專利名稱：：秋水仙堿在制備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及秋水仙堿在制藥方面的應(yīng)用，特別涉及秋水仙堿在藥物治療膽汁淤積性肝病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：秋水仙堿來(lái)源秋水仙堿是秋水仙藥材中的主要有效成分和毒性成分，一種卓酚酮類生物堿。除百合科秋水仙屬外，同科其它屬，包括嘉蘭屬(Gloriosa)、益辟堅(jiān)屬(Iphigenia)、安圭拉氏蘭屬(Auguillaria)和天南星屬(Arisaema)等植物中也含秋水仙堿類生物堿?；瘜W(xué)名N-(5，6，7，9-四氫-1，2，3，10-四甲氧基-9-氧-苯并[a]庚間三烯并庚間三烯-7-基)乙酰胺，CAS:64-86-8。結(jié)構(gòu)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>秋水仙堿的主要藥理作用簡(jiǎn)要?dú)w納如下1.抗痛風(fēng)目前秋水仙堿主要用于急性痛風(fēng)。秋水仙堿對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎有選擇性的消炎作用，對(duì)一般的疼痛、炎癥及慢性痛風(fēng)均無(wú)效，其作用主要是消炎，抑制粒細(xì)胞浸潤(rùn)，原因是與粒細(xì)的微管蛋白結(jié)合妨礙粒細(xì)胞的活動(dòng)，秋水仙堿能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在分裂中期。這種由秋水仙素引起的不正常分裂，稱為秋水仙素有絲分裂(c-mitosis)。在這樣的有絲分裂中，染色體雖然縱裂，但細(xì)胞不分裂，不能形成兩個(gè)子細(xì)胞，因而使染色體加倍。秋水仙堿不論是破壞還是抑制紡錘體的形成，作用都是一時(shí)的。秋水素可以抑制紡錘體的形成，導(dǎo)致細(xì)胞不分裂，“然后過(guò)一段時(shí)間秋水仙素代謝掉，不再起作用，細(xì)胞繼續(xù)分裂，-然后才是“染色體數(shù)目加倍”(著絲點(diǎn)的分裂)。2.抗腫瘤作用秋水仙堿是細(xì)胞有絲分裂強(qiáng)烈抑制劑，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。秋水仙堿發(fā)揮微管蛋白聚合抑制因子的作用，能引起腫瘤內(nèi)部新生的毛細(xì)血管損傷而導(dǎo)致出血性廣泛壞死。秋水仙堿的A和C環(huán)可與微管蛋白亞單位微管蛋白結(jié)合，干擾微管蛋白的組裝過(guò)程，從而使微管蛋比解聚。秋水仙堿由于作用選擇性較低，毒性大，現(xiàn)已少用。3.神經(jīng)系統(tǒng)秋水仙堿具有神經(jīng)毒性，主要與微管相結(jié)合，抑制軸漿運(yùn)輸，導(dǎo)致神經(jīng)元去營(yíng)養(yǎng)退化死亡。秋水仙素可使尾殼核的神經(jīng)元壞死。秋水仙堿有增強(qiáng)或延長(zhǎng)催眠藥物的作用，能降低體溫，增加對(duì)中樞藥物的敏感性，抑制呼吸中樞，增加對(duì)擬交感神經(jīng)的反應(yīng)。由于神經(jīng)末端小體與秋水仙堿結(jié)合，干擾了神經(jīng)遞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而改變了神經(jīng)肌肉的功能，增強(qiáng)了胃腸的活動(dòng)。4.抗纖維化/抗組織增生秋水仙堿對(duì)肝臟纖維化、肺纖維化等均顯示出一定的預(yù)防和治療效果。對(duì)豬血清免疫性肝纖維化大鼠和血吸蟲(chóng)感染小鼠，秋水仙堿具有顯著抗肝纖維化的作用，明顯降低肝內(nèi)各型膠原蛋白含量。秋水仙堿對(duì)肺纖維化大鼠纖維連接蛋白的形成具有抑制作用。秋水仙堿具有明顯的抑制炎癥細(xì)胞和抗腎臟纖維化作用，能預(yù)防環(huán)孢霉素引起的腎間質(zhì)纖維化和預(yù)防細(xì)菌感染引起的腎臟瘢痕形成，并能減緩腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。用腹主動(dòng)脈縮窄的方法建立心肌肥厚大鼠模型，秋水仙堿能有效抑制心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展，同時(shí)明顯的下調(diào)心肌肥厚相關(guān)因子表達(dá)。秋水仙堿腹腔注射，可預(yù)防家兔手術(shù)粘連。秋水仙堿對(duì)體外培養(yǎng)的人大隱靜脈片的內(nèi)膜增生具有抑制作用，這種抑制作用只有在培養(yǎng)早期施加藥物才能顯著。5.免疫系統(tǒng)和抗炎作用秋水仙堿對(duì)免疫細(xì)胞的增殖、分化、趨化和炎癥介質(zhì)釋放等都有抑制作用。