專利名稱：：抑制肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤的基因藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子藥物學(xué)、分子醫(yī)學(xué)和疾病防治領(lǐng)域，具體涉及基于重組腺相關(guān)病毒(rAAV)和腫瘤血管生成抑制基因的基因藥物，該藥物可以靶向作用于肺組織，有效地抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性支氣管肺癌(簡稱肺癌)，是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，在全世界腫瘤的發(fā)生率和患者因腫瘤死亡率的統(tǒng)計(jì)中居首位，約占癌癥病人總數(shù)的18%。目前臨床上常用的肺癌治療藥物有多種，包括紫杉堿類藥物紫杉醇(paclitaxel)，拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制藥替尼泊苷(etoposide)、鉬類化合物卡鉬(carboplatin)和多西紫杉醇(docetaxel)等用于治療非小型細(xì)胞肺癌(NSCLC)，雖有一定療效，仍然差強(qiáng)人意，最重要的不足之處乃是，這些化療藥物仍不能嚴(yán)格區(qū)分腫瘤組織和正常組織，在使用過程中，常伴發(fā)多種毒副作用，嚴(yán)重者危及生命。如果說腫瘤是攻向人身的一把利劍，腫瘤轉(zhuǎn)移則堪稱那最致命的一擊。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤轉(zhuǎn)移是90%的腫瘤病人死亡的原因，即使是在科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，腫瘤的發(fā)生、治療、診斷研究都有了長足進(jìn)步的今天，腫瘤轉(zhuǎn)移依然是癌癥治愈率無法明顯提升的最大絆腳石，肺癌也不例外。腫瘤組織每天向血液中釋放癌細(xì)胞，脫落的癌細(xì)胞隨血液或淋巴流布全身，一旦條件成熟，散落的癌細(xì)胞會像種子一樣在身體的任何組織器官種植，并迅速生長起來，破壞臟器功能，最終導(dǎo)致病人死亡。而肺部由于淋巴組織分布廣泛，血流運(yùn)行豐富，肺癌細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處病灶轉(zhuǎn)移。肺癌轉(zhuǎn)移可經(jīng)過四個(gè)途徑①直接蔓延肺癌可從支氣管發(fā)生處沿支氣管壁浸潤生長，直接向其近側(cè)或遠(yuǎn)側(cè)端擴(kuò)散，可侵至氣管隆突平面，亦可空透支氣管壁向肺實(shí)質(zhì)浸潤生長，進(jìn)一步可達(dá)縱膈及胸膜。兩層胸膜的種植性擴(kuò)散，可侵及胸壁及橫膈，或至食管和心包。②淋巴道轉(zhuǎn)移肺癌在早期就有可能發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移。一般小細(xì)胞癌比鱗癌轉(zhuǎn)移要早且多見。淋巴道轉(zhuǎn)移首先見于支氣管肺淋巴結(jié)、肺門淋巴結(jié)、氣管支氣管旁淋巴結(jié)。由此可至縱膈淋巴結(jié)(這是遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的指針)肺癌尸檢病例約有半數(shù)可見腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。③血路轉(zhuǎn)移肺癌經(jīng)血路轉(zhuǎn)移，常引起全身廣泛轉(zhuǎn)移而致死亡，總死亡率為92%。特別是未分化型肺癌如小細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌可早期發(fā)生血路轉(zhuǎn)移，而鱗癌及腺癌則較晚。④種植性轉(zhuǎn)移體腔內(nèi)器官的腫瘤蔓延至器官表面時(shí)，瘤細(xì)胞可以脫落并像播種一樣，種植在體腔和體腔內(nèi)各器官的表面，形成多數(shù)的轉(zhuǎn)移瘤。這種轉(zhuǎn)移方式稱為種植性轉(zhuǎn)移或播種，多發(fā)生于腹腔或胸腔內(nèi)器官的癌瘤。肺癌也常在胸腔內(nèi)形成廣泛的種植性轉(zhuǎn)移。值得注意的是，手術(shù)也可能造成肺癌種植轉(zhuǎn)移。惡性腫瘤在晚期多可轉(zhuǎn)移到肺部，可以是血行播散、淋巴道轉(zhuǎn)移或鄰近器官直接侵犯。肺臟是惡性腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移部位之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，死于惡性腫瘤的患者中大約20%發(fā)生肺轉(zhuǎn)移；肺轉(zhuǎn)移瘤主要來源于乳腺癌、腎癌、結(jié)腸癌、直腸癌、骨肉瘤、惡性黑色素瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤等；一旦肺部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤已屬晚期。