步驟如下(1)復合角膜替代物的制備取0.5g 13. 7%的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)， 并通過T型容器連接另一注射器密封，反復推拉混均；按計量為豬皮I型膠原MPDSAH =1 1(質(zhì)量比)的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復 推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure 2959， 其中 Coll-NH2 EDC NHS = 1 1 1 (摩爾比)，引發(fā)劑 Irgacure 2959 MPDSAH =0.02 1(摩爾比)，反復推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在 5. 5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化 40min，取出后室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具取出角膜樣 品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天 后，將樣品放入含有氯仿的PBS溶液中，于4°C下保存?zhèn)溆?。制得的復合角膜替代物?500-600 μ m，直徑11. 5_12mm，與人角膜具有相同曲率。(2)負載ZnO量子點載體的角膜替代物的制備及體外轉(zhuǎn)染按以上步驟制備片狀角膜替代物樣品，并切割成48孔板大小圓片，冷凍干燥48h后使其暴露在紫外燈下光照24h 滅菌。將所用ZnO量子點載體配成濃度為5mg/ml的溶液，并用0. 22 μ m濾器濾菌，與0. 5mg/ ml pGL3質(zhì)粒DNA溶液等體積復合30min，復合比25 1 (w/w) 0將滅菌充分的凍干樣品浸 入到每孔500 μ L復合物溶液的48孔板中靜置24h，待樣品完全恢復形變并對復合物達到了 平衡吸附后將生長至指數(shù)生長期的RCFBF細胞懸液加入到凝膠中，轉(zhuǎn)染24h后換掖，繼續(xù)培 養(yǎng)24小時。裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為27981. 23RLU/mgpr0tein。取片狀角膜替代物樣品進行力學性能、光學性能測試，此角膜替代物樣品命名為 IPm-1，其中進行力學性能測試的角膜替代物樣品的尺寸為20mmX3mm，厚為500 μ m。實施例4 膠原/MPDSAH復合角膜替代物各組分比例如下豬皮I型膠原MPDSAH (質(zhì)量比) 1 2Coll-NH2 EDC NHS(摩爾比)1:1:1MPDSAH PEGDA (質(zhì)量比)2 1Irgacure2959 MPDSAH (摩爾比) 0. 02 1用上述各組分制備本生物活性復合角膜替代物的步驟如下(1)復合角膜替代物的制備取0.5g 13. 7%的豬皮I型膠原溶液到注射器內(nèi)， 并通過T型容器連接另一注射器密封，反復推拉混均；按計量為豬皮I型膠原MPDSAH =1 2(質(zhì)量比)的MPDSAH溶于水中，用微量注射器通過密封墊移入T型容器內(nèi)，反復 推拉混合均勻，然后用微量注射器依次注入交聯(lián)劑EDC、NHS和光引發(fā)劑Irgacure 2959， 其中 Coll-NH2 EDC NHS = 1 1 1 (摩爾比)，引發(fā)劑 Irgacure 2959 MPDSAH =0.02 1(摩爾比)，反復推拉混合均勻，然后加入適量2mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在 5. 5左右?；旌暇鶆蚝髮⑷芤簼沧⒌侥＞邇?nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化 40min，取出后室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h。去除夾具，打開模具取出角膜樣 品，放入20ml磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 4)中浸泡，每隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天 后，將樣品放入含有氯仿的PBS溶液中，于4°C下保存?zhèn)溆谩Ｖ频玫膹秃辖悄ぬ娲锖?500-600 μ m，直徑11. 5_12mm，與人角膜具有相同曲率。(2)負載ZnO量子點載體的角膜替代物的制備及體外轉(zhuǎn)染按以上步驟制備片狀 角膜替代物樣品，并切割成48孔板大小圓片，冷凍干燥48h后使其暴露在紫外燈下光照24h 滅菌。將所用ZnO量子點載體配成濃度為5mg/ml的溶液，并用0. 22 μ m濾器濾菌，與0. 5mg/ ml pGL3質(zhì)粒DNA溶液等體積復合30min，復合比25 1 (w/w) 0將滅菌充分的凍干樣品浸 入到每孔500 μ L復合物溶液的48孔板中靜置24h，待樣品完全恢復形變并對復合物達到了 平衡吸附后將生長至指數(shù)生長期的RCFBF細胞懸液加入到凝膠中，轉(zhuǎn)染24h后換掖，繼續(xù)培 養(yǎng)24小時。裂解細胞，測定其中的熒光素酶活性為22128RLU/mg protein。取片狀角膜替代物樣品進行力學性能、光學性能測試，此角膜替代物樣品命名為 IPm-2，其中進行力學性能測試的角膜替代物樣品的尺寸為20mmX3mm，厚為500 μ m。實施例1至實施例4制備的角膜替代物性能指標參數(shù)如表1、表2所示表1角膜替代物光學性能參數(shù) 表2角膜替代物力學性能參數(shù)