顯著抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞功能，特別對(duì)白細(xì)胞功能及免疫細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和趨化作用的抑制尤為顯著。秋水仙堿還能抑制免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞TNFa、IL-2、IL-6、TGF-β、粒-巨細(xì)胞集落刺激因子等的mRNA和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)和分泌，但對(duì)IL-Ιβ的產(chǎn)生有促進(jìn)作用。秋水仙堿通過(guò)抑制白細(xì)胞等細(xì)胞溶酶體酶的釋放、抑制活化的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等產(chǎn)生5-脂氧化酶，使胞內(nèi)cAMP濃度增加、促進(jìn)前列腺素合成和釋放。秋水仙堿對(duì)于C0X-2的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成也有抑制作用。秋水仙堿尚能抑制嗜堿性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌組胺，劑量倚賴性地抑制LPS刺激的大鼠巨噬細(xì)胞分泌TNFa，且秋水仙堿作用于TNFa合成的早期，從而對(duì)動(dòng)物肝毒性具有預(yù)防作用。目前秋水仙堿作為一種常用的抗痛風(fēng)藥和抗腫瘤藥?？雇达L(fēng)用法用量治療急性痛風(fēng)口服首劑lmg，以后23小時(shí)0.5mg，直至疼痛緩解。極量每日3mg。預(yù)防痛風(fēng)急性發(fā)作每日或隔日0.5lmg?？鼓[瘤用法用量靜滴每次24ml(12mg)，加5%葡萄糖50ml，緩慢滴注，每日1次，1療程4080ml。靜注每次2ml。用25%葡萄糖或等滲鹽水40ml，稀釋后緩注。膽汁淤積是由于膽汁生成障礙和(或)流動(dòng)障礙所造成的一種臨床綜合征。分為肝外膽汁淤積和肝內(nèi)膽汁淤積。肝外膽汁淤積是指肝外膽管系統(tǒng)機(jī)械性梗阻所致的膽汁淤積；肝內(nèi)膽汁淤積是指任何病因引起肝細(xì)胞和/或毛細(xì)膽管膽汁分泌功能障礙，或肝內(nèi)小膽管彌漫性梗阻所致的一系列的病理和臨床表現(xiàn)。膽鹽在肝內(nèi)淤積，均可導(dǎo)致肝臟損傷和慢性膽汁淤積性肝病。隨著病情的進(jìn)展，通常伴隨有血清堿性磷酸酶升高、黃疸和高膽固醇血癥，并逐步發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝功能衰竭。目前膽汁淤積性肝病無(wú)特效藥，熊去氧膽酸作為常用的保肝藥也只能減輕膽汁淤積的癥狀。文獻(xiàn)未見(jiàn)有關(guān)秋水仙堿在治療膽汁淤積肝病的報(bào)道，發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)秋水仙堿可以治療膽汁淤積肝病。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的發(fā)明人提供一種秋水仙堿在制備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用，特別提供秋水仙堿在治療妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合癥、內(nèi)原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)重癥黃疸和免疫性黃疸等膽汁淤積性肝病中的應(yīng)用。技術(shù)方案妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合癥、內(nèi)原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)重癥黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病是膽汁淤積性肝病常見(jiàn)的病癥之一。α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型是研究PBC、PSC和重癥黃疸常用的動(dòng)物模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積模型是常用的研究妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合癥動(dòng)物模型，膽管結(jié)扎致肝外膽汁淤積模型是常用的研究梗阻性黃疸的動(dòng)物模型。