兩側(cè)肺出現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移的病例已不可以外科治療，對僅有單個(gè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，或雖有幾個(gè)轉(zhuǎn)移灶但均屬限于一個(gè)肺葉或一側(cè)肺內(nèi)的少數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤，才考慮手術(shù)治療，所以對肺轉(zhuǎn)移瘤的治療是非常棘手的難題。在1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤新生血管生成假說，認(rèn)為“腫瘤生長依賴于血管生成，腫瘤血管生成是由于腫瘤分泌TAF(tumorangiogenesisfactor)引起”，之后逐漸建立了一系列模型對該假說進(jìn)行驗(yàn)證，并在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上奠定了整個(gè)腫瘤新生血管生成的框架。許多重要的腫瘤血管生長因子和抗腫瘤血管生長因子陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，致使針對各種血管生成調(diào)節(jié)因子的藥物研究方興未艾。在世界范圍內(nèi)約70余種抗血管生成藥物進(jìn)入臨床研究。但臨床研究結(jié)果表明，單用抗血管生成藥物對腫瘤的療效非常有限，就連Folkman研究小組發(fā)現(xiàn)的被寄予極大希望的抗血管生成因子Angiostatin和Endostatin也被FDA宣判了“死刑”。研究人員認(rèn)為其中最關(guān)鍵的原因是瘤體內(nèi)難以達(dá)到有效藥物濃度，或不能長時(shí)間維持有效藥物濃度?；蛑委熕幬铮梢詫?shí)現(xiàn)目的蛋白在人體內(nèi)的長期穩(wěn)定的表達(dá)，為解決上述問題提供了思路。國內(nèi)李雷等以重組腺病毒(rAd)為載體，進(jìn)行了Vasostatin基因治療藥物對胰腺癌生長的抑制作用研究(李雷，袁耀宗，章永平，喬敏敏，盧健。Vasostatin基因重組腺病毒載體的構(gòu)建及其對胰腺癌生長的抑制作用。腫瘤，2004，24(6):538-541)。陳紅等以rAAV為載體，進(jìn)行了血管抑素(angiostatin)基因治療藥物治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的研究(陳紅，偷劍非，任常山。重組腺相關(guān)病毒載體介導(dǎo)血管抑素基因治療大鼠腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究。遼寧醫(yī)學(xué)雜志，2005，19(3)113-114)。迄今，尚無人采用rAAV載體介導(dǎo)Vasostatin、kallistatin和angiostatin進(jìn)行肺癌的治療報(bào)導(dǎo)，更沒有進(jìn)行抑制肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤的報(bào)導(dǎo)。因rAAV介導(dǎo)的外源基因能長期穩(wěn)定表達(dá)，沒有免疫反應(yīng)或免疫反應(yīng)極低，宿主范圍廣泛，成為最有前景的基因治療載體之一。在腫瘤治療方面，用rAAV攜帶p53、金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPl)、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)、干擾素(IFN)、內(nèi)皮抑素和血管抑素等基因，在結(jié)腸癌、肺癌和肝癌等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示了很好的抑制腫瘤發(fā)生、腫瘤血管形成和腫瘤生長作用，提高了動(dòng)物的抗腫瘤免疫功能及其生存率。發(fā)明人在前期研究中以肺靶向性rAAV為載體，進(jìn)行了多種抗腫瘤血管生長因子，如Vasostatin、Angiostatin和Kallistatin等基因治療藥物對肺癌的動(dòng)物試驗(yàn)研究。研究結(jié)果表明，以上基因治療藥物雖然能夠抑制肺癌的生長，但仍不能實(shí)現(xiàn)根治腫瘤的目的。但令人驚喜的是，上述基因治療藥物可以大大降低肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生，為抑制肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤提供了希望。另外，抗腫瘤血管生長因子基因治療的研究，均采用肌肉注射、靜脈注射等系統(tǒng)給藥的模式，生成的抗腫瘤血管生長因子在靶器官濃度低，不能較好地發(fā)揮靶器官腫瘤的治療目的。血管生成既是腫瘤生長等病理過程，也是創(chuàng)傷修復(fù)、心血管功能等生理過程，非靶向的血管生成抑制也不可避免地會引起不良反應(yīng)的發(fā)生。