權利要求
一種含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物，其特征在于它是膠原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子點載體/DNA復合物制備而成。
2.根據(jù)權利要求1所述的膠原基復合角膜替代物，其特征在于所述角膜替代物與ZnO 量子點載體/DNA復合物重量比約425 1，ZnO量子點載體與DNA的重量比25 1。
3.根據(jù)權利要求1所述的膠原基復合角膜替代物，其特征在于所述角膜替代物厚 500-600 μ m，直徑 11. 5_12mm。
4.根據(jù)權利要求1所述的膠原基復合角膜替代物，其特征在于所述的膠原/MPDSAH IPN角膜替代物主要是以膠原、3-(甲基丙烯酰胺)丙基-二甲基(3-磺丙)胺(MPDSAH) 為原料，以水為溶劑，以碳二亞胺(EDC)為交聯(lián)劑對膠原進行交聯(lián)，聚乙二醇二丙烯酸酯 (PEGDA)(平均分子量為575)為交聯(lián)劑，對MPDSAH進行交聯(lián)，以2-羥基-4- (2-羥乙氧 基)-2_甲基苯丙酮(Irgacure 2959)為光引發(fā)劑進行反應，反應產(chǎn)物經(jīng)過澆注成膜制備成 互穿聚合物網(wǎng)絡角膜替代物；其組成和配比EDC與膠原的摩爾比為1 1，以膠原分子上氨基數(shù)目計，表示為Coll-NH2 ;EDC與NHS 的摩爾比為1 1 ；MPDSAH與PEGDA的質(zhì)量比為2 1 ；光引發(fā)劑Irgacure2959與MPDSAH 的摩爾比為0.02 1。
5.根據(jù)權利要求1所述的膠原基復合角膜替代物，其特征在于所用膠原是豬I型膠原； 量子點是聚N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯-聚甲基丙烯酸鹽包裹的氧化鋅量子點，結(jié)構(gòu) 如下聚甲基丙烯酸二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸鹽 單體N，N-二甲基胺基甲基丙烯酸乙酯與甲基丙烯酸鋅兩單體的共聚摩爾比為 1-30 1。
6. 一種權利要求1所述的膠原基復合角膜替代物的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)將膠原溶于水配成質(zhì)量分數(shù)為13.7%的溶液，于4°C5000r/min離心去除氣泡，按 計量在冰水浴中與MPDSAH水溶液、EDC和NHS等物質(zhì)的量混合的水溶液與引發(fā)劑Irgacure 2959的無水乙醇溶液均勻混合反應，用2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為5. 5 ；2)將混合反應溶液澆注到模具內(nèi)，再放入夾具中夾緊固定，于紫外固化箱中固化 40min，取出后保持濕度100%的條件下，室溫反應16h，再移入37°C的烘箱內(nèi)熟化5h ；3)去除夾具，打開模具取出角膜樣品放入PH= 7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中浸泡，每 隔12h更換新鮮的PBS，清洗7天后，將樣品放入含有1 %氯仿的pH = 7. 4的PBS中，于4°C 下保存?zhèn)溆茫?)將上述復合角膜替代物-50°C冷凍干燥48h，后浸入在ZnO量子點載體/DNA復合物溶液中，吸附24h，保證角膜完全恢復形變并對復合物達到了平衡吸附；5)將制品再次進行冷凍干燥48h，可使角膜替代物達到長期保存和運輸?shù)哪康摹?br> 7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述的膠原是豬I型膠原，ZnO量子點的粒 徑3. 6nm ；ZnO量子點的濃度5mg/ml。
8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于所述的DNA的濃度0.5mg/ml，角膜替代物 與ZnO量子點載體/DNA復合物重量比為425 1，ZnO量子點載體與DNA的重量比為25 1。
9.權利要求1所述的復合角膜替代物用于制造治療眼科相關疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有ZnO量子點載體/DNA復合物的膠原基復合角膜替代物及其制備方法和應用。它是膠原/MPDSAH IPN角膜替代物吸附ZnO量子點載體/DNA復合物制備而成。角膜替代物與ZnO量子點載體/DNA復合物重量比約425∶1，ZnO量子點載體與DNA的重量比25∶1。本發(fā)明具有良好的生物相容性，可誘導和促進角膜再生，并隨角膜再生而生物降解；并且具有與人角膜相似的力學性能、光學性能，MPDSAH聚合物網(wǎng)絡的引入明顯提高了角膜替代物在膠原酶中的穩(wěn)定性及力學強度；氧化鋅量子點能夠有效復合壓縮DNA，成功將DNA導入細胞并使其成功表達，在轉(zhuǎn)基因過程中能夠通過熒光作用隨時跟蹤DNA/載體的位置并確定其胞內(nèi)分布；本發(fā)明將基因轉(zhuǎn)染、組織工程、熒光示蹤有效結(jié)合，制作方法簡單，易于加工處理和長期保存及運輸。
文檔編號A61L27/24GK101890185SQ20101017897
公開日2010年11月24日 申請日期2010年5月21日 優(yōu)先權日2010年5月21日
發(fā)明者劉文廣, 劉貴培, 張鵬, 楊建海 申請人:天津大學