采用α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型，17α-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積模型，膽管結(jié)扎致大鼠肝外膽汁淤積模型，以50和100μg/kg的秋水仙堿針對(duì)上述三種模型進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明秋水仙堿對(duì)有效的降低肝臟出現(xiàn)明顯的損傷以及減少膽汁淤積，優(yōu)于臨床常用藥熊去氧膽酸，從而說(shuō)明秋水仙堿可以治療膽汁淤積性肝病，增加了秋水仙堿的新用途。治療膽汁淤積性肝病的潛在靶點(diǎn)有一、減少肝細(xì)胞攝取膽鹽及有機(jī)陰離子目前尚無(wú)特異性的減少肝細(xì)胞攝取膽鹽的藥物。研究顯示法尼醇X受體(FXR)激動(dòng)劑，如GW4064，6-E⑶CA等可能是降低肝細(xì)胞攝取膽鹽的有效藥物。這類藥物能下調(diào)NTCP和OATPs的表達(dá)，減少肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸及其他有機(jī)陰離子進(jìn)入膽汁淤積的肝臟，避免肝內(nèi)膽汁酸、膽紅素及其他膽汁成分的超載，但有導(dǎo)致血清膽汁酸和其他有機(jī)陰離子升高的副作用。相反，膽汁酸多價(jià)螯合劑和回腸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑則無(wú)這類副作用，而秋水仙堿可以上調(diào)肝臟膽汁酸受體FXR的表達(dá)，下調(diào)NTCP和OATPs的表達(dá)，減少肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸及其他有機(jī)陰離子進(jìn)入膽汁淤積的肝臟，減少肝損傷。二、促進(jìn)肝細(xì)胞中膽汁酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)膽汁酸鹽和其他物質(zhì)吸收進(jìn)入肝細(xì)胞后，依靠他的疏水性，通過(guò)擴(kuò)散的方式在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)膜內(nèi)到達(dá)小管頂端，依靠肝細(xì)胞基側(cè)膜上的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，如MRP2、MDR3、MRP3、0ATP2C和BSEP等將膽汁酸鹽排泄入毛細(xì)膽管。研究顯示，一些遺傳代謝性膽汁淤積癥多是由于此類轉(zhuǎn)運(yùn)體的缺陷或突變所引起，而慢性膽汁淤積時(shí)該類轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)和功能均下調(diào)，致各種潛在毒性的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的排泄受到影響。因此促進(jìn)肝細(xì)胞基側(cè)膜上膽汁酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體的的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)能力，則可降低肝細(xì)胞內(nèi)膽鹽及有機(jī)陰離子的蓄積和對(duì)肝細(xì)胞的毒性。秋水仙堿能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排泄，減輕膽汁淤積。三、促進(jìn)膽管細(xì)胞的排泌膽管細(xì)胞排泌功能的重要意義在于稀釋膽汁和清洗膽管。如囊性纖維化時(shí)，由于編碼Ca2+依賴的氯離子通道的CFTR基因突變，致氯離子依賴的HC03_分泌受損。而在PBC中，則存在膽管細(xì)胞碳酸氫鹽的分泌和Cl2HCO3-交換受損。刺激膽管細(xì)胞加強(qiáng)對(duì)膽鹽的排泌則可降低膽汁酸對(duì)膽管細(xì)胞的毒性。秋水仙堿能有效增加膽管細(xì)胞對(duì)膽汁酸、膽紅素和磷脂的排泄，從而增加膽汁酸依賴性膽流(BSDF)和非膽汁酸依賴性膽流(BSIF)，促進(jìn)膽管細(xì)胞排泌。四、保護(hù)膽管上皮細(xì)胞保護(hù)膽管上皮細(xì)胞免受膽汁酸的毒性損害，是治療以膽管損傷為主的慢性膽汁淤積疾病(如PBC、PSC)的重要措施。這類疾病中膽管上皮細(xì)胞是免疫介導(dǎo)損傷的靶點(diǎn)，高濃度的疏水性膽汁酸具有細(xì)胞毒性，可進(jìn)一步加重膽管上皮細(xì)胞的損傷。一些少見(jiàn)的膽汁淤積性疾病，如遺傳性MDR3缺乏所致的進(jìn)行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積III型，由于膽汁中缺乏磷脂，不能形成膽汁-磷脂的微膠粒來(lái)降低膽汁的毒性作用。因此改善膽汁酸與磷脂的失衡則可減輕膽汁酸的毒性。秋水仙堿能有效上調(diào)肝臟MDR3表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)磷脂排泄，升高膽汁中磷脂的濃度，從而保護(hù)膽管上皮細(xì)胞，降低血清ALP和GGT水平，減少肝損傷。