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的即從解決目前尚無辦法的肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤為治療目標(biāo)，采用肺靶向性轉(zhuǎn)染和表達(dá)的病毒載體，在肺局部長期表達(dá)抗腫瘤血管生長因子基因，積極地預(yù)防和治療肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤，而在其它器官無病毒載體的侵染，避免了不良反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明公開了一種靶向性基因治療藥物，以rAAV載體介導(dǎo)Vasostatin、kallistatin和angiostatin對治療肺癌效果很好，在進(jìn)一步的研究中，發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒載體選用rAAV2/l、rAAV2/2或rAAV2/5，啟動(dòng)子選用CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子、CCT啟動(dòng)子或CClO啟動(dòng)子時(shí)，本發(fā)明的基因藥物僅在肺部特異表達(dá)目的基因，不僅能有效治療肺癌，并且對抑制肺癌的轉(zhuǎn)移，以及對原發(fā)性腫瘤造成的肺轉(zhuǎn)移瘤有很好的抑制作用，還有利于避免不良反應(yīng)的發(fā)生。本發(fā)明的靶向性基因治療藥物，由病毒載體介導(dǎo)抗腫瘤血管生長因子基因的表達(dá)，其特征是病毒載體選自rAAV2/l、rAAV2/2或rAAV2/5；抗腫瘤血管生長因子基因選自Vasostatin、kallistatin或angiostatin；基因表達(dá)框的啟動(dòng)子選自CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子、CCT啟動(dòng)子或CClO啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控元件是WPRE(woodchuckhepatitisviruspost-transcriptionalregulatoryelement)。其中基因表達(dá)框白勺啟動(dòng)子優(yōu)選CCT啟動(dòng)子或CClO啟動(dòng)子。在本發(fā)明采用的rAAV載體中，其基因表達(dá)框依次含有啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控元件、PolyA尾巴，基因表達(dá)框兩端為AAV2ITR(invertedterminalrepeatsequence)0目的基因經(jīng)合適酶切后，插入上述表達(dá)框中，得到表達(dá)質(zhì)粒。經(jīng)無輔助病毒多質(zhì)粒法制備重組病毒，便得到本發(fā)明基因治療藥物。不同血清型的rAAV，其衣殼蛋白雖然具有高度的同源性，但氨基酸序列的細(xì)微差異，決定了其細(xì)胞趨向性(tropism)的差別。細(xì)胞趨向性的差別，導(dǎo)致不同血清型的AAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型和感染效率各有差異。本發(fā)明以rAAV2質(zhì)粒為基因表達(dá)質(zhì)粒，分別采用rAAVl-Il輔助質(zhì)粒進(jìn)行包裝，得到不同血清型的rAAV病毒。采用Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)和人肺上皮細(xì)胞(HLEC)對rAAV的趨向性進(jìn)行篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)選用rAAV2/l，或爛2/2，或rAAV2/5作為肺靶向載體效果最好(見實(shí)施例3)。啟動(dòng)子對基因表達(dá)的強(qiáng)弱發(fā)揮重要作用，并且具有細(xì)胞選擇性。本發(fā)明采用293細(xì)胞，Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)和人肺上皮細(xì)胞(HLEC)對不同的啟動(dòng)子進(jìn)行篩選，確定選用CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子、CCT啟動(dòng)子(CTP:phosphocholinecytidyIyltransferasepromoter)、CClO啟動(dòng)子(Claracell10_kdpromoter)(JALI^S學(xué)試驗(yàn)7)。肺癌原位瘤模型小鼠經(jīng)氣管灌注本發(fā)明藥物后，用藥組原位瘤較對照組有所縮小，但無顯著性差異。對照組在胸膜、縱隔腔淋巴結(jié)以及兩側(cè)肺均見明顯的肺癌轉(zhuǎn)移，但用藥組小鼠的肺癌轉(zhuǎn)移得到了顯著的抑制。本發(fā)明的基因藥物的制備方法采用無輔助病毒多質(zhì)粒法，即采用磷酸鈣法將表達(dá)質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，60-72小時(shí)后收獲重組病毒，經(jīng)層析純化后備用。本發(fā)明的基因藥物給藥途徑優(yōu)選用氣管灌注或霧化后吸入的方式。本發(fā)明的基因藥物可以和藥學(xué)上可接受的載體制備成各種制劑，優(yōu)選噴霧劑或溶液劑。本發(fā)明公開的基因藥物可以單獨(dú)使用，也可以合并使用。下面是本發(fā)明的基因藥物的部分藥理學(xué)試驗(yàn)，其中VAS是vasostatin縮寫，KAL是kallistatin縮寫，AS是angiostatin的縮寫，hm-LLC是highmetastasisLewisLungCarcinoma白勺縮寫。