有益效果1、秋水仙堿能有效降低膽汁淤積性肝病引起的肝損傷及膽汁淤積，即可以有效地治療膽汁淤積性肝病。2、秋水仙堿能有效減輕膽汁淤積導(dǎo)致的肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)膽管增生。3、秋水仙堿能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排泄，保護(hù)膽管上皮細(xì)胞，減少肝損傷。4、秋水仙堿可以上調(diào)肝臟膽汁酸受體FXR的表達(dá)，下調(diào)NTCP和OATPs的表達(dá)，減少肝細(xì)胞對(duì)膽汁酸及其他有機(jī)陰離子進(jìn)入膽汁淤積的肝臟，減少肝損傷。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、對(duì)α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致大鼠膽汁淤積作用α-萘異硫氰酸酯(ANIT)致膽汁淤積模型是研究肝內(nèi)膽汁淤積經(jīng)典的模型。ANIT致大鼠膽汁淤積是采用ANIT50-100mg/kg灌胃給藥12h后出現(xiàn)膽汁淤積，24h后出現(xiàn)肝損傷和黃疸。實(shí)驗(yàn)方案30只220-250g雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只正常對(duì)照組、模型組(ANIT50mg/kg灌胃)、褪黑素50mg/kg灌胃治療組、秋水仙堿50和100μg/kg腹腔注射治療組。給藥組預(yù)防給藥5天，第5天后禁食過(guò)夜，給予ANIT造模，然后于造模后48h分別眼眶采血0.5ml測(cè)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ-氨基轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、總膽紅素(TBIL)和總膽汁酸(TBA)。取肝臟用中性福爾馬林固定，石蠟包埋做組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測(cè)FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、TBA各項(xiàng)生化指標(biāo)均顯著升高，肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，F(xiàn)XR、BSEP,MRP2和MDR3的表達(dá)減低，表明肝臟出現(xiàn)明顯的損傷以及膽汁淤積，而秋水仙堿2個(gè)治療組均能減輕肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，增加BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)不同程度的明顯降低各項(xiàng)損傷血生化指標(biāo)。血生化結(jié)果見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>**ρ<0.01，與正常組比較;#Ρ<0.05，·ρ<0·01，與模型組比較。實(shí)施例2、對(duì)17Ci-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積作用釆用17ex-炔雌醇(EE)致大鼠膽汁淤積作用造模。EE造模是研究妊娠期膽汁淤積常用的動(dòng)物模型，釆用EE5mg/kg皮下注射連續(xù)5天即會(huì)造成膽汁淤積。實(shí)驗(yàn)方案30只雄性大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為以下5組，每組6只正常對(duì)照組、模型組(EE5mg/kg，sc)、熊去氧膽酸50mg/kg灌胃治療組、秋水仙堿50和100μg/kg腹腔注射治療組。其中EE造模給藥5天，造模前Ih給予秋水仙堿，末次給藥后禁食過(guò)夜，眼眶釆血Iml測(cè)ALT、AST、ALP、GGT、TBIL和TBA。取肝臟用中性福爾馬林固定，石蠟包埋做組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測(cè)FXR、BSEP.MRP2和MDR3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物血清ALP、GGT、TBIL和TBA水平顯著升高，肝臟出現(xiàn)少量肝細(xì)胞壞死，F(xiàn)XR、BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)降低，提示發(fā)生明顯的膽汁淤積和膽管損傷，而秋水仙堿2個(gè)治療組均能不同程度的明顯降低各項(xiàng)損傷指標(biāo)，減輕肝細(xì)胞壞死增加BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)不同程度的明顯降低各項(xiàng)損傷血生化指標(biāo)。血生化結(jié)果見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*ρ<0.05，**ρ<0.01，與正常組比較;#ρ<0.05，##ρ<0.01，與模型組比較。實(shí)施例3、對(duì)膽管結(jié)扎致肝外膽汁淤積作用采用膽管結(jié)扎致肝外膽汁淤積作用造模。大鼠膽總管結(jié)扎后第二天就出現(xiàn)膽汁淤積性黃疸，大鼠膽管結(jié)扎模型是常用的研究肝外淤積性黃疸的動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)方案SD大鼠32只，雌雄各半，腹腔注射劑量為400mg/kg水合氯醛麻醉沿腹白線切開(kāi)，分離總膽管，雙重結(jié)扎并從中間剪斷，其中對(duì)照組6只采用假手術(shù)方法，只分離膽管不結(jié)扎，用手術(shù)線縫合。兩天后存活24只。分為對(duì)照組、模型組、熊去氧膽酸50mg/kg灌胃治療組、秋水仙堿50和100μg/kg腹腔注射治療組。連續(xù)給藥5天，第5天禁食過(guò)夜，股動(dòng)脈取血測(cè)血生化。取肝臟用中性福爾馬林固定做病理組織切片，分別做H-E染色和免疫組化檢測(cè)BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組動(dòng)物血清ALT、AST、ALP、GGT和TBA水平顯著升高，肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)膽管增生，F(xiàn)XR、BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)降低，提示發(fā)生明顯的膽汁淤積和肝臟損傷，而秋水仙堿2個(gè)治療組均能不同程度的明顯降低各項(xiàng)損傷指標(biāo)。減輕肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)膽管增生，增加FXR、BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)，明顯降低各項(xiàng)損傷血生化指標(biāo)。血生化結(jié)果見(jiàn)下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>**p<0.01，與正常組比較;#P<0.05，##p<0.01，與模型組比較。權(quán)利要求秋水仙堿在制備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用。2.秋水仙堿在制備治療妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合癥、內(nèi)原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎重癥黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及秋水仙堿在制藥方面的應(yīng)用，特別涉及秋水仙堿在藥物治療膽汁淤積性肝病中的應(yīng)用；秋水仙堿在制備治療膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用；秋水仙堿在制備治療妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合癥、內(nèi)原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎重癥黃疸或免疫性黃疸膽汁淤積性肝病藥物中的應(yīng)用；秋水仙堿能有效降低膽汁淤積性肝病引起的肝損傷及膽汁淤積，即可以有效地治療膽汁淤積性肝病；秋水仙堿能有效減輕膽汁淤積導(dǎo)致的肝細(xì)胞壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和毛細(xì)膽管增生；秋水仙堿能有效增加膽管中膽汁酸、膽紅素和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、MRP2和MDR3的表達(dá)，促進(jìn)體內(nèi)淤積的膽汁酸、膽紅素和磷脂的排泄，減少肝損傷。文檔編號(hào)A61K31/165GK101822659SQ20101016855公開(kāi)日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年5月11日優(yōu)先權(quán)日2010年5月11日發(fā)明者周植星,尚靖,張陸勇,江振洲,王濤申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)