1.rAAV2/2-VAS對高轉(zhuǎn)移性LLC(hm-LLC)皮下移植瘤向肺轉(zhuǎn)移的抑制作用hm-LLC為高轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞，小鼠皮下接種后可形成偶發(fā)性轉(zhuǎn)移肺癌模型。用rAAV2/2-VAS體外轉(zhuǎn)染hm_LLC細(xì)胞(MOI:5xl04)后，皮下接種(5xl06個(gè)細(xì)胞)到C57BL小鼠，采用PBS和rAAV2/2-eGFP為對照。接種7天后，檢查各組小鼠皮下移植瘤的血液供應(yīng)情況。rAAV2/2_VAS組小鼠平均供血血管數(shù)為3.2士0.8，顯著少于PBS和rAAV2/2-eGFP對照組(7.8士0.9和8.0士0.8)(p<0.001，n=5)。腫瘤組織切片(HE染色)顯示對照組中存在多條含紅細(xì)胞的腔道，而rAAV2/2-VAS組不存在此類腔道(見圖1)。說明vasostatin抑制了皮下移植瘤的血管形成。E-cadherin是與腫瘤細(xì)胞侵入性有關(guān)的一類細(xì)胞粘附因子，其表達(dá)下調(diào)表明腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向增加。腫瘤組織切片免疫染色顯示(見圖2)，rAAV2/2-VAS組E-cadherin的表達(dá)明顯超過對照組，說明其轉(zhuǎn)移傾向受到抑制。接種21天后，rAAV2/2-VAS組皮下移植瘤體積為對照組的65%。所有rAAV2/2_eGFP對照組小鼠的肺部，均出現(xiàn)了明顯的轉(zhuǎn)移性肺癌結(jié)節(jié)，平均結(jié)節(jié)數(shù)為20士10，所有對照組小鼠的結(jié)節(jié)數(shù)多于10個(gè)，而rAAV2/2-VAS組小鼠的肺部平均結(jié)節(jié)數(shù)為9士6(ρ<0.05，n=5)，其中3只小鼠的結(jié)節(jié)數(shù)少于10個(gè)。以上結(jié)果說明本發(fā)明的rAAV2/2_VAS對腫瘤血管生成具有抑制作用，限制了腫瘤的生長。更重要的是，該藥可以有效降低腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移傾向，減少肺轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。2.氣管灌注rAAV2/I-CCT-KAL對A549肺癌原位瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用因腫瘤細(xì)胞的移植位置對其生長有重要影響，肺癌原位瘤模型更能模擬人肺癌的發(fā)展情況。小鼠左肺注射A549細(xì)胞形成的肺癌原位瘤模型，可以觀察原位癌的生長、侵入胸膜和縱膈淋巴結(jié)、并轉(zhuǎn)移至對側(cè)肺的過程。在7周齡BALB/c裸鼠左肺注射A549細(xì)胞(IxlO6)后1周，經(jīng)氣管灌注rAAV2/l-CCT-KAL，劑量為3xl0"vp/鼠。對照組為PBS或rAAV2/l_eGFP。50天后，所有小鼠均生長了肺癌原位瘤，實(shí)驗(yàn)組和對照組的瘤體積無明顯差異。但rAAV2/l-CC10-KAL組縱膈淋巴結(jié)重量僅為對照組的50%(ρ<0.05,η=8)。對照組所有小鼠(8/8)的右肺淋巴結(jié)數(shù)量均超過30個(gè)，而rAAV2/l-CCT-KAL組有3只(3/8)小鼠右肺淋巴結(jié)數(shù)量少于10個(gè)。通過⑶34免疫染色測定原位瘤的微血管密度(見圖3)，結(jié)果顯示rAAV2/I-CCT-KAL組的微血管密度僅為對照組的0.63(ρ<0.05，η=8)。以上結(jié)果說明氣管灌注rAAV2/l-CCT_KAL后，對腫瘤血管生成具有抑制作用，降低了肺癌原位瘤向縱膈及對側(cè)肺的轉(zhuǎn)移的發(fā)生。3.氣管灌注rAAV2/5-CCT_VAS對皮下移植瘤術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的抑制作用hm-LLC細(xì)胞(5xl06)皮下接種到C57BL小鼠，待腫瘤長徑達(dá)0.5cm左右時(shí)(1周后)，手術(shù)切除原位瘤，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向肺轉(zhuǎn)移加速。術(shù)后當(dāng)日小鼠經(jīng)氣管灌注rAAV2/5-CCT_VAS，劑量為2x10"^/鼠。對照組為PBS或rAAV2/5-eGFP。術(shù)后30日，所有對照組小鼠(η=4)發(fā)生嚴(yán)重肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，出現(xiàn)血胸，肺中有轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，腫瘤體積大，血管豐富，且有出血現(xiàn)象。而rAAV2/5-VAS組中1只小鼠(1/4)沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，2只小鼠(2/4)僅出現(xiàn)少量肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，平均肺增重較對照組降低40%。每組有6只小鼠進(jìn)行了生存時(shí)間實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)周期為治療后10周。對照組平均生存時(shí)間為21天，rAAV2/5-CCT-VAS組為52天，延長2倍以上(見圖4)。10周時(shí)對小鼠肺部進(jìn)行光鏡檢查，治療組中有1只小鼠未見腫瘤轉(zhuǎn)移，但組織免疫檢查發(fā)現(xiàn)該鼠肺血管周圍有潛伏的微轉(zhuǎn)移存在(見圖5)，說明rAAV2/5-CCT-VAS對移植瘤術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的生長具有抑制作用。4.氣管合并灌注rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS對皮下移植瘤術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的抑制作用實(shí)驗(yàn)方法同3，治療組改為氣管合并灌注rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS，劑量為ZxIO11Vp/鼠。對照組為PBS或rAAV2/5_eGFP。術(shù)后30日，治療組中1只小鼠(1/3)沒有發(fā)生肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，2只小鼠(2/3)僅出現(xiàn)少量肺中轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，平均肺增重較對照組降低40%以上。治療組中半數(shù)生存時(shí)間超過10周(見圖4)，10周時(shí)體重增加，行為正常。10周時(shí)對小鼠肺部進(jìn)行光鏡檢查，治療組中有4只小鼠未見腫瘤轉(zhuǎn)移。但組織免疫檢查發(fā)現(xiàn)肺血管周圍有潛伏的微轉(zhuǎn)移存在(見圖5)，說明rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS對移植瘤術(shù)后肺轉(zhuǎn)移的生長具有抑制作用。在氣管用藥后第4周和第10周對存活鼠肺部組織切片，檢查angiostatin的表達(dá)(見圖6)。在氣管用藥后第4周和第10周，在肺上皮細(xì)胞可見angiostatin的表達(dá)。5.氣管灌注rAAV2/l-CC10-VAS、rAAV2/l-CC10-AS、或二者合用對肺原位瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用C57B6小鼠左肺實(shí)質(zhì)注射LLC細(xì)胞(IxlO3)，3天后氣管灌注治療藥或?qū)φ?，劑量?χ10ηνρ/鼠。21天后，檢查肺部及縱隔淋巴結(jié)，評價(jià)肺原位瘤及轉(zhuǎn)移情況。表1.各組肺原位瘤體積"1肺原位瘤體積(《3)PBS81.4+28.83rAAV2/l-eGFP73.39+16.60rAAV2/I-CC10-VAS60.3+28.0rAAV2/l-CC10-AS54.3+18.9rAAV2/I-CC10-VAS和57.3+14.5rAAV2/l-CC10-AS從表1可見治療組肺原位瘤體積均小于對照組，但無顯著性差異。表2.各組縱隔淋巴結(jié)重量縱隔淋巴結(jié)重量(mg)PBS138.4+33.2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:p<0.05；**:p<0.01與PBS相比?？v隔淋巴結(jié)重量是反映肺原位瘤轉(zhuǎn)移的指標(biāo)，從表2可見治療組肺原位瘤轉(zhuǎn)移明顯得到了抑制。6.氣管灌注rAAV2/5-CC10_KAL后轉(zhuǎn)基因在肺中的長期特異表達(dá)正常小鼠氣管灌注rAAV2/5-CC10-KAL，劑量為2x10"^/鼠。1月后，取部分小鼠處死，RT-PCR法檢查肺、心、肝、腎、小腸中Kallistatin的表達(dá)(圖7)。可見僅肺部有Kallistatin的特異表達(dá)，其它臟器均未見表達(dá)。說明氣管灌注rAAV2/5_CC10_AS后轉(zhuǎn)基因的表達(dá)具有肺特異性，實(shí)現(xiàn)了靶向作用。氣管灌注rAAV2/5-CC10-KAL1、2和3月后，RT-PCR法檢查肺中Kallistatin的表達(dá)(圖8)?？梢姺尾縆allistatin的特異表達(dá)可持續(xù)6個(gè)月以上。7.不同啟動(dòng)子在HLEC肺上皮細(xì)胞的特異表達(dá)以rAAV2/I-CC10-AS分別體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，HLEC細(xì)胞和LLC細(xì)胞(Μ0Ι=IO4)，WesternBlot方法測定angiostatin的表達(dá)強(qiáng)弱(圖9)。從圖9可以看出，rAAV2/1-CC10-AS在HLEC細(xì)胞的表達(dá)要強(qiáng)于293細(xì)胞和LLC細(xì)胞。以rAAV2/5-CCT-AS體外轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，HLEC細(xì)胞和LLC細(xì)胞，也得到了類似的結(jié)果.由上述藥理試驗(yàn)可見，本發(fā)明的基因藥物不僅具有肺靶向性，能治療肺癌，更為重要的是本發(fā)明的基因藥物能抑制肺癌轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤。圖1.小鼠皮下移植經(jīng)rAAV2/5-VAS轉(zhuǎn)染的hm_LLC7天后腫瘤的組織切片(HE染色)。上圖為PBS對照組，中圖為rAAV2/5-eGFP對照組，下圖為rAAV2/5_VAS治療組。放大倍數(shù)200。對照組(上圖和中圖)中存在多條含紅細(xì)胞的腔道，而rAAV2/2-VAS組(下圖)不存在此類腔道。圖2.小鼠皮下移植經(jīng)rAAV2/5-VAS轉(zhuǎn)染的hm_LLC7天后，腫瘤組織切片進(jìn)行E-cadherin免疫染色。上圖為PBS對照組，中圖為rAAV2/5_eGFP對照組，下圖為rAAV2/5-VAS治療組。放大倍數(shù)400。rAAV2/5_VAS治療組(下圖)E-cadherin的表達(dá)明顯增加。圖3.左圖為rAAV2/l_eGFP對照組A549肺癌原位瘤免疫組化切片(⑶34染色，放大倍數(shù)100)，右圖為rAAV2/l-CCT-KAL治療組A549肺癌原位瘤免疫組化切片(⑶34染色，放大倍數(shù)100)。治療組(右圖)微血管密度明顯低于對照組(左圖)。圖4.手術(shù)切除hm-LLC皮下原位瘤后，各組的生存率比較(η=6)。各組分別為rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS治療組(V+A，**)，rAAV2/5-CCT-VAS治療組(V*)，rAAV2/5-eGFP對照組(G)，PBS對照組(P)。(*p<0.05，<0.01)圖5.手術(shù)切除hm-LLC皮下原位瘤后，肺組織切片檢查微腫瘤轉(zhuǎn)移(箭頭為肺靜脈周圍存在的微腫瘤轉(zhuǎn)移，放大倍數(shù)200)。上圖為rAAV2/5-CCT-VAS治療組，下圖為rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS治療組。圖6.鼠肺部組織切片免疫組化分析angiostatin的表達(dá)(棕色染色)。上左圖為rAAV2/5-CCT-VAS和rAAV2/5_CCT_AS治療組4周時(shí)，上右圖為rAAV2/5_CCT_VAS和rAAV2/5-CCT-AS治療組10周時(shí)，下圖為rAAV2/5_eGFP對照組4周時(shí)。放大倍數(shù)100。治療組(上圖)的肺氣管表面上皮細(xì)胞中有明顯的棕色染色，而對照組(下圖)無。圖7.上圖為氣管灌注rAAV2/5-CC10-KAL30天后，RT-PCR法檢查肺(Lung9，10)、心(heart7,8),肝(liver5,6),腎(kidney3,4),小腸(intestine1,2)中Kallistatin的表達(dá)，含KallistatincDNA的質(zhì)粒為陽性對照(PC)。下圖為以18SrRNA為方法學(xué)對照。M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。僅在肺中檢出Kallistatin的表達(dá)。圖8.上圖為氣管灌注rAAV2/5-CC10-KAL1月(1，2)，2月(3,4)和6月(5,6)后，RT-PCR法檢查肺中Kallistatin的表達(dá)，含KallistatincDNA的質(zhì)粒為陽性對照(PC)。下圖為以18SrRNA為方法學(xué)對照，NC為陰性對照。M為分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖9.293細(xì)胞，HLEC細(xì)胞和LLC細(xì)胞轉(zhuǎn)染rAAV2/l_CC10_AS(Μ0Ι=IO4)60后，WesternBlot方法測定angiostatin的表達(dá)。1為rAAV2/l-CCl0-AS轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的上清液；2為rAAV2/I-CC10-AS轉(zhuǎn)染HLEC細(xì)胞的上清液；3為rAAV2/1_CC10-AS轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞的上清液；4為rAAV2/l-eGFP轉(zhuǎn)染293細(xì)胞的上清液；5為rAAV2/l_eGFP轉(zhuǎn)染HLEC細(xì)胞的上清液；6為rAAV2/l-eGFP轉(zhuǎn)染LLC細(xì)胞的上清液。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1rAAV2/2-eGFP的制備eGFP表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)框的組成依次為啟動(dòng)子為CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子，eGFPcDNA,polyA,WPRE。表達(dá)框兩端為AAV2ITR。采用磷酸鈣無輔助病毒多質(zhì)粒法制備重組病毒將eGFP表達(dá)質(zhì)粒，AV輔助質(zhì)粒，與rAAV2輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，60-72小時(shí)后收獲細(xì)胞，用去氧膽酸鈉(0.5%)和benzonase(30u/ml)裂解，離心(3000g30min)去細(xì)胞碎片，氯化銫梯度離心，即得重組病毒rAAV2/2-eGFP，色譜層析法純化。實(shí)施例2rAAV2/l-eGFP、rAAV2/3_eGFP、rAAV2/4_eGFP、rAAV2/5_eGFP、rAAV2/6_eGFP、rAAV2/7-eGFP、rAAV2/8_eGFP、rAAV2/9_eGFP、rAAV2/10_eGFP、rAAV2/ll-eGFP的制備參照實(shí)施例1步驟，將rAAV2輔助質(zhì)粒分別換為rAAVl、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAVIO、rAAVl1，其余操作同實(shí)施例1，得到11種不同血清型rAAV病毒。實(shí)施例3肺趨向性rAAV血清型的篩選采用Real-PCR方法，測定實(shí)施例2得到的各種血清型rAAV的滴度。所用引物根據(jù)WPRE序列設(shè)計(jì)，分另Ij為WPRE-F(5，-TGGCGTGGTGTGCACTGT)禾口WPRE-R(5，-GTTCCGCCGTGGCAATAG)。將LLC細(xì)胞或HLEC細(xì)胞接種至24孔板，培養(yǎng)過夜。分別加入含實(shí)施例2得到的各種血清型rAAV病毒(Μ0ΙIO4)的無血清培養(yǎng)基，孵育5小時(shí)后，用正常培養(yǎng)基替換。72小時(shí)后，用熒光顯微鏡觀察，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分類，并計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(η=3)。表3不同血清型rAAV對LLC細(xì)胞或HLEC細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率rAAV血清型LLC細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(％)HLEC細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>可見各種血清型rAAV對LLC細(xì)胞或HLEC細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率均有所不同，但比較而言，rAAV2/l,rAAV2/2和rAAV2/5對LLC細(xì)胞或HLEC細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高。實(shí)施例4rAAV2/2-VAS,rAAV2/I-VAS和rAAV2/5_VAS的制備人vasostatin全長cDNA通過PCR由人肝第一鏈cDNA擴(kuò)增。擴(kuò)增vasostatin的專屬引物為Vas-F(5，-AACTCGAGCCCGCCATGCTGCTATCC)和Vas-R(5，-AAAAGCTTCTAGTTGTCTGGCCGCACAAT)。限制性酶切位點(diǎn)CTCGAG(XhoI)和AAGCTT(HindIII)被引入以方便亞克隆，在引物Vas-R中引入了終止密碼子CTA。PCR條件為94°C，50°C和68°C各45秒，共36循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證其正確性，并亞克隆至AAV-2表達(dá)載體上，獲得rAAV2-VAS表達(dá)質(zhì)粒。該表達(dá)質(zhì)粒的啟動(dòng)子為CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子。為加強(qiáng)表達(dá)，在插入基因后，還引入了WPRE元件。采用磷酸鈣無輔助病毒多質(zhì)粒法制備重組病毒將該表達(dá)質(zhì)粒，AV輔助質(zhì)粒，與rAAV2輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，60-72小時(shí)后收獲細(xì)胞，用去氧膽酸鈉(0.5%)和benzonase(30u/ml)裂解，離心(3000g30min)去細(xì)胞碎片，氯化銫梯度離心，親和層析純化即得重組病毒rAAV2/2-VAS。病毒制備時(shí)，將rAAV2輔助質(zhì)粒分別替換為rAAVl輔助質(zhì)粒和rAAV5輔助質(zhì)粒，其余方法同上，則得到rAAV2/l-VAS和rAAV2/5_VAS病毒。實(shí)施例5rAAV2/l-CCT-VAS、rAAV2/2_CCT_VAS、rAAV2/5-CCT-VAS的制備將實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒中CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子換為CCT啟動(dòng)子，其余步驟分別按照實(shí)施例4進(jìn)行。實(shí)施例6rAAV2/l-CC10-VAS、rAAV2/2_CC10-VAS、rAAV2/5_CC10_VAS的制備將實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒中CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子換為CClO啟動(dòng)子，其余步驟分別按照實(shí)施例4進(jìn)行。實(shí)施例7rAAV2/2-KAL,rAAV2/I-KAL和rAAV2/5_KAL的制備將實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為kallistatin，其余步驟分別按照實(shí)施例4進(jìn)行。實(shí)施例8rAAV2/l-CCT-KAL、rAAV2/2_CCT_KAL、rAAV2/5-CCT-KAL的制備將實(shí)施例5表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為kallistatin，其余步驟分別按照實(shí)施例5進(jìn)行。實(shí)施例9rAAV2/I-CClO-KAL、rAAV2/2_CC10_KAL、rAAV2/5-CClO-KAL的制備將實(shí)施例6表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為kallistatin，其余步驟分別按照實(shí)施例6進(jìn)行。實(shí)施例10rAAV2/2-AS,rAAV2/l-AS和rAAV2/5_AS的制備將實(shí)施例4表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為angiostatin，其余步驟分別按照實(shí)施例4進(jìn)行。實(shí)施例11rAAV2/l-CCT-AS、rAAV2/2_CCT_AS、rAAV2/5_CCT_AS的制備將實(shí)施例5表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為angiostatin，其余步驟分別按照實(shí)施例5進(jìn)行。實(shí)施例12rAAV2/I-CClO-AS、rAAV2/2_CC10_AS、rAAV2/5-CCIO-AS的制備將實(shí)施例6表達(dá)質(zhì)粒中目的基因vasostatin換為angiostatin，其余步驟分別按照實(shí)施例6進(jìn)行。實(shí)施例13重組病毒rAAV2/5-CCT_AS溶液劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例11方法制得的重組病毒rAAV2/5-CCT-AS病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，即得。實(shí)施例14重組病毒rAAV2/I-CCT-KAL溶液劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例8方法制得的重組病毒rAAV2/l-CCT_KAL病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，即得。實(shí)施例15重組病毒rAAV2/5-CCT_VAS溶液劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例5方法制得的重組病毒rAAV2/5-CCT_VAS病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，即得。實(shí)施例16重組病毒rAAV2/I-CC10-VAS溶液劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例6方法制得的重組病毒rAAV2/l-CC10-VAS病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，即得。實(shí)施例17重組病毒rAAV2/5_CC10-KAL噴霧劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例9方法制得的重組病毒rAAV2/5-CC10_KAL病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，分裝至噴霧劑容器中，即得。實(shí)施例18重組病毒rAAV2/I-CC10-AS溶液劑的制備取氯化鈉0.58g，枸櫞酸鈉0.58g，枸櫞酸0.006g，20%人血白蛋白1ml，加入注射用水約80ml，溶解后，加注射用水至100ml，無菌過濾，得稀釋用緩沖液(pH6.5-7.5)。取實(shí)施例12方法制得的重組病毒rAAV2/l-CC10_AS病毒5xl014vp，加稀釋用緩沖液至100ml，無菌過濾，即得。權(quán)利要求一種肺靶向性基因治療藥物，由病毒載體介導(dǎo)抗腫瘤血管生長因子基因的表達(dá)，其特征是病毒載體為rAAV2/2；抗腫瘤血管生長因子基因選自Vasostatin、kallistatin或angiostatin；基因表達(dá)框的啟動(dòng)子選自CMV增強(qiáng)子/雞β-actin啟動(dòng)子、CCT啟動(dòng)子或CC10啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控元件是WPRE。2.權(quán)利要求1的基因治療藥物用于制備治療肺癌轉(zhuǎn)移的藥物的用途。3.權(quán)利要求1的基因治療藥物用于制備治療肺轉(zhuǎn)移瘤的藥物的用途。全文摘要本發(fā)明涉及分子藥物學(xué)、分子醫(yī)學(xué)和疾病防治領(lǐng)域，具體涉及基于重組腺相關(guān)病毒(rAAV)和腫瘤血管生成抑制基因的基因藥物，該藥物可以靶向作用于肺組織，有效地抑制肺癌的轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。文檔編號A61P11/00GK101804210SQ20101016943公開日2010年8月18日申請日期2007年10月15日優(yōu)先權(quán)日2007年10月15日發(fā)明者刁勇,蔡克霞,許瑞安申請人:刁勇